Regulação epigenética da Cardiac diferenciação de células estaminais embrionárias e Tecidos

O objetivo geral de aplicar essas abordagens de imunoprecipitação de cromatina a células-tronco embrionárias em diferenciação ou tecidos embrionários cardíacos é descobrir a regulação epigenética do desenvolvimento cardíaco. Uma vez que o ajuste fino da transcrição gênica durante o desenvolvimento embrionário do coração é regulado por componentes epigenéticos, a imunoprecipitação de cromatina é uma abordagem adequada para compreender esse processo.

A principal vantagem desta técnica é que podemos direcionar especificamente um locus e analisar as marcas epigenéticas presentes nesse segmento específico de DNA. Este método pode fornecer informações sobre a regulação epigenética do desenvolvimento cardíaco. Também pode ser aplicado a outros órgãos ou a qualquer tipo celular.

Esta é Imen. Ela é estudante de doutorado no laboratório e realizará o experimento hoje. Este procedimento utiliza células-tronco embrionárias ou células ES.

Corpos embrioides gerados a partir de células ES e tecidos cardíacos embrionários dissecados de embriões de camundongo E9,5. Fixe as células e os tecidos. Utilize formaldeído 1% em PBS para as células e tampão de permeabilização PB2 para os tecidos embrionários.

Coloque os tubos em um agitador orbital a uma velocidade de 60 RPM, em temperatura ambiente, por exatamente 10 minutos. Interrompa a reação de reticulação adicionando glicina até uma concentração final de 125 milimolar e incube por cinco minutos em temperatura ambiente no agitador orbital a uma velocidade de 60 RPM. Para iniciar este procedimento, reconstitua o precipitado em 10 mililitros de PBS.

E os tecidos embrionários em um mililitro de PB2. Centrifugue a 1000 × g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenatante e adicione o tampão respectivo para uma segunda lavagem.

Adicione inibidores de protease aos tampões PB1 e PB2 em gelo. Adicione um mililitro do tampão PB1 suplementado com inibidores de protease ao pellet celular e pipete para cima e para baixo para ressuspender as células. Da mesma forma, ressuspender os tecidos embrionários em um mililitro de tampão PB2 suplementado com inibidores de protease.

Em seguida, utilize uma seringa de um mililitro com agulha de 21 graus para homogeneizar as células ou tecidos. Transfira a suspensão celular para um tubo limpo de 1,5 mililitro. Incube as células e tecidos homogeneizados a quatro graus Celsius por 10 minutos.

Centrifugar a 3000 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Descartar o sobrenadante e ressuspender cada pellet em 300 microlitros do respectivo tampão de sonicação, suplementado com inibidores de protease. Transferir a suspensão celular para um tubo certificado livre de RNase, DNase e pirogênio para prevenir qualquer degradação do DNA e incubá-lo por 15 a 30 minutos em gelo.

Para fragmentar a cromatina, sonique as amostras a quatro graus Celsius utilizando o programa de sonicação apropriado para cada material. Ajuste a duração da sonicação dependendo se o DNA será usado para PCR ou sequenciamento. Em seguida, centrifugue os lisados celulares sonicados por 10 minutos.

Transfira o sobrenatante, que é a cromatina em solução, de cada amostra para um tubo limpo de 1,5 mililitro e descarte o precipitado. Retire uma alíquota de 1,5 microlitro de cada amostra e dilua-a 1:10 com água. Determine a densidade óptica de todas as amostras em um espectrofotômetro nano para determinar a concentração de proteína.

Antes da imunoprecipitação de cromatina, prepare as microesferas conjugadas com proteína A lavando-as conforme descrito no texto do protocolo. Em um tubo limpo de 1,5 mililitro, combine o anticorpo produzido contra histonas modificadas ou fatores de transcrição, 20 microlitros das microesferas conjugadas com proteína A lavadas e um mililitro do tampão C suplementado com inibidores de protease. Incube as amostras em agitador rotativo a 40 RPM por pelo menos duas horas a quatro graus Celsius.

Lave os complexos de anticorpo-acrílico três vezes com um mililitro de tampão C conforme descrito no texto do protocolo. Prepare dois tubos, um contendo 150 microgramas de cromatina e complexos de anticorpo-acrílico e o outro contendo 150 microgramas de cromatina e 20 microlitros de acrílicos lavados. Adicione um mililitro de tampão C suplementado com inibidores de protease a cada tubo e incube as amostras em rotação a 40 RPM durante a noite a quatro graus Celsius.

Quando a imunoprecipitação noturna estiver concluída, coloque as amostras no suporte magnético e recupere o sobrenadante contendo o anticorpo cromatina não ligado. Elua a proteína ligada ao anticorpo adicionando 150 microlitros do tampão D1 aos materiais lavados. Incube as amostras por 20 minutos a 50 graus Celsius em um bloco de aquecimento.

Após 20 minutos, remova as amostras do bloco de aquecimento e coloque-as na grade magnética. Recupere o sobrenadante em um tubo limpo de 1,5 mililitro e descarte as microesferas. Para reverter a ligação cruzada, adicione cloreto de sódio 5 molar ao sobrenadante para obter uma concentração final de 200 milimolar.

Prepare uma amostra de entrada de cromatina em um tubo limpo de 1,5 mililitro. Use a mesma quantidade de cromatina da amostra de imunoprecipitação, em um volume final de 150 microlitros de água livre de RNase e DNase, e cloreto de sódio 5 molar até uma concentração final de 200 milimolar. Incube as amostras durante a noite a 65 graus Celsius.

No dia seguinte, retire as amostras do bloco de aquecimento. Adicione EDTA até uma concentração final de 12,5 milimolar e Proteinase K até uma concentração final de 250 microgramas por mililitro e faça a digestão a 55 graus Celsius por duas horas. Inicie este procedimento preparando as esferas.

Primeiro, deixe as esferas em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos. Em seguida, vortexe as esferas completamente e pipete rapidamente um mililitro de esferas para um tubo limpo de 1,5 mililitro. Coloque o tubo com as esferas no ímã por dois a três minutos para que a solução fique clara e descarte o sobrenadante.

Retire o tubo do ímã. Adicione um mililitro de EDTA 0,5 molar e misture com breve vortex. Lave as microesferas duas vezes desta maneira e descarte o sobrenadante após a lavagem final.

Retire o tubo do ímã. Adicione um mililitro do tampão E e ressuspenda lentamente as microesferas. Transfira toda a mistura para 50 mililitros do tampão E. Coloque em um agitador e deixe misturar lentamente à temperatura ambiente por uma hora.

Posteriormente, teste as microesferas de ligação ao DNA utilizando um marcador de DNA de um KB e três proporções diferentes de volume de microesferas em relação ao volume de DNA. A proporção 2,5/1 mostrou-se a mais eficaz para a ligação ao DNA. Para utilizar as microesferas na purificação de DNA, adicione 425 microlitros ou 2,5 volumes das microesferas a cada amostra de DNA e re-suspenda lentamente pipetando para cima e para baixo cerca de 10 vezes.

Incube à temperatura ambiente por 10 minutos. Coloque no ímã por cinco minutos. Em seguida, aspire e descarte o sobrenadante.

Lave duas vezes com etanol 80% recém-preparado, adicionando 600 microlitros a cada tubo. Aguarde um minuto, em seguida aspire e descarte o sobrenadante. Gire os tubos rapidamente por alguns segundos.

Coloque os tubos no ímã. Remova as últimas gotas de etanol e deixe secar por um minuto à temperatura ambiente. Retire a amostra do ímã e elua o DNA adicionando 20 microlitros de água livre de DNase e RNase. Vortex.

A eletroforese em gel de agarose revelou os tamanhos dos fragmentos de DNA obtidos após a descrosslinkagem reversa do DNA sonicado total extraído de células-tronco embrionárias de camundongo, corpos embrioides e tecido cardíaco embrionário. Um experimento de imunoprecipitação de cromatina foi planejado para analisar a regulação epigenética dos genes envolvidos na transição epitélio-mesenquimal em células selvagens ou geneticamente mutadas, quando as células-tronco embrionárias se diferenciam em direção a um destino celular mesodérmico. A ligação de histonas modificadas foi monitorada por PCR dos promotores ou enhancers dos genes E-Caderina e Twist.

Realizou-se imunoprecipitação de cromatina sequencial em cromatina extraída de quatro linhagens de células-tronco embrionárias humanas utilizando anticorpos contra uma marcação de ativação da cromatina, seguida por anticorpos contra uma marcação de repressão. Essas marcações são modificadas quando as células são expostas a morfógenos, mas são variáveis dependendo das linhagens de células-tronco embrionárias humanas, provavelmente devido aos blastocistos originais dos quais são derivadas.

A imunoprecipitação de cromatina também pode ser aplicada à cromatina extraída de regiões cardíacas embrionárias específicas. Esta figura mostra regiões genômicas dos genes cardíacos Nkx2.5 e TBx5 enriquecidas com a histona modificada e uma região genômica do gene específico do marcapasso Shox2, não enriquecida e não expressa no ventrículo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três horas, se for executada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de avaliar a eficiência da sonicação antes de iniciar o protocolo de IP. Após este procedimento, outros métodos, como o Eth-ek-se-ek, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como investigar o estado antigo da cromatina, se aberto ou fechado, ou monitorar o espaçamento dos nucleossomos. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de epigenética explorarem qualquer regulação epigenética nas decisões de destino celular em qualquer tipo celular ou órgão embrionário.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como os ensaios de imunoprecipitação da cromatina podem ser realizados.