Name: Regulação epigenética da Cardiac diferenciação de células estaminais embrionárias e Tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: Aprenda a regulação epigenética do desenvolvimento cardíaco usando ensaios de imunoprecipitação de cromatina em células-tronco embrionárias. Este método permite analisar marcas epigenéticas específicas em loci de DNA.

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Os autores agradecem às agências de financiamento, ao programa comunitário europeu IMI StemBANCC, à Fundação leducq (SHAPEHEART) e à Agence Nationale de la Recherche (Genopath)

1. ADN-proteína de reticulação <ol><li> Fixam em 15 ml tubos de células-ES colhidas (2 x 10 6 células para Chip regulares, 2 x 10 5 células para Microchip), corpos embrióides (EBS) gerados a partir de células-tronco embrionárias e tecidos cardíacos embrionárias dissecados de embriões de rato E9.5 (atrioventricular canal, via de saída e ventrículo), utilizando 1% de formaldeído em PBS para as células ou em tampão PB2 permeabilização de tecidos embrionários. Colocar os tubos num agitador orbital a uma velocidade de 60 rpm à temperatura ambiente durante exactamente 10 min. </li><li> Parar a reacção de reticulação por adição de glicina para uma concentração final de 125 mM e incuba-se durante 5 min à temperatura ambiente no agitador orbital a uma velocidade de 60 rpm. </li></ol> 2. Lise celular e fragmentação da cromatina <ol><li> Lavar duas vezes as células com ligações cruzadas ressuspensas em 10 ml de PBS 1x ou tecidos embrionários ressuspensas em 1 ml de PB2. Centrifugar a 1.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante. &lt;/ Li&gt; <li> Adicionar inibidores da protease para tamponar PB1 ou PB2 (2 ug / mL de leupeptina, 1 ug / mL de aprotinina, e PMSF 0,1 mM) (Tabela 1). Ressuspender o sedimento celular ou de tecido embrionário a partir do passo 2.1 em 1 ml de tampão ou PB1 PB2 respectivamente. Pipeta cima e para baixo e voltar a suspender as células ou tecidos. Usando uma seringa de 1 ml com uma agulha de calibre 21 para homogeneizar células ou tecido. Incubar a 4 ° C (em uma roda) durante 10 min. </li><li> Girar a 3000 xg durante 5 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em 300 ul de tampão respectivas SB (Quadro 1) suplementado com inibidores de protease num tubo limpo (certificada RNase, DNase, e isento de pirogénios) para evitar qualquer degradação de ADN. Incubar durante 15 a 30 min em gelo. </li><li> Sonicar as amostras a 4 ° C para cortar a cromatina utilizando um sonicador de acordo com programas listados na Tabela 2 para cada material. Ajustar a duração de sonicação dependendo da próxima aplicação (&lt;em&gt; ou seja, PCR ou sequenciação). tamanho DNA cortado deve ser em torno de 500 pb para PCR e 300 pb para o sequenciamento. </li><li> Centrifugar o lisado celular sonicada durante 10 min a 6000 xg, a 4 ° C, transferir o sobrenadante (cromatina) em um tubo de 1,5 ml limpo e rejeitar o sedimento. </li><li> Dilui-se a cromatina em solução (sobrenadante tampão B) por 10 vezes com água e avaliar a densidade óptica utilizando 1,5 uL de uma nano-espectrofotómetro. Obter a concentração de proteínas em ug / ul usando a seguinte fórmula: 1,55 x OD 280-0,76 X OD 260. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Amortecedor </td><td> Utilização </td><td colspan="4"> Composição </td><td> materiais </td></tr><tr><td rowspan="2"> UMA </td><td rowspan="2"> permeabilização </td><td colspan="4"> PB1: TUBOS 5 mM pH 8; 85 mM KCl; 0,5% de NP40 </td><td> Todos </td></tr><tr><td colspan="4"> PB2: 15 mM de HEPES pH 7,6, 15 mM de NaCl, mM de MgCl2 4 mM de KCl 60, 0,5% de Triton X-100 </td><td> tecido embrionário </td></tr><tr><td rowspan="3"> B </td><td rowspan="3"> Lise / sonicação </td><td colspan="4"> SB1: 1% de SDS; EDTA 10 mM; Tris-HCl 50 mM pH 8 </td><td> ESC </td></tr><tr><td colspan="4"> SB2: 50 mM HEPES-KOH pH 7,9; 140 mm; EDTA 1 mM; 0,1% de desoxicolato; 0,1% de SDS </td><td> EBs </td></tr><tr><td colspan="4"> SB3: 15 mM de HEPES pH 7,6, 15 mM de NaCl; KCl 60 mM, EDTA 1 mM, EGTA 0,5 mM; 1% de Triton-X100, 0 0,1% de SDS, 0,5% laurilsarcosina </td><td> tecido embrionário </td></tr><tr><td> C </td><td> tampão ChIP </td><td colspan="4"> NaCl 150 mM; Tris-HCl 50 mM pH 7,5; EDTA 5 mM; 0,5% de NP40; 1% de Triton-X100. </td><td> Todos </td></tr><tr><td> D </td><td> DNA / proteína A eluição </td><td colspan="4"> D1: 1% de SDS; 100de NaHCO 3 mM D2: Tris 50 mM pH 7,6 / EDTA 5 mM, DTT 15 mM, SDS a 2% </td><td></td></tr><tr><td> E </td><td> DNA preparação esferas de ligação </td><td colspan="4"> E: 20% de PEG 8000; NaCl 2,5 M; Tris-HCl 10 mM pH 8; EDTA 1mM </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Os tampões de chip. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Material </td><td> programa de sonicação </td></tr><tr><td> Células-tronco embrionárias </td><td> 15 ciclos de 30 segundos ligado e 30 segundos OFF </td></tr><tr><td> corpos embrióides </td><td> 30 ciclos de 30 seg ON e 30 segundos OFF </td></tr><tr><td> tecidos embrionários </td><td> 21 ciclos de 30 segundos ligado e 30 segundos OFF </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Programas sonicação. 3. A imunoprecipitação eLavagens <ol><li> Lavar as pérolas A-3 vezes conjugado de proteína com tampão C. Tome 100 ul de pérolas num tubo limpo de 1,5 ml e adicionar 1 mL de tampão C (Tabela 1). O tubo é em seguida transferida para um íman; esperar durante 1 minuto e aspirar o sobrenadante. Repita duas vezes o passo de lavagem. </li><li> Incubar anticorpo criado contra histonas modificados ou factor de transcrição (as concentrações listadas na Tabela 3), com 20 ul de proteína lavado grânulos conjugados e 1 ml de tampão C suplementado com inibidores de protease em um tubo de 1,5 ml limpo. Definir as amostras num rotor a 40 rpm durante pelo menos 2 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar de anticorpo-complexos esferas 3 vezes com 1 ml de tampão C (manipulação descrito em 3.1). </li><li> Prepare a 2 tubos, um contendo 150 ^ g de complexos de cromatina e anticorpo de grânulos e o outro tubo contendo 150 ug de cromatina e 20 ul de pérolas lavadas; Adicionar 1 mL de tampão C suplementado com inibidores da protease a cada tuboe incuba-se as amostras sobre uma roda a rodar a 40 rpm, durante a noite a 4 ° C. NOTA: A concentração de cromatina deve ser de pelo menos 300 ug de imunoprecipitar um factor de transcrição ou para o chip sequencial. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Padrão </td><td> concentração (ng / mL) </td><td> Volume (uL) </td><td> Concentração total de ADN (ng) </td></tr><tr><td> UMA </td><td> 10.0 </td><td> 1 </td><td> 10.0 </td></tr><tr><td> B </td><td> 5.00 </td><td> 1 </td><td> 5.00 </td></tr><tr><td> C </td><td> 2.50 </td><td> 1 </td><td> 2.50 </td></tr><tr><td> D </td><td> 1,25 </td><td> 1 </td><td> 1,25 </td></tr><tr><td> E </td><td> 0,625 </td><td> 1 </td><td> 0,625 </td></tr><tr><td> F </td><td> 0,3125 </td><td> 1 </td><td> 00,3125 </td></tr><tr><td> G </td><td> 0,156 </td><td> 1 </td><td> 0,156 </td></tr><tr><td> H </td><td> 0.0 </td><td> 1 </td><td> 0.0 </td></tr></tbody></table> Tabela concentrações 3. Normas. 4. DNA eluição,-link Cruz Reversão e Proteinase K Digestão <ol><li> Definir as amostras na cremalheira magnética. Recuperar o sobrenadante contendo cromatina anticorpo não ligado. NOTA: As amostras pode ser rapidamente congelada em azoto líquido a essa etapa e armazenado a -80 ° C. Cromatina pode ser utilizado em outros ensaios de imunoprecipi tacão com outro anticorpo. Lava-se cada amostra de 3 vezes com 1 ml de tampão C (descrito antes) de manipulação. </li><li> Elui-se a proteína ligada ao anticorpo pela adição de 150 ul de tampão de D1 ou D2 se ChIP sequencial tem de ser feito (Tabela 1) para materiais ChIP lavadas e incubar as amostras durante 20 min a 50 ° C num bloco de aquecimento. </li><li> Retirar os tubos deo bloco de aquecimento e colocar as amostras no rack magnético, recuperar o sobrenadante em um tubo de 1,5 ml limpo (certificada RNase-, DNase e livre de pirogénios) e descartar as contas. </li><li> Use sobrenadante para um chip sequencial adicionando 1 a 3 ug do segundo anticorpo, em 2 volumes de tampão C ou reverter a reticulação por adição de NaCl 5 M para se obter uma concentração final de 200 mM. </li><li> Prepara-se uma amostra de entrada de cromatina em um tubo de 1,5 ml limpo (certificada RNase, DNase, e isento de pirogénios) tendo a mesma quantidade de cromatina que o da amostra IP (150 ug) num volume final de 150 ul de água (RNase DNase água livre). Adicionar NaCl 5M para uma concentração final de 200 mM. Incubar as amostras durante a noite a 65 ° C. </li><li> No dia seguinte, recolher amostras a partir do bloco de aquecimento, adicionar EDTA 250 mM para se obter uma concentração final de 12,5 mM e proteinase K para se obter uma concentração final de 250 ug / ml no material de aparas e digerir a 55 ° C durante 2 horas na bloco de aquecimento. </li></ol><ol><li> Preparação dos grânulos <ol><li> Comece a trazer os grânulos à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min, vortex os grânulos muito cuidadosamente. Beads se estabelecer, por isso o trabalho rápido quando pipetagem. Transferir 1 ml de contas no limpo tubo de 1,5 ml (certificado RNase-, DNase e livre de pirogénios). </li><li> Ajuste no ímã, esperar por 2-3 min para a solução de esclarecer, sobrenadante de descarte. Retire do ímã, adicionar 1 ml de EDTA 0,5 M e misture por vórtex breve. </li><li> Repetir o passo 5.1.2, duas vezes e descartar o sobrenadante no final. </li><li> Retire do ímã, adicionar 1 ml de tampão E e lentamente voltar a suspender as esferas. Transferir toda a mistura de grânulos (em tampão E) em 50 ml de tampão E. Coloque, num agitador e deixar misturar lentamente à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> grânulos de teste de ligação de ADN seguindo o protocolo de purificação descrito a seguir, utilizando condições experimentais 3: 50 ul de contas / 50 uL de ADN (1 volume / volume de 1), 100 ul de pérolas/ 50 uL de ADN (2 volumes / 1 volume) e 125 ul de contas / 50 uL de ADN (2,5 volumes / 1 em volume). Vamos migrar ADN purificado num gel de agarose a 1,5% para verificar o tamanho dos fragmentos (Figura 1A). </li></ol></li><li> purificação de DNA <ol><li> Adicionar 425 ul (2,5 volumes) de ADN de ligação esferas magnéticas para cada amostra de ADN (cerca de 170 uL). Ressuspender lentamente por pipetagem para cima e para baixo (cerca de 10 vezes) e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Coloque em ímã para 5 min, em seguida, aspirar o sobrenadante e descartar (no ímã). </li><li> Adicionar 600 mL de etanol acabado de fazer 80% ao tubo no ímã, aguarde 1 min, aspirar o sobrenadante e descartar e, em seguida, repita o passo anterior mais uma vez. </li><li> Dê um giro rápido, por 5 s (microcentrífuga), colocar o tubo no ímã e remover as últimas gotas de etanol. Deixar secar durante 1 min a RT </li><li> Elui-se o DNA pela adição de 20 ul de DNase RNase água livre. Retire do ímã e vortex a amostra. </li><li> Incuba-se durante 3 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, colocar as amostras no íman. Aspirar o DNA eluído para um novo tubo (certificada RNase, DNase, e isento de pirogénios). </li><li> Executar o ADN a partir da fracção de entrada num gel de agarose a 1,5% para verificar o tamanho dos fragmentos de DNA (Figura 1B). </li></ol></li></ol> 6. DNA quantificação utilizando um instrumento de detecção de fluorescência <ol><li> Serialmente diluídas em água 1 ug de ADN (uma escada KB) para dar um total de 7 diluições além de um ponto de não-ADN (diluições reunidos na Tabela 3). </li><li> Prepara-se uma solução de PCR Green I corante, suficiente para todas as amostras de ADN purificado (e diluições padrão AH): 10.000x diluir o corante verde em 1x tampão TE. </li><li> Adicionar 1 mL de cada amostra de DNA (DNA purificado e diluições padrão AH) a 10 ul de 1x mistura corante verde em capilares cuvetes para ser lido num fluorímetro a 488 nm de comprimento de onda. Para o ensaio não-ADN, usar 1 ul do tampão TE 1X. </li><li> Construiruma curva de calibração usando um software gráfico e determinar as concentrações relativas para a gama de amostras de ADN em ng / mL. O ADN é então pronto para PCR ou para fazer bibliotecas de sequenciação. </li></ol> 7. PCR <ol><li> Selecção dos iniciadores <ol><li> Projeto iniciadores de interesse para interrogar as regiões genômicas de interesse. Conceber iniciadores para amplificar as regiões potenciadoras de genes utilizando o navegador genoma UCSC. Potenciadores são ainda previsto usando H3K4me1 ou p300 ChIP-seq 9 dados disponíveis no conjunto de dados GEO. </li></ol></li><li> PCR <ol><li> reacções Executar PCR para 45 ciclos (8 seg 95 ° C, 8 s 60 ° C, 8 seg 72 ° C) utilizando um tempo real termociclador de PCR em 25 ul de mistura de corante verde, DNA 2 ng e 0,5 ul de mistura de iniciadores (20 solução estoque uM) 10. </li></ol></li><li> Análise de enriquecimento <ol><li> Calcular enriquecimento absoluto supondo que, no máximo, 1% de nucleossoma foram imunoprecipitados 11. </li><li> consider o genómico como enriquecida se 10 amostras IP ng mostrar um maior enriquecimento, quando comparado com 0,1 ng de ADN de entrada. </li><li> Expresso de resultados como as vezes de aumento no enriquecimento sobre uma região não enriquecido após a normalização para o ajuste de entrada e com uma amostra de controlo não específico. </li><li> Considere o ADN de entrada para ser diluído por 100 (factor de diluição ou DF). </li><li> Normalizar a entrada usando a seguinte equação 2 -ΔCt x 100%, onde -ΔCt = Ct [IP] - Ct [Entrada x DF]. </li><li> Ajuste de controlo utilizando a seguinte equação (ΔCt [PI] -ΔCt [NS]) em que NS é a amostra não-específico (sem anticorpo IP, IP ou IgG). </li><li> Calcular o enriquecimento dobra da amostra, tal como 2 -ΔΔCt. Um arquivo incluindo todas as etapas de cálculos com fórmulas em que apenas cada amostra de PCR podem ser inseridos irá facilitar a análise dos resultados. </li></ol></li></ol>

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<li>Chen, T., Dent, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifiers+and+remodellers%3A+regulators+of+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation.</a> Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Epigenética tornou-se um importante campo de pesquisa em biologia do desenvolvimento. Como um programa genético é activada em células embrionárias para permitir que as células a adquirir uma identidade específica dentro de uma linhagem embrionário tem sido por muito tempo uma questão essencial para biólogos do desenvolvimento. Chip tem sido amplamente utilizada nos últimos anos e combinados para sequenciamento de DNA seguinte melhoria na resolução de sequenciamento. Isto tornou-se uma técnic...

<html> O coração é o primeiro órgão a ser formada e para se tornar funcional no embrião. O coração é construído a partir de muitas linhagens de células que surgem a partir dos primeiro e segundo campos cardíaco embrionário 1. A partir do blastocisto pós-fertilização organizar-se para o coração em forma, as células embrionárias têm, assim que tomar muitas decisões destino celular. Gene transcrição é regulada de forma tempo e dependente do espaço e é um processo biológico fundamental que está subjacente a decisão destino celular durante o desenvolvimento embrionário. Um tal processo é mediada por factores de transcrição específicos que se ligam a regiões reguladoras dentro do genoma incluindo intensificadores e promotores de genes constitutivos cardíacas. ADN é envolvida em torno de histonas, que são sujeitos a modificações tais como acetilação, metilação, ubiquitinação, e / ou fosforilação. Histona modificação conduz a transcrição do gene reprimida, activado ou preparada dependendo de qual o resíduo de lisina de histona é modificado 2. jove_content &quot;&gt; ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP), foi criado anos atrás 3 e é atualmente a tecnologia mais amplamente utilizada, a fim de identificar alvos, tanto de histonas modificadas ou fatores de transcrição 4. Após imunoprecipitação de histonas ou fatores de transcrição, o DNA ligado pode ser quer amplificado por reacção em cadeia da polimerase (PCR) ou sequenciados. chip tem tecnicamente superar mais desafiantes ensaios de retardamento em gel 5. no entanto chip não implica a ligação directa de um factor de transcrição de ADN, uma vantagem do ensaio de retardamento em gel. por outro lado, Chip combinados para sequenciamento de DNA, abriu uma nova perspectiva de todo o genoma na regulação dos genes. Células-tronco embrionárias (células ES) recapitular dentro de corpos embrióides (ie., Agregados celulares) ou em cultura 2D os primeiros passos de desenvolvimento cardíaco 6 e fornecer material suficiente em princípio para o chip. Além disso, as células embrionárias humanas representam um modelo celular humano da cardiogenesis embora o seu potencial cardiogênico depende da sua assinatura epigenética 7. Em fases posteriores do desenvolvimento, rato tecidos embrionários permitir investigar paisagens epigenéticas específicas necessárias para a determinação da identidade da célula. No entanto, o genoma é transcrita em um tempo e modo específico de células do tipo 8. regulação epigenética da transcrição de genes tem que ser estudado dentro de regiões localizadas. Descrevemos os protocolos de Chip, ChIP sequencial seguido por PCR ou sequenciação usando células ES, corpos embrióides e regiões embrionárias específicas cardíacas. Estes protocolos permitem a investigar a regulação epigenética da transcrição de genes cardíaca.

<table><tbody><tr><td>Formaldeído&nbsp;</td><td>Fixação de Célula</td> <td>Sigma</td><td>F8775</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>Parada de reticulação</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Fluka</td><td>10820</td><td>Inibidor de proteases</td></tr><tr><td>Hemissulfato de leupeptina</td><td>Sigma</td><td>L2882</td><td>Inibidor de proteases</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Inibidor de proteases</td></tr><tr><td>Proteína A contas magnéticas&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>10001D</td><td>Imunoprecipitação</td></tr><tr><td>SPRI contas magnéticas</td><td>Thermo Scientific</td><td>15002-01</td><td>Purificação de DNA</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Life technologies</td><td>25530-015</td><td>Digestão de proteínas&nbsp;</td></tr><tr><td>Padrão DNA BR&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>Q32850</td><td>Faixa de calibração&nbsp;</td></tr><tr><td>Sondas Moleculares</td> <td>Syber green</td><td>S-11484</td><td>Quantificação de DNA</td></tr><tr><td>TE tampão&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>Quantificação de DNA</td></tr><tr><td>PBX 1x</td><td>Life technologies</td><td>14190-094</td><td>Lavagem</td></tr><tr><td>DNase Água livre de RNase</td><td>Life technologies</td><td>10977-035</td><td>Diluição</td></tr><tr><td>Tubo Axygen</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td>ChIP purificção</td></tr><tr><td><forte>Anticorpo&nbsp; </td><td>Company</td><td>Reference</td><td>ChIP concentration</td></tr><tr><td>H3K27ac</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td>3 &micro; g para ESC e EBs, 1 &micro; g para tecidos</td></tr><tr><td>H3K4me1</td><td>Diagenode</td><td>C15410194 (pAb-194-050)</td><td>3 &micro; g para ESC e EBs, 1 &micro; g para tecidos</td></tr><tr><td>H3K36me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410058 (pAb-058-050)</td><td>3 &micro; g para ESC e EBs, 1 &micro; g para tecidos</td></tr><tr><td>H3K9me2</td><td>Diagenode</td><td>C15410060 (pAb-060-050)</td><td>3 &micro; g para ESC e EBs, 1 &micro; g para tecidos</td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410030 (pAb-030-050)</td><td>3 &micro; g para ESC e EBs, 1 &micro; g para tecidos</td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410069 (pAb-069-050)</td><td>3 &micro; g para ESC e EBs, 1 &micro; g para lenços de papel</td></tr></tbody></table>

regulação epigenética da cardiac diferenciação de células estaminais embrionárias e tecidos

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

a transcrição do gene específico é um processo biológico fundamental que está subjacente a decisão destino celular durante o desenvolvimento embrionário. O processo biológico é mediada por factores de transcrição que se ligam a regiões reguladoras genómicas incluindo intensificadores e promotores de genes constitutivos cardíacas. ADN é envolvido em torno histonas que são sujeitas a modificações químicas. Modificações das histonas ainda levar a transcrição de genes reprimida, activado ou equilibrado, trazendo assim mais um nível de regulamentação sintonia fina da transcrição de genes. As células-tronco embrionárias (células ES) recapitular dentro de corpos embrióides (ou seja, agregados celulares) ou em cultura 2D os primeiros passos de desenvolvimento cardíaco. Eles fornecem material suficiente em princípio para imunoprecipitação da cromatina (ChIP), uma tecnologia amplamente utilizada para identificar regiões reguladoras de genes. Além disso, as células embrionárias humanas representam um modelo celular humano de cardiogenesis. Em fases posteriores do desenvolvimento, rato tecidos embrionários permitirinvestigando paisagens epigenéticas específicas necessárias para a determinação da identidade da célula. Descrevemos os protocolos de Chip, ChIP sequencial seguido por PCR ou chip-sequenciação usando células ES, corpos embrióides e regiões embrionárias específicas cardíacas. Estes protocolos permitem a investigar a regulação epigenética da transcrição de genes cardíaca.

A Figura 1A ilustra a preparação em primeiro lugar de grânulos de ligação de ADN e de controlo de qualidade utilizando ADN de tamanhos diferentes (escada de 1 kb). 0ne, 2 e 2,5 volumes (1 a 3) de grânulos foi adicionada a um volume de amostra a purificar fragmentos de DNA de alto e baixo peso molecular. As Figuras 1 B, C, D são exemplos típicos de géis de DNA a partir de DNA sonicado todo extr...

Um regulamento ajuste fino da transcrição do gene subjacente a decisão destino da célula embrionária. Aqui, descrevemos ensaios de imunoprecipitação de cromatina utilizados para investigar regulação epigenética de ambos diferenciação cardíaca de células estaminais e desenvolvimento cardíaco de embriões de camundongos.

Regulação epigenética da Cardiac diferenciação de células estaminais embrionárias e Tecidos

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

O objetivo geral de aplicar essas abordagens de imunoprecipitação de cromatina a células-tronco embrionárias em diferenciação ou tecidos embrionários cardíacos é descobrir a regulação epigenética do desenvolvimento cardíaco. Uma vez que o ajuste fino da transcrição gênica durante o desenvolvimento embrionário do coração é regulado por componentes epigenéticos, a imunoprecipitação de cromatina é uma abordagem adequada para compreender esse processo.A principal vantagem desta técnica é que podemos direcionar especificamente um locus e analisar as marcas epigenéticas presentes nesse segmento específico de DNA. Este método pode fornecer informações sobre a regulação epigenética do desenvolvimento cardíaco. Também pode ser aplicado a outros órgãos ou a qualquer tipo celular.Esta é Imen. Ela é estudante de doutorado no laboratório e realizará o experimento hoje. Este procedimento utiliza células-tronco embrionárias ou células ES.Corpos embrioides gerados a partir de células ES e tecidos cardíacos embrionários dissecados de embriões de camundongo E9,5. Fixe as células e os tecidos. Utilize formaldeído 1% em PBS para as células e tampão de permeabilização PB2 para os tecidos embrionários.Coloque os tubos em um agitador orbital a uma velocidade de 60 RPM, em temperatura ambiente, por exatamente 10 minutos. Interrompa a reação de reticulação adicionando glicina até uma concentração final de 125 milimolar e incube por cinco minutos em temperatura ambiente no agitador orbital a uma velocidade de 60 RPM. Para iniciar este procedimento, reconstitua o precipitado em 10 mililitros de PBS.E os tecidos embrionários em um mililitro de PB2. Centrifugue a 1000 × g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenatante e adicione o tampão respectivo para uma segunda lavagem.Adicione inibidores de protease aos tampões PB1 e PB2 em gelo. Adicione um mililitro do tampão PB1 suplementado com inibidores de protease ao pellet celular e pipete para cima e para baixo para ressuspender as células. Da mesma forma, ressuspender os tecidos embrionários em um mililitro de tampão PB2 suplementado com inibidores de protease.Em seguida, utilize uma seringa de um mililitro com agulha de 21 graus para homogeneizar as células ou tecidos. Transfira a suspensão celular para um tubo limpo de 1,5 mililitro. Incube as células e tecidos homogeneizados a quatro graus Celsius por 10 minutos.Centrifugar a 3000 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Descartar o sobrenadante e ressuspender cada pellet em 300 microlitros do respectivo tampão de sonicação, suplementado com inibidores de protease. Transferir a suspensão celular para um tubo certificado livre de RNase, DNase e pirogênio para prevenir qualquer degradação do DNA e incubá-lo por 15 a 30 minutos em gelo.Para fragmentar a cromatina, sonique as amostras a quatro graus Celsius utilizando o programa de sonicação apropriado para cada material. Ajuste a duração da sonicação dependendo se o DNA será usado para PCR ou sequenciamento. Em seguida, centrifugue os lisados celulares sonicados por 10 minutos.Transfira o sobrenatante, que é a cromatina em solução, de cada amostra para um tubo limpo de 1,5 mililitro e descarte o precipitado. Retire uma alíquota de 1,5 microlitro de cada amostra e dilua-a 1:10 com água. Determine a densidade óptica de todas as amostras em um espectrofotômetro nano para determinar a concentração de proteína.Antes da imunoprecipitação de cromatina, prepare as microesferas conjugadas com proteína A lavando-as conforme descrito no texto do protocolo. Em um tubo limpo de 1,5 mililitro, combine o anticorpo produzido contra histonas modificadas ou fatores de transcrição, 20 microlitros das microesferas conjugadas com proteína A lavadas e um mililitro do tampão C suplementado com inibidores de protease. Incube as amostras em agitador rotativo a 40 RPM por pelo menos duas horas a quatro graus Celsius.Lave os complexos de anticorpo-acrílico três vezes com um mililitro de tampão C conforme descrito no texto do protocolo. Prepare dois tubos, um contendo 150 microgramas de cromatina e complexos de anticorpo-acrílico e o outro contendo 150 microgramas de cromatina e 20 microlitros de acrílicos lavados. Adicione um mililitro de tampão C suplementado com inibidores de protease a cada tubo e incube as amostras em rotação a 40 RPM durante a noite a quatro graus Celsius.Quando a imunoprecipitação noturna estiver concluída, coloque as amostras no suporte magnético e recupere o sobrenadante contendo o anticorpo cromatina não ligado. Elua a proteína ligada ao anticorpo adicionando 150 microlitros do tampão D1 aos materiais lavados. Incube as amostras por 20 minutos a 50 graus Celsius em um bloco de aquecimento.Após 20 minutos, remova as amostras do bloco de aquecimento e coloque-as na grade magnética. Recupere o sobrenadante em um tubo limpo de 1,5 mililitro e descarte as microesferas. Para reverter a ligação cruzada, adicione cloreto de sódio 5 molar ao sobrenadante para obter uma concentração final de 200 milimolar.Prepare uma amostra de entrada de cromatina em um tubo limpo de 1,5 mililitro. Use a mesma quantidade de cromatina da amostra de imunoprecipitação, em um volume final de 150 microlitros de água livre de RNase e DNase, e cloreto de sódio 5 molar até uma concentração final de 200 milimolar. Incube as amostras durante a noite a 65 graus Celsius.No dia seguinte, retire as amostras do bloco de aquecimento. Adicione EDTA até uma concentração final de 12,5 milimolar e Proteinase K até uma concentração final de 250 microgramas por mililitro e faça a digestão a 55 graus Celsius por duas horas. Inicie este procedimento preparando as esferas.Primeiro, deixe as esferas em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos. Em seguida, vortexe as esferas completamente e pipete rapidamente um mililitro de esferas para um tubo limpo de 1,5 mililitro. Coloque o tubo com as esferas no ímã por dois a três minutos para que a solução fique clara e descarte o sobrenadante.Retire o tubo do ímã. Adicione um mililitro de EDTA 0,5 molar e misture com breve vortex. Lave as microesferas duas vezes desta maneira e descarte o sobrenadante após a lavagem final.Retire o tubo do ímã. Adicione um mililitro do tampão E e ressuspenda lentamente as microesferas. Transfira toda a mistura para 50 mililitros do tampão E. Coloque em um agitador e deixe misturar lentamente à temperatura ambiente por uma hora.Posteriormente, teste as microesferas de ligação ao DNA utilizando um marcador de DNA de um KB e três proporções diferentes de volume de microesferas em relação ao volume de DNA. A proporção 2,5/1 mostrou-se a mais eficaz para a ligação ao DNA. Para utilizar as microesferas na purificação de DNA, adicione 425 microlitros ou 2,5 volumes das microesferas a cada amostra de DNA e re-suspenda lentamente pipetando para cima e para baixo cerca de 10 vezes.Incube à temperatura ambiente por 10 minutos. Coloque no ímã por cinco minutos. Em seguida, aspire e descarte o sobrenadante.Lave duas vezes com etanol 80% recém-preparado, adicionando 600 microlitros a cada tubo. Aguarde um minuto, em seguida aspire e descarte o sobrenadante. Gire os tubos rapidamente por alguns segundos.Coloque os tubos no ímã. Remova as últimas gotas de etanol e deixe secar por um minuto à temperatura ambiente. Retire a amostra do ímã e elua o DNA adicionando 20 microlitros de água livre de DNase e RNase. Vortex.A eletroforese em gel de agarose revelou os tamanhos dos fragmentos de DNA obtidos após a descrosslinkagem reversa do DNA sonicado total extraído de células-tronco embrionárias de camundongo, corpos embrioides e tecido cardíaco embrionário. Um experimento de imunoprecipitação de cromatina foi planejado para analisar a regulação epigenética dos genes envolvidos na transição epitélio-mesenquimal em células selvagens ou geneticamente mutadas, quando as células-tronco embrionárias se diferenciam em direção a um destino celular mesodérmico. A ligação de histonas modificadas foi monitorada por PCR dos promotores ou enhancers dos genes E-Caderina e Twist.Realizou-se imunoprecipitação de cromatina sequencial em cromatina extraída de quatro linhagens de células-tronco embrionárias humanas utilizando anticorpos contra uma marcação de ativação da cromatina, seguida por anticorpos contra uma marcação de repressão. Essas marcações são modificadas quando as células são expostas a morfógenos, mas são variáveis dependendo das linhagens de células-tronco embrionárias humanas, provavelmente devido aos blastocistos originais dos quais são derivadas.A imunoprecipitação de cromatina também pode ser aplicada à cromatina extraída de regiões cardíacas embrionárias específicas. Esta figura mostra regiões genômicas dos genes cardíacos Nkx2.5 e TBx5 enriquecidas com a histona modificada e uma região genômica do gene específico do marcapasso Shox2, não enriquecida e não expressa no ventrículo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três horas, se for executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de avaliar a eficiência da sonicação antes de iniciar o protocolo de IP. Após este procedimento, outros métodos, como o Eth-ek-se-ek, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como investigar o estado antigo da cromatina, se aberto ou fechado, ou monitorar o espaçamento dos nucleossomos. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de epigenética explorarem qualquer regulação epigenética nas decisões de destino celular em qualquer tipo celular ou órgão embrionário.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como os ensaios de imunoprecipitação da cromatina podem ser realizados.

epigenetic-regulation-cardiac-differentiation-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Nós descrevemos o uso de um ensaio de células de rato ES base para identificar janelas de tempo crítico para Wnt / β-catenina e ativação do sinal BMP durante a indução cardiogênico. O método fornece uma plataforma padronizada, que quantifica a eficiência confiável cardiogênico, e é aplicável ao estudo de linhagens de célula.

Modificado embrionárias de camundongos com células-tronco Ensaio baseado para quantificar a eficiência de indução cardiogênico

Nós estabelecemos um protocolo para indução de cardioblasts direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores cardíaca e funcional cardiovascular cardiomiócitos para reparação.

Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

Células-tronco pluripotentes, tanto as células-tronco embrionárias ou pluripotentes induzidas (iPS), constituem uma valiosa fonte de células diferenciadas humanos, incluindo os cardiomiócitos. Aqui, vamos nos concentrar na indução cardíaco de células iPS, mostrando como usá-los para obter os cardiomiócitos humanos funcionais através de um protocolo de corpos baseada embryoid.

Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

O artigo descreve a metodologia detalhada para diferenciar de forma eficiente as células estaminais pluripotentes em cardiomiócitos de modular selectivamente a via Wnt, seguido por análise de citometria de fluxo de marcadores de referência para avaliar a homogeneidade e a identidade da população.

Diferenciação de alta eficiência de pluripotentes humanas células-tronco para Cardiomyocytes e Caracterização por citometria de fluxo

Neste protocolo, será ilustrada a derivação de células progenitoras cardíacas de células-tronco embrionárias de camundongos e humanos. Uma estratégia importante neste protocolo é enriquecer as células progenitoras cardíacas com citometria de fluxo usando repórteres fluorescentes projetados nas linhagens de células-tronco embrionárias.

Derivação de Cardiac células progenitoras de células estaminais embrionárias

A geração de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes in vitro permite o acesso a grandes quantidades de tecido cardíaco in vitro para ciência básica e aplicações clínicas.  Este protocolo utiliza o fator atrializante Grem2 tanto para aumentar o número de cardiomiócitos obtidos quanto para gerar cardiomiócitos com fenótipo atrial.

Diferenciação de Atrial Cardiomyocytes de células-tronco pluripotentes Usando o BMP Antagonista Grem2

Este protocolo descreve um método passo a passo para o isolamento reprodutível e cultura de longo prazo de cardiomiócitos de camundongos adultos com alto rendimento, pureza e viabilidade.

Isolamento, cultura e Transdução de rato adulto Cardiomyocytes

Este manuscrito descreve um protocolo passo a passo para a geração e quantificação de diversos subtipos cardíacos reprogramados usando uma entrega mediada por retrovírus de Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5.

Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos

Aqui, apresentamos um método para eficientemente aproveitar o potencial de diferenciação cardíaca da jovens fontes de células-tronco mesenquimais humanas a fim de gerar células funcionais, contratantes, casos, como in vitro.

In Vitro Diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas em células casos funcionais

Aqui nós descrevemos um método dimensionável, usando uma simples combinação de Activin A e mediada por lentivirus Id1-superexpressão, para gerar a primeiras progenitores cardíaca como campo de coração e cardiomyocytes ventricular, como de células estaminais pluripotentes humanas.

Geração do primeiro coração campo-como progenitores cardíaca e Cardiomyocytes Ventricular, como de células-tronco pluripotentes humanas

Aprenda a regulação epigenética do desenvolvimento cardíaco usando ensaios de imunoprecipitação de cromatina em células-tronco embrionárias. Este método permite analisar marcas epigenéticas específicas em loci de DNA.

Regulação epigenética da Cardiac diferenciação de células estaminais embrionárias e Tecidos

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