Name: Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprenda a isolar células individuais de embriões de zebrafish e analisar a expressão gênica usando sistemas microfluídicos. Este método revela heterogeneidade celular oculta em técnicas convencionais baseadas em populações.

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Agradecemos ao Dr. C. Geoffrey Burns pelo estoque de peixes. Os autores são gratos ao UNC Flow Cytometry Core Facility, ao núcleo UNC-CGIBD AAC pelos recursos que permitiram este projeto e à instalação ZAC para cuidados com os animais. L.S. é apoiado pela concessão NIH T32 HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. é apoiado pela Bolsa de Pesquisa de Pós-Graduação da NSF NSF-DGE-1144081. Este estudo foi apoiado pela bolsa P30DK034987 do NIH (para UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 e Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (para o Dr. Qian) e NIH R00 HL109079 grant (para o Dr. Liu).

Este protocolo requer o uso de ao vivo, peixe-zebra adulto para produzir embriões. Os embriões são colhidos para a recolha de tecido. É essencial para obter a aprovação de ética apropriadas conselhos de revisão para realizar esta experiência. 1. Obter Embriões Staged <ol><li> Um dia antes do experimento, preparar saudável, peixe-zebra adulto para reprodução. Coloque um macho e uma fêmea em lados opostos de uma divisória clara em um tanque de criação. </li><li> Repetir para 1,1 como muitos tanques de criação como necessários para a produção de embrião suficiente para a aplicação a jusante. Obter embriões de ambos os tipos de peixe selvagem e peixes transgénicos que expressam proteínas fluorescentes no tipo de célula de interesse. NOTA: O número de embriões necessários para aplicações a jusante nos Passos 2-8 depende da abundância relativa das células de interesse no ponto de tempo de interesse. Embora isso possa variar conforme o tipo de célula, 200 embriões produzir 2.000-5.000 células ordenadas quando o cells de interesse representam &lt;1,0% do total de células em 24 hpf (horas após a fecundação). </li><li> Na manhã seguinte, mudar a água no tanque de cobertura com pão ralado, transferindo peixe para um tanque de criação fresco e eliminar o divisor. Inclinação do tanque a um ângulo para promover o acasalamento. </li><li> Coletar embriões encenadas. <ol><li> A cada 15 minutos, recolher embriões transferindo os adultos a um tanque de criação fresca e passar os ovos que são deixados para trás através de um coador de chá. NOTA: embriões Zebrafish desenvolver de forma síncrona quando mantidas em densidades e temperaturas comparáveis. </li><li> Lavar os ovos com o ovo de água (0,21 g / L sais Instant Ocean em 1 L de água destilada duas vezes) e transferir para um prato de petri. Transferir a placa de Petri para um incubador húmido a 28,5 ° C com circulação de ar. </li></ol></li><li> Duas horas após a última coleção, espécie fertilizados, embriões multicelulares em 10 cm placas de Petri e reduzir a densidade de 50 embriões por prato. Selecionar embriões de uma única, 15janela de tempo min de coleta para aplicação a jusante. Incubar em embriões de 28,5 ° C. NOTA: Por exemplo, recolher embriões às 8:30, 08:45, 09:00, 09:15, 09:30, 09:45, 10:00 e 10:15. Comparando através pontos de tempo, se o maior número de embriões fertilizados são das garras recolhidas às 9:00, em seguida, usar apenas estes embriões para aplicações a jusante. </li></ol> 2. Configurar para a dissociação única célula <ol><li> Cerca de 30 minutos antes do ponto de tempo de interesse (18 hpf) remover embriões a partir de sua córion manualmente com uma pinça fina. </li><li> Recolha e rotular o seguinte para cada condição: dois 2 ml microtubos, um filtro de 40 um celular, um prato de cultura de células de 35 mm, e dois tubos de FACS coberto com um filtro de células 35 ^ m. </li><li> Relaxar os seguintes reagentes no gelo: Ovo de água contendo 0,21 g / L sais Instant Ocean em 1L de água bidestilada; De yolking-tampão E contendo NaCl 55 mM, KCl 1,8 mM, e 1,25 mM de NaHCO 3; e FACS buffer contendo de Leibovitz L-15 meios suplementados com soro fetal de bovino inactivado pelo calor a 5%. </li><li> Traga 1 ml por amostra de celular dissociação Reagente 1 a RT. Thaw 1 ml celular dissociação Reagente 2 por amostra em gelo. Trazer para RT imediatamente antes da utilização. </li></ol> 3. A dissociação celular standard <ol><li> Usando uma pipeta de orifício larga de vidro, 100-300 embriões transferir para um tubo de centrífuga de 2 ml de micro num volume mínimo de água do ovo. </li><li> Eutanásia embriões através da substituição da água com 1 ml de gelo-água fria ovo e submergindo tubo em gelo durante 20 min. CUIDADO! É crítico para obter a aprovação de um comitê institucional adequada supervisão cuidados com animais para este método de eutanásia (refrigeração em gelo seguido de dissociação celular como a eutanásia secundário). eutanásia padrão normalmente requer que os embriões &lt;3 dias pós-fertilização são branqueadas depois de serem arrefecidas, o que não é adequado para a obtenção de células viáveis. </li><li> Lavar os embriões duas vezes com 1 ml de gelo-água fria ovo. Para lavar, use uma ampla pipeta furo de vidro para remover Egg água e uma P1000 para adicionar Egg água. </li><li> Remover a gema, substituindo a água embrião com 1 ml de tampão Deyolking e triturando 8-12 vezes com uma ponta de P1000, ou até que a gema é dissolvido e apenas os corpos dos embriões são visíveis. </li><li> Recolhe-se o tecido por centrifugação a 300 xg durante 1 min. Usar uma pipeta para remover suavemente o sobrenadante sem perturbar o pelete de tecido. Re-suspender em 1 ml de água Egg. </li><li> Repetir o passo 3.5 para um total de três lavagens, mas na lavagem final, re-suspender em 1 mL de RT dissociação celular Reagente 1. </li><li> Incubar em dissociação celular Reagente 1 durante 10 min à temperatura ambiente com os tubos dispostos horizontalmente. Cada 2-3 minutos, tritura-se suavemente com uma pipeta P1000 para evitar aglomeração. NOTA: Punho amostras suavemente durante as etapas de trituração. Em algum momento um único grande grupo, irá formar no tubo a partir de um emaranhado de corpos de embriões. Isso vaidispersar a digestão adicional auxiliado por trituração suave. NÃO VORTEX. </li><li> Recolha de tecido por centrifugação a 300 xg durante 3 min. Remover o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de dissociação celular Reagente 2. </li><li> Incubar durante 5-15 min à temperatura ambiente. Colocar os tubos horizontalmente. Cada 2-3 minutos, tritura-se suavemente para evitar aglomeração. Cada 5 min, avaliar o progresso digestão. <ol><li> Para avaliar o progresso de digestão, dilui-se 2 ul de sobrenadante em 18 ul de tampão de FACS e de pipeta, como uma gota sobre uma placa de cultura de células. </li><li> Coloque uma lamela sobre a amostra e observar ao microscópio de cultura de tecidos em 10X e 20X ampliações. NOTA: A preparação deve aparecer como uma mistura de células individuais, pequenos grupos, grandes aglomerados e ocasional corpo embrião na maior parte intacta. </li><li> Visualmente avaliar a proporção da preparação é que as células individuais e pequenos aglomerados. NOTA: Over-digestão irá reduzir a viabilidade; under-digestão reduzirá rendimento de célula única. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Recolha a preparação de células por centrifugação a 300 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e re-suspensão em 1 ml de frio tampão FACS. </li><li> Umedeça um filtro de células 40 mM com tampão FACS. Passar a suspensão de células através do filtro celular de 40 um sobre uma placa de cultura celular de 35 mm. Lavar o filtro de células uma vez com 1 ml de FACS buffer de triagem. </li><li> Transferir o fluxo através de um tubo de microcentrifugação de 2 ml. Recolher as células por centrifugação a 300 xg durante 5 minutos e re-suspensão em 100 ul de FACS buffer. </li><li> Contagem de rendimento das células utilizando um hemocitómetro. Diluir as amostras de 5x10 6 células por mL, ou concentração óptima recomendadas para máquina de FACS de escolha. Opcional-Ao contar rendimento celular no hemocitômetro, células mortas contracorante com azul trypan para confirmar a viabilidade da preparação de células antes da separação por FACS. NOTA: As preparações que são demasiado diluída terá quantidade excessiva de tempo para resolver. As preparações que são demasiado Concentrated tendem a se agrupar em multímeros e estão abaixo do ideal para classificar uma população pura. </li><li> Reserve 10-20% de cada amostra de usar controles como não coradas. Para as amostras restantes, mancha as células mortas por adição de um / morto (L / D) a discriminação vivo corante fluorescente para cada amostra. Não lavar. NOTA: Qualquer corante fluorescente que penetra nas células com membranas celulares comprometidas e manchas de ácidos nucleicos podem ser utilizados como o corante de L / D, desde que os espectros de fluorescência é compatível com a máquina de FACS de células de escolha e de rotulagem fluoróforo de interesse. <ol><li> Não lavar a preparação após a adição do corante como algumas células morrerão em trânsito para a purificação de FACS e devem ser excluídos da população classificada. </li></ol></li><li> Umedeça o filtro 35 um celular tampado tubo de FACS com 20 ul de tampão FACS. Adicionar células para a peneira e recolher pela gravidade. Armazenar no gelo. </li></ol> 4. FACS Enriquecimento <ol><li> Use FACS para enriquecer única, Células vivas que expressam o marcador fluorescente. <ol><li> Defina uma porta para distinguir as células de detritos em um gráfico de dispersão de dispersão para a frente (FSC-A) amplitude vs amplitude dispersão lateral (SSC-A), ambos com escala linear. Cuidado! Células Zebrafish são geralmente menores do que células humanas mouse ou. Isto reflecte-se uma separação da base inferior entre as células e os detritos. </li><li> Do portão definido em 4.1.1, defina um portão para enriquecer para células individuais e excluir multímeros usando um gráfico de dispersão de altura para a frente de dispersão (FSC-H) e baixa estatura dispersão lateral (SSC-H), ambos com escala linear. NOTA: As células com desproporcionalmente alta FSC-H e baixa SSC-H são prováveis ​​multímeros e são excluídos da classificação. </li><li> A partir do conjunto portão no 4.1.2, usando os controles de cor única, definir um portão para incluir células vivas usando apenas um gráfico de dispersão da FSA-A com escala linear e amplitude do canal usado para detectar L mancha / D com escala log. Incluem células negativas L / D. </li><li> A partir deo portão definido em 4.1.3, usando controles única cor, defina um portão para incluir células vivas apenas com fluorescência positiva usando um gráfico de dispersão da FSA-A com escala linear e amplitude do canal usado para detectar marcador de células proteína fluorescente com escala log . Incluem células positivas. </li><li> Definir os controles de compensação, se necessário, para ter em conta a interferência entre o L mancha / D e espectro de proteína fluorescente. </li></ol></li><li> Set lógica tipo de células que caem em todos os portões definiu no passo 4.1. <ol><li> Usando células duplamente marcadas, verifique gating para separação de células. NOTA: As células de triagem será células, em vez de detritos, células individuais em vez de multímeros, L / células positivos e negativos de fluorescência d. </li></ol></li><li> Ordenação de 2.000-4.000 células da população de interesse em 5 mL de tampão de FACS frio num tubo de microcentrífuga em gelo. Para minimizar corte e pressão sobre as células durante a classificação, use as pressões mais baixas possíveis para a célulaclassificador. NOTA: A gota 5 mL de tampão de FACS serve como uma almofada para células que saem da máquina de FACS. 2.000-4.000 recolha de células directamente em tampão de SCAF elimina a necessidade de centrifugação antes do carregamento para os chips IFC. Esta estratégia é recomendado porque centrifugação pode levar à formação de multímeros se as células aderirem umas às outras no sedimento. </li><li> Avaliar a análise de viabilidade pós-classificação. <ol><li> Transferir 1 ml de células classificadas para um tubo FACS fresco com 100 ul FACS buffer e uma triagem: 1.000 diluição da mancha L / D. Passar as células através do classificador de SCAF com a estratégia de propagação no passo 4.1. Utilizar a proporção de L / D de negativo para positivo para estimar a viabilidade de células separadas. </li></ol></li></ol> 5. As células carga para microfluídica Chip <ol><li> Usando um hemocitómetro, medir a concentração e tamanho de células separadas. <ol><li> Diluir células separadas para, pelo menos, 10 ul. Dilui-se uma alíquota de 5 μ; Células L com 5 ul de azul de tripano. Carregar em hemocitômetro e aplicar lamela. </li><li> Coletar imagens de campo claro de todas as células em 4 x 4 grades de hemocitômetro. Contar o número de células vivas e calcular células vivas / mL. células vivas não ocupam azul de tripano. NOTA: Use qualquer software de análise de imagem padrão para medir o diâmetro de todas as células vivas. Calcule a média eo desvio padrão do tamanho da célula, e selecione uma placa IFC apropriada para a faixa de tamanho de célula de interesse. Se gama de tamanho de célula atravessa uma faixa de tamanho de célula placa IFC, usar várias placas para capturar toda a gama de células de interesse. </li></ol></li><li> células de carga sobre a placa IFC de acordo com as instruções do fabricante (ver Materiais). <ol><li> Dilui-se as células a 1x10 6 culas / mL e realizar a optimização de flutuação de acordo com as instruções do fabricante. NOTA: otimização flutuabilidade garante que as células não vão para o fundo, nem flutuar para o topo do wel de carregamentol para o carregamento ideal para chips IFC. A proporção de tampão às células pode variar em tipo de célula, mas geralmente varia de 6: 4-7: 3 de células: tampão. </li><li> Adicionar células à placa-IFC ferrado. placa de carga em máquina de fluidos compatíveis, e executar um script de carregamento celular para empurrar as células através do circuito microfluídica e em faixas de captura. </li></ol></li><li> Confirmar que as células são alojados em locais de captura na placa IFC. <ol><li> Retire a placa IFC de máquina de fluidos. Monte a placa IFC em um microscópio equipado com um adaptador de placa. </li><li> Colete instantâneos de campo brilhante e fluorescência para cada local de captura em aumento de 10x. NOTA: Brightfield horas de captura pode variar de 10-50 ms, dependendo da intensidade da lâmpada. horas de captura de fluorescência pode variar de 250-750 ms, dependendo do brilho fluoróforo. Evite células superexposição para evitar photodamage. </li></ol></li></ol> 6. Síntese de ADNc <ol><li> Realizar a lise celular in situ, de acordo com Iinstruções do fabricante placa FC. <ol><li> Adicionar tampões de lise de poços na placa IFC. placa de carga na máquina de fluidos compatíveis e roteiro lise celular prazo, conforme as instruções do fabricante. </li></ol></li><li> Execute transcrição reversa de acordo com as instruções do fabricante da placa IFC. <ol><li> Adicionar reagentes de transcrição reversa para placa IFC. placa de carga na máquina de fluidos compatíveis. Executar script de transcrição reversa. Exemplos de condições de ciclo: 1 ciclo a 25 ° C durante 10 minutos, 1 ciclo a 42 ° C durante 1 h, depois 1 ciclo a 85 ° C durante 5 min. </li></ol></li><li> Realizar pré-amplificação com as sondas específicas de genes de acordo com as instruções do fabricante placa IFC. NOTA: Devido à sua maior especificidade com os números de baixo número de cópias, utilize sondas fluorogênicos marcado ao invés de sondas otimizados para uso com tintas intercalator. <ol><li> primers para a piscina e diluir até final de 180 nM cada. Adicionar primers combinados com placa IFC. placa de carga para fluidi compatívelmáquina de cs. script de pré-amplificação executado. </li></ol></li><li> Realizar pré-amplificação com as seguintes condições de ciclos: 1 ciclo a 95 ° C durante 10 min, em seguida 18 ciclos com desnaturação a 95 ° C durante 15 s, em seguida, emparelhamento e extensão a 60 ° C durante 4 min. Loja pré-amplificado de ADNc a 4 ° C até à colheita. cDNA colheita a partir de chapa de microfluidos de acordo com as instruções do fabricante e armazenar a -20 ° C até o uso. </li></ol> 7. Selecione cDNA a partir de células individuais para único alvo qRT-PCR <ol><li> Dilui-se ADNc em 25 uL de reagente de diluição de acordo com as instruções do fabricante. NOTA: rendimento final aproximado é de 28 l de cDNA pré-amplificada por célula. Reserva-se uma alíquota de diluente para utilização como um controlo sem modelo no qRT-PCR. <ol><li> Referindo-se ao campo claro e imagens fluorescentes gravadas na etapa 5.3.2, marcar cada local de captura. contar manualmente e registrar o número de células. Avaliar e registrar se cada célula é a gripeorescent. NOTA: Cada site individual pode conter 0, 1, ou&gt; 1 célula, onde&gt; 1 célula inclui locais de captura que contêm várias células e / ou detritos não identificável. Se as imagens são de qualidade suficiente, um valor de pixel podem também ser designado para quantificar a intensidade do sinal de fluorescência. </li></ol></li><li> Seleccione amostras para análise qRT-PCR. <ol><li> Selecione amostras de cDNA a partir de locais de captura identificados na etapa 7.2 que contêm exatamente uma célula com fluorescência positiva. Piscina alíquotas de 1 ul de cDNA de cada amostra. NOTA: Este é o &quot;pool&quot; de controlo positivo utilizado para determinar se os genes de interesse são expressos em qualquer uma das células seleccionadas. </li><li> Escolha de ADNc a partir de pelo menos um local de captura que contém exactamente 0 células como um controlo negativo. Use diluente do passo 7.1.2 como um controle não-modelo. </li></ol></li><li> Executar ensaio de qRT-PCR. <ol><li> Use apenas sondas utilizadas para a pré-amplificação no passo 6.4.1. Carregar todas as amostras em triplicate. As condições de amplificação para uma reacção de 10 ul numa placa de 384 bem: um ciclo de 50 ° C 2 min, um ciclo de 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos com desnaturação a 95 ° C 15 s, em seguida, emparelhamento e extensão a 60 ° C durante 1 min. </li></ol></li></ol> Análise 8. Dados <ol><li> Validar produtos qRT-PCR por electroforese em gel padrão. produto confirmar é uma única banda no peso molecular esperado (varia para cada sonda). NOTA: Se uma sonda produz múltiplas faixas ou uma única banda com um tamanho impróprio, em seguida, a especificidade é questionável, e isso exclui o gene da análise. </li><li> Examinar todas as curvas de amplificação e são responsáveis ​​por quaisquer anormalidades 14. Calcule o valor médio CT para cada combinação de amostra / gene 15. NOTA: Os valores de CT para controlos positivos normalmente variam de 10-30. valores CT para controlos negativos variam tipicamente 35-40 (sem amplificação). valores CT 30-35 são consideradas muito baixa expressãoe devem ser interpretados com cautela 14. </li><li> Os dados do relatório <ol><li> Se as amostras caem no CT = 10-30, os dados podem ser também relatados como a mudança vezes na transcrição abundância relativa a uma amostra de controlo. NOTA: Fold mudança é igual a 2 ^ (- ΔΔCT) onde ΔCT é relativo a um gene de manutenção por subtracção da média CT da amostra a partir do gene de manutenção e é ΔΔCT as diferenças em ΔCT entre a amostra e um controlo positivo 15. </li></ol></li></ol>

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<li>Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+reference+genes+for+quantitative+real-time+RT-PCR+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biochimica+et+biophysica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization.</a> Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).</li>
<li>Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+in+the+heart+field+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation in the heart field of zebrafish.</a> Development. 125, 1095-1101 (1998).</li>
<li>de Pater, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+phases+of+cardiomyocyte+differentiation+regulate+growth+of+the+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart.</a> Development. 136, 1633-1641 (2009).</li>
<li>Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+cardiac+development+requires+a+conserved+secondary+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field.</a> Development. 138, 2389-2398 (2011).</li>
<li>Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+expression+of+cardiac+myosin+genes+reveals+regulated+aspects+of+heart+tube+assembly+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish.</a> Developmental biology. 214, 23-37 (1999).</li>
<li>Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O processo aqui descrito utiliza, a expressão de uma proteína fluorescente sob o controlo de um promotor específico do tipo de célula para enriquecer uma população de células progenitoras cardíacas a partir de embriões de peixes-zebra para o uso no sistema de captura de uma única célula assistida de microfluidos para avaliar a expressão de um subconjunto de genes cardíacos em única células. Desde que FACS de excitação e de emissão de laser capacidades são compatíveis com o fluoróforo (s) de escolha, este método pode ser...

A maioria dos estudos atuais de biologia celular e molecular são baseados em médias populacionais. No entanto, os eventos biológicos importantes podem ser mascaradas por estas análises tradicionais de base populacional já que as populações menores podem desempenhar papéis importantes em processos biológicos e evolução da doença. Compreendendo a expressão do gene em populações heterogéneas ao nível da célula individual podem (e têm) levar a insights biológicos e clínicos relevantes 1,2. Motivo de preocupação para estudos de desenvolvimento embrionário, em uma população maior de células, as células progenitoras são muitas vezes sub-representados, tornando-o difícil de detectar mudanças sutis na expressão gênica que em última análise, propor decisões destino celular 3. De modo semelhante, um único tipo de célula pode ter diferentes perfis de expressão, em resposta ao microambiente 4. Por exemplo, células endoteliais residentes no mesmo órgão ou em diferentes órgãos (por exemplo., Aorta ou renal) exibem uma heterogeneidade significativa apesar de compartilhar MORP comumhological e funcionais características 5. Além disso, as células cancerosas que povoam o mesmo tumor também podem ter diferentes perfis moleculares ou mutações ao nível da célula individual 6. Em sistemas modelo, transcriptomics em células individuais identificou com sucesso novas populações de células, caracterizado estados intermediários que ocorrem durante a diferenciação celular, e revelou respostas celulares diferenciais aos estímulos 7,8,9. Tais percepções teriam sido detectáveis ​​em estudos de base populacional convencionais. embriões de peixe-zebra são uma fonte tremendamente subutilizado do caule, progenitor, e as células de diferenciação para explorar questões de heterogeneidade célula única e regulação molecular de identidades celulares durante o desenvolvimento. Sua, ex vivo desenvolvimento e facilidade de manipulação genética altamente estereotipados torná-los um sistema modelo excelente para esta abordagem 10,11. Especificamente, uma grande limitação para a interpretação de uma única célula gendados e expressão é que a identificação fiável de novos estados de células intermediárias durante o desenvolvimento exige um timing muito cuidado de coleta de tecido 9. Isto é necessário para assegurar que a heterogeneidade entre as células capturadas representa heterogeneidade dentro de um tecido a um único ponto de tempo, em vez de heterogeneidade na expressão de genes apresentada pela diferenciação celular dependente da idade. Em comparação com ratos, o desenvolvimento do embrião de peixe-zebra podem ser precisamente sincronizados através de um grande número de embriões 12. Além disso, com os tamanhos grandes de embraiagem, os embriões de peixe-zebra pode ser usado como uma fonte abundante de células estaminais e progenitoras. Este protocolo descreve um método para isolar a partir de embriões de peixe-zebra células e capturar as células individuais utilizando um sistema de chip e Autoprep disponível comercialmente circuito microfluidos integrado (IFC) para análise da expressão do gene qRT-PCR. Este protocolo pode ser rapidamente transferível para quaisquer ensaios de alto rendimento de multiplexagem, incluindo todasequenciamento do transcriptoma que permite a análise mais abrangente da heterogeneidade celular 13. Também oferece várias vantagens para ensaios de expressão de gene tradicionais. O protocolo de isolamento de células individuais produz alta viabilidade depois de FACS, o que diminui a proporção de células comprometidas que são incluídos em aplicações a jusante. Usando um IFC, as células capturadas pode ser observado diretamente para avaliar as taxas de captura e avaliar a saúde das células morfologicamente. Além disso, este protocolo é amplamente aplicável para a comunidade científica peixe-zebra, necessitando apenas de uma linha de peixes transgénicos marcado e acesso às tecnologias de captura de células microfluídicos. Como prova de princípio, células únicas derivadas de progenitores cardíacas foram isoladas e capturado num chip IFC, e, em seguida, a abundância relativa de marcadores de diferenciação cardíaca foi medida por qRT-PCR. Análise da expressão de genes ao nível da célula individual demonstra que células progenitoras cardíacas coexistir com a sua diferenprogênie ntiating. O conhecimento adquirido a partir de perfis de uma única célula de células progenitoras cardíacas podem lançar luz sobre a heterogeneidade nos padrões de expressão gênica entre células progenitoras cardíacas durante o desenvolvimento dos vertebrados, que pode ter sido mascarado nas análises tradicionais de base populacional.

<table><tbody><tr><td>Suprimentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 fórceps</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11254-20</td><td>Para remover o córion de embriões Tubo de</td></tr><tr><td>microcentrífuga 2 ml</td><td>GeneMate</td><td>C-3261-1</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células de 40 um</td><td>Biobasic</td><td>SP104151</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de 35 mm</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Tubos FACS cobertos com filtro de célula de 35 um</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>P1000 e pontas</td><td>Rainin</td><td>17005089</td><td></td></tr><tr><td>P20 e pontas</td><td>Rainin</td><td>17005091</td><td></td></tr> protocolo <tr><td>do fabricante do chip IFC</td><td>Fluidigm</td><td>100-6117</td><td>Versão 100-6117 E1 foi usado em experimento representativo</td></tr><tr><td>Pipeta de vidro pastuer de furo largo</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>Para transferência de embriões</td></tr><tr><td>Peixe-zebra adulto tipo selvagem</td><td>N/A</td><td></td><td>Usamos linha AB</td></tr><tr><td>Peixe-zebra transgênico adulto</td><td>N/A</td><td></td><td>Usamos Tg(nkx2.5:ZsYellow)</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>Reagentes para dissociação celular< / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Água destilada dupla</td><td>N / A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oceano Instantâneo Sal Marinho</td><td>Oceano Instantâneo</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>FisherScientific</td><td>S271-3</td><td>faz estoque de água e uso para buffer de desgemamento</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>faz estoque de água e uso para buffer de desgemamento</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td>estocar água e usar para tampão de remoção de gema</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>FisherScientific</td><td>03-600-511</td><td>Inativar o calor; qualquer marca de FBS deve estar bem</td></tr><tr><td>Reagente de Dissociação Celular 1 -TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>Armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Reagente de Dissociação Celular 2 - FACSmax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>Store -20; descongele no gelo; leve à temperatura ambiente antes de usar</td></tr><tr><td>pronase (opcional)</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>L/D Dye - Sytox Blue</td><td>Life Technologies</td><td>S34857</td><td>Qualquer mancha viva/morta adequada para citometria de fluxo funcionará</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Nome </td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Reagentes para uso em placas IFC e sondas</td> qRT-PCR<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene específico</td><td>As sondas variam de acordo com o experimento</td>TaqMan Probe ef1a Life Technologies Dr03432748_m1 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonda TaqMan gata4</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03443262_g1</td><td></td></tr><tr><td>Sonda TaqMan nk2-5</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03074126_m1</td><td></td></tr><tr><td>Sonda TaqMan myl7</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03105700_m1</td><td></td></tr><tr><td>Sonda TaqMan vmhc</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03431136_m1</td><td></td></tr><tr><td>Sonda TaqMan isl1</td><td>Life</td><td>Technologies Dr03425734_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes listados no protocolo</td><td></td><td></td><td></td>do fabricante IFC</tr><tr><td>Kit de reagentes C1</td><td>Reagentes Fluidigm</td><td>100-5319</td><td>Reagentes para carregamento de células em placa IFC</td></tr><tr><td>Ambion Single Cell-to-CTTM</td><td>Life Technologies</td><td>4458237</td><td>Reagentes para transcrição reversa e etapas de pré-amplificação</td></tr><tr><td>Biologia Molecular Qualidade Água</td><td>Corning</td><td>46-000CM</td><td></td></tr><tr><td>C1 IFC para Pré-Amplificador (5-10 um)</td> <td>Fluidigm</td><td>100-5757</td><td>Placa IFC para pequenas células</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina C1 AutoPrep</td><td>Fluidigm</td><td>100-5477</td><td>Para placa IFC use</td></tr><tr><td>Hemocitômetro&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Para contar células e avaliar o tamanho das células</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td> de dissecação <td>Para remover embriões do córion</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td> de cultura de tecidos <td>Para avaliar a digestão de células únicas</td></tr><tr><td>Máquina</td><td></td><td></td> FACS <td>Para isolar células de interesse</td></tr></tbody></table>

isolamento e caracterização de células individuais de embriões zebrafish

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

O peixe-zebra (Danio rerio) é um poderoso organismo modelo para estudar o desenvolvimento dos vertebrados. Embora muitos aspectos do desenvolvimento embrionário do peixe-zebra tenham sido descritos no nível morfológico, pouco se sabe sobre a base molecular das mudanças celulares que ocorrem à medida que o organismo se desenvolve. Com os recentes avanços em microfluídica e tecnologias de multiplexação, agora é possível caracterizar a expressão gênica em células individuais. Isso permite a investigação da heterogeneidade entre células individuais de populações celulares específicas para identificar e classificar subtipos celulares, caracterizar estados intermediários que ocorrem durante a diferenciação celular e explorar respostas celulares diferenciais a estímulos. Este estudo descreve um protocolo para isolar células únicas viáveis de embriões de peixe-zebra para ensaios de multiplexação de alto rendimento. Este método pode ser rapidamente aplicado a qualquer tipo de célula embrionária de peixe-zebra com marcadores fluorescentes. Uma extensão desse método também pode ser usada em combinação com tecnologias de sequenciamento de alto rendimento para caracterizar completamente o transcriptoma de células individuais. Como prova de princípio, a abundância relativa de marcadores de diferenciação cardíaca foi avaliada em células isoladas e únicas derivadas de progenitores cardíacos positivos para nkx2.5. Por meio da avaliação da expressão gênica no nível de uma única célula e em um único ponto de tempo, os dados apóiam um modelo no qual os progenitores cardíacos coexistem com a progênie diferenciadora. O método e o fluxo de trabalho descritos aqui são amplamente aplicáveis à comunidade de pesquisa do peixe-zebra, exigindo apenas uma linha de peixes transgênicos rotulados e acesso a tecnologias microfluídicas.

Como prova de princípio, a expressão do gene foi avaliada para explorar a dinâmica de diferenciação durante o desenvolvimento cardíaco. No peixe-zebra, progenitores cardíacos surgir a partir de uma população de células da mesoderme que migram para a mesoderme lateral anterior onde elas se fundem para formar o tubo de coração linear. Antes da fusão, progenitores cardíacos começam a expressar o factor de transcrição Nkx2.5 (NK2 homeobox 5), que se pensa ser a mais antiga marcador ...

Este protocolo descreve um método para isolar células únicas de embriões de peixe-zebra, enriquecendo para células de interesse, capturando células de peixe-zebra em sistemas multiplex de célula única baseados em microfluídica e avaliando a expressão gênica de células únicas.

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

O objetivo geral deste experimento é isolar células individuais de embriões de peixe-zebra em estágio inicial para seu aprisionamento em um sistema multiplex de célula única baseado em microfluídica, a fim de avaliar a expressão gênica de células individuais. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biologia do desenvolvimento, como quais alterações transcricionais as células sofrem durante a especificação e a diferenciação. A principal vantagem desta técnica é que ela representa uma abordagem imparcial para revelar a heterogeneidade que é mascarada nas técnicas convencionais baseadas em populações.Em geral, indivíduos novos nesta técnica enfrentarão dificuldades, pois gerar preparações viáveis de células isoladas é tecnicamente desafiador, mas essencial para análises posteriores. Uma vez dominado, o processamento de amostras de embriões inteiros em células únicas lisadas em um chip microfluídico integrado pode ser concluído em seis horas, se os passos forem realizados corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de garantir que apenas células individuais sejam capturadas no dispositivo microfluídico.Após cruzar adultos de zebrafish selvagens e transgênicos, colete os embriões em intervalos de 15 minutos de acordo com os procedimentos operacionais padrão aprovados pela instituição e pelo estabelecimento. Pelo menos duas horas depois, transfira de 100 a 300 embriões fertilizados de um único ponto temporal para um novo recipiente de Petri contendo água para ovos fresca. E use pinças finas para remover manualmente a coriona de cada embrião.Em seguida, utilize uma pipeta de vidro de grande diâmetro para transferir os embriões para um tubo de microcentrífuga de 2 mililitros com o menor volume possível de água para ovos. Quando todos os embriões tiverem sido transferidos, substitua a água por 1 mililitro de água para ovos gelada e mergulhe o tubo em gelo por 20 minutos. Após a eutanásia, utilize uma pipeta de vidro de grande diâmetro para remover o sobrenadante.E uma pipeta P-1000 para adicionar água fresca de ovos aos embriões duas vezes. Após a segunda lavagem, substitua a água de ovos por 1 mililitro de tampão de desovulação e use uma pipeta P-1000 para triturar os embriões de oito a 12 vezes até que a gema seja dissolvida e apenas os corpos dos embriões estejam visíveis. Colete o tecido por centrifugação.Em seguida, utilize a pipeta para remover suavemente o sobrenadante sem perturbar o pellet de tecido e re-suspender as células em 1 mililitro de água de ovo fresca. Após lavar os embriões mais duas vezes, re-suspender o pellet em 1 mililitro do reagente de dissociação celular-1 à temperatura ambiente. Em seguida, coloque o tubo deitado para uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente.Com pipetagem suave a cada dois a três minutos para evitar aglomeração. Ao final da incubação, centrifugar as células novamente e ressuspender o pellet em 1 mililitro do reagente de dissociação celular-2. Incubar as células horizontalmente à temperatura ambiente por mais cinco a 15 minutos, com pipetagem suave a cada dois a três minutos.A cada cinco minutos, dilua 2 microlitros do sobrenadante em 18 microlitros de tampão FACS e distribua as células em forma de gota sobre uma placa de cultura celular. Coloque uma lamínula sobre a amostra e utilize um microscópio de cultura de tecidos para avaliar o progresso da digestão em aumentos de 10 e 20x. Quando a preparação parecer uma mistura de células isoladas, com alguns aglomerados celulares pequenos e grandes e poucos embriões ainda majoritariamente intactos, centrifugue as células e re-suspenda o pellet em 1 mililitro de tampão FACS frio.Em seguida, umedeça um filtro celular de 40 micrômetros com tampão FACS. E filtre as células através do filtro para uma placa de cultura celular de 35 milímetros. Após centrifugar as células novamente, re-suspenda o pellet em 100 microlitros de tampão FACS e conte o número de células viáveis pelo método de exclusão com azul de tripano.Em seguida, dilua a amostra para 5 vezes 10 à 6ª células por mililitro. Reserve 10 a 20% das células para o controle não corado. Incube o restante das células com um corante fluorescente para discriminação de células vivas/mortas.Em seguida, umedeça um tubo FACS com peneira de células de 35 micrômetros com 20 microlitros de tampão FACS e adicione as células à peneira, coletando-as por gravidade. Usando a estratégia de seleção ilustrada, separe as células vivas únicas que expressam o marcador fluorescente. Verifique a seleção com as células duplamente marcadas.Classifique 2.000 a 4.000 células da população de interesse em 5 microlitros de tampão FACS frio em um tubo de microcentrífuga sobre gelo. Em seguida, transfira 1 microlitro das células classificadas para um novo tubo FACS contendo 100 microlitros de tampão de classificação FACS e uma diluição de 1 para 1.000 do corante vivo/morto. E analise a amostra celular utilizando os gates de classificação para avaliar a viabilidade pós-classificação.Em seguida, carregue 1 microlitro de células diluídas em 9 microlitros de tampão FACS em um hemocitômetro para determinar a concentração celular e o diâmetro médio. Agora, selecione um circuito microfluídico integrado, ou chip IFC, do tamanho apropriado para o diâmetro celular médio da amostra, e prepare a fluídica de acordo com as instruções do fabricante. Carregue as células na placa conforme as instruções do fabricante e insira a placa em uma máquina fluídica compatível.Em seguida, execute um script de carregamento celular apropriado para o chip IFC a fim de direcionar as células para as canaletas de captura. Para confirmar que as células estão alojadas nos sítios de captura, monte a placa em um microscópio equipado com adaptador para placa e obtenha imagens em campo claro e de fluorescência de cada sítio de captura com aumento de 10x. As células podem então ser processadas para avaliação posterior da expressão de seus genes-alvo por QRT-PCR.No estágio de 18 somitos, a microscopia de fluorescência pode ser utilizada para verificar a expressão de ZsYellow nos embriões. Após a classificação, obtêm-se células com uma variedade de diâmetros. A placa de CFI pode ser usada para capturar células com um diâmetro de interesse.Por exemplo, neste experimento, células com diâmetro entre cinco e dez micrômetros. Como esperado, as células classificadas e capturadas de embriões com 18 horas pós-fertilização expressaram o marcador fluorescente ZsYellow. Aqui, a QRT-PCR foi utilizada para avaliar a expressão gênica relativa de genes específicos de interesse em 40 células individuais provenientes de locais de captura celular em uma placa IFC.Como a amplitude dos valores de ciclo limiar para o gene de referência foi muito ampla para comparar a expressão gênica entre amostras e muitos valores de ciclo limiar excederam 30, os valores foram visualizados como um mapa de calor. Ao comparar entre amostras, observou-se uma heterogeneidade substancial na expressão gênica neste experimento. Com as células classificadas como Tipos 1 a 5 com base em seus padrões de expressão gênica.Uma vez dominado, o processamento de amostras de embriões inteiros em células únicas lisadas em um chip microfluídico integrado pode ser concluído em seis horas, se os passos forem realizados corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que apenas células individuais são capturadas no chip microfluídico. Após este procedimento, outros métodos, como sequenciamento de alta produtividade de célula única, podem ser realizados para caracterizar completamente os transcriptomas de células individuais.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia do desenvolvimento explorarem a heterogeneidade celular em embriões em estágios iniciais de desenvolvimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células individuais de embriões de peixe-zebra, capturar células individuais em um sistema multiplex de única célula baseado em microfluídica e avaliar a expressão gênica de células individuais.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Neste vídeo, demonstramos um método pelo qual para analisar o cérebro em desenvolvimento em embriões vertebrados zebrafish viver em resolução única célula por microscopia confocal. Isso inclui o método pelo qual injetamos o embrião do zebrafish de uma única célula e, posteriormente, montar e imagem do cérebro em desenvolvimento.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

Chave para a compreensão dos processos morfogenéticos que forma o embrião precoce é a capacidade de células de imagem em alta resolução. Descrevemos aqui uma técnica para a rotulagem células isoladas ou pequenos aglomerados de células em embriões de peixe-zebra inteira com membrana-alvo Proteína Fluorescente Verde.

Rotulagem e Células de imagem no rombencéfalo Zebrafish

O peixe-zebra, um pequeno peixe tropical, tornou-se um modelo popular para estudar a função do gene durante o desenvolvimento de vertebrados e doença. A expressão espacial e temporal dos genes alvo pode ser determinada...

Alta resolução Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização dentro embriões Zebrafish para estudar a expressão gênica e função

Este protocolo apresenta uma abordagem para a análise do transcriptoma toda de zebrafish embriões, larvas, ou células de classificados. Nós incluímos o isolamento do RNA, análise de caminho de dados de RNASeq e validação de qRT-PCR-baseados de mudanças de expressão do gene.

Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

Zebrafish recentemente foram usados como um sistema de modelo na vivo para estudar tempo de replicação do ADN durante o desenvolvimento. Aqui está detalhado os protocolos para o uso de embriões de peixe-zebra para sincronismo de replicação de perfil. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tempo de replicação em mutantes, tipos de células individuais, modelos de doença e outras espécies.

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

Apresentamos um protocolo para isolar os neurônios, macrófagos e microglia do zebrafish larval cérebros sob condições fisiológicas e patológicas. Após o isolamento, RNA é extraído dessas células para analisar seu perfil de expressão do gene. Este protocolo permite para a coleção de RNA de alta qualidade para a realização de análise a jusante como qPCR e transcriptomics.

Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

Apresentamos um protocolo eficiente e fácil de usar para a preparação de culturas de células primárias de zebrafish embriões para transfeccao e imagens de células vivas, bem como um protocolo para preparar as células primárias do cérebro adulto zebrafish.

Cultura e transfecção de células primárias de Zebrafish

Este protocolo demonstra a imunofluorescência seqüencial e immunohistochemistry em Cryosections dos embriões do zebrafish do cedo-estágio permitindo análises precisas da colocalização em populações específicas da pilha.

Imunofluorescência sequencial e imuno-histoquímica em embriões de zebrafish Crioseccionados

O presente protocolo descreve o isolamento agudo de células musculares lisas cardíacas e vasculares viáveis de zebrafish adulto, juvenil, larval e embrionário (Danio rerio), adequados para estudos eletrofisiológicos.

Isolamento de células musculares lisas cardíacas e vasculares de zebrafish adulto, juvenil, larval e embrionário para estudos eletrofisiológicos

Aqui, descrevemos um método para isolamento intestinal de larvas de zebrafish aos 5 dias após a fertilização, para análise de sequenciamento de RNA de célula única.

Isolamento Intestinal de Larvas de Zebrafish para Sequenciamento de RNA de Célula Única

Aprenda a isolar células individuais de embriões de zebrafish e analisar a expressão gênica usando sistemas microfluídicos. Este método revela heterogeneidade celular oculta em técnicas convencionais baseadas em populações.

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

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