Name: VERDADEIRO silenciamento gênico: Triagem de um heptâmero tipo Guia de pequeno RNA Biblioteca de agentes terapêuticos potenciais Câncer (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprenda a triar bibliotecas de sgRNA tipo heptâmero para identificar agentes terapêuticos potenciais contra cânceres de sangue. Este protocolo utiliza síntese de fosforamidito e análise de estruturas de RNA para descoberta de medicamentos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Transferência adaptável e Seamless Tecnologia através de I &amp; D, o Japão Agência de Ciência e Tecnologia, Fundo de Promoção de pesquisa da ciência da Corporação de Promoção e Ajuda Mútua para Escolas Particulares do Japão Target-driven, e os números JSPS KAKENHI Grant 24300342 e 15H04313 .

1. Construção de um tipo de heptâmero sgRNA Biblioteca <ol><li> Selecionar um subconjunto dos 16.384 (4 7) sequências de 7 nt a menos que a biblioteca em grande escala deve ser construída. NOTA: As sequências podem ser aleatórios e / ou projetados para atingir RNAs celulares específicos. Para este último, encontrar estruturas em gancho de cabelo que se assemelha à do t-braço de ARNt num ARN alvo com o auxílio de um programa adequado de computador e / ou visualmente, e seleccione sequências complementares a sequências 7-nt imediatamente a jusante das estruturas em gancho de cabelo 4,10, 17,18. </li><li> Sintetizar cada um dos heptamers seleccionados como um 2&#39;-O totalmente -methylated, 5&#39;- e 3&#39;-ARN fosforilada com um sintetizador de ADN / ARN. Usar o método de fosforamidite sobre o vidro de poro controlado (CPG) de suporte, e deixar o 5&#39;-terminal de 4,4&#39;-dimetoxitritilo (DMT) no grupo protector no último ciclo (a adição de fosfato de 5 &#39;) da síntese 23. NOTA: sy personalizadonthetic ARN pode também ser obtido a partir de fornecedores de oligonucleótidos. </li><li> Após a conclusão do último ciclo de síntese, transferir a CPG com o oligonucleótido sintetizado a partir da coluna para um frasco de vidro com tampa de rosca-revestimento de Teflon, adiciona-se hidróxido de amónio a 1 ml de 29%, e incuba-se que a 55 ° C durante 8 h para clivar o oligonucleótido do CPG e remover os grupos protectores das bases e fosfatos. </li><li> Evapora-se hidróxido de amónio com um evaporador centrífugo a 40 ° C e re-dissolve-se o oligonucleótido em 0,2 ml de 0,1 M de n-hexilamónio de etilo. </li><li> Purifica-se o oligonucleótido sintético por meio de cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa utilizando uma coluna de poliestireno-divinilbenzeno com um tampão contendo 10-50% de acetonitrilo / M de acetato de n-hexilamónio 0,1. Executar a coluna a 2,0 ml / min durante 25 min a 80 ° C. </li><li> Adicionar 0,25-0,5 ml de ácido acético concentrado até a amostra fraccionado (1-2 mL) para fazer uma solução de ácido acético a 20%, e incubate esta solução durante 1 hora à temperatura ambiente para remover o grupo DMT. </li><li> Seca-se a amostra com um evaporador centrífugo a 40 ° C, re-dissolve-lo em hidróxido de amónio a 1 ml de 29%, e incubar a solução durante 15 minutos à temperatura ambiente para remover a cadeia lateral de fosfato 5 &#39;. </li><li> Reduzir o volume (1 ml) da amostra de cerca de 0,3 ml com um evaporador centrífugo a 40 ° C. </li><li> Dialisar toda a amostra concentrada contra água destilada (500 ml), utilizando um tubo de diálise com um peso molecular de corte de 1000 a 4 ° C durante a noite. </li><li> Transfira a amostra dialisada a partir do tubo de diálise para um tubo de 1,5 ml com uma pipeta, secá-lo com um evaporador centrífugo a 40 ° C, e, subsequentemente, re-dissolvê-lo em água-para-injecção de nível de água, o volume da qual deve ser pequena o suficiente para fazer uma solução maior do que 100 uM. </li><li> Medir uma densidade óptica da amostra de ARN a 260 nm com um espectrofotómetro e ajustar a sua concentração para 100uM por adição de água-para-injecção de nível de água. Guardar a solução de ARN a abaixo de -20 ° C antes da utilização. </li></ol> 2. Rastreio da Biblioteca sgRNA para a viabilidade celular <ol><li> Preparar 10 3 células / 99 ul / poço (por exemplo, HL60 e meio RPMI-8226) em um prato de 96 poços em meio RPMI-1640 suplementado com soro de bovino fetal a 10% e solução de penicilina-estreptomicina a 1%. Prepare poços contendo os meios de comunicação apenas para a subtracção de fundo. Para eliminar os efeitos de borda, adicione água estéril para esvaziar poços que cercam os poços de amostra. </li><li> Adicionar 1 ml de tipo heptâmero sgRNA (100 uM) dissolvido em água-para-injecção de nível de água a cada poço. Ensaiar cada sgRNA em triplicado. Incubar a placa a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2 durante 3 dias. </li><li> Adicionar um volume apropriado de uma solução de WST-8 disponível comercialmente a cada poço. Incubar a placa a 37 ° C no mesmo incubador durante 1-4 horas. </li><li> Medir a absorvância at 450 nm com um leitor de microplacas. NOTA: Na maior parte dos casos, a linearidade entre a absorvância e o número de células viáveis ​​parece ser mantida a menos que o valor da absorvância superior a 1,0. </li></ol> 3. Avaliação da efectiva sgRNAs por citometria de fluxo <ol><li> Preparar 10 3 células / 99 ul / poço (por exemplo, HL60) em um prato de 96 poços em meio RPMI-1640 suplementado com soro de bovino fetal a 10% e solução de penicilina-estreptomicina a 1%. Preparar pelo menos 10 poços para uma sgRNA a ser testado. Para eliminar os efeitos de borda, adicione água estéril para esvaziar poços que cercam os poços de amostra. </li><li> Adicionar 1 ml de tipo heptâmero sgRNA (100 uM) dissolvido em água-para-injecção de nível de água a cada poço. Incubar a placa a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2 durante 3 dias. </li><li> Recolher as células tratadas com o mesmo sgRNA de pelo menos 10 poços para um tubo de 5 ml com uma pipeta. Girar o tubo durante 5 min numa centrífuga a 300 xg, e descartar os meios de comunicação. </li><li> Adicionar 2 ml de 1x tampão fosfato salino (PBS) para o tubo, e re-suspender as células. Girar o tubo durante 5 min numa centrífuga a 300 xg, e descartar PBS. Adicionar 150 ul de 1x tampão de ligação da anexina V para o tubo, e re-suspender as células. </li><li> Adicionar 2 mL de ficoeritrina (PE) -conjugated solução anexina V e 1 ul de solução de 7-aminoactinomycin D (7AAD) para o tubo, mistura-los bem, e incuba-se o tubo durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Analisar a amostra usando um citômetro de fluxo 24. </li></ol>

<ol><li>Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScherer%2C+L+%22RNA+and+the+Regulation+of+Gene+Expression%3A+A+hidden+layer+of+complexity%22">RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity</a>. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease+to+four-base-recognizing+RNA+cutters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+cleavage+of+target+RNAs+from+HIV-1+with+5%E2%80%B2+half+tRNA+by+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> RNA. 2, 523-534 (1996).</li>
<li>Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+heptamers+that+directs+RNA+cleavage+by+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+RNA+substrates+for+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+candidate+prostate+cancer+susceptibility+gene+encodes+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+half-domain+of+the+long+form+of+tRNase+Z+is+required+for+the+RNase+65+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+four-base-recognizing+RNA+cutter+that+can+remove+the+single+3%E2%80%B2+terminal+nucleotides+from+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. 32, e91(2004).</li>
<li>Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T+loop+structure+is+dispensable+for+substrate+recognition+by+tRNase+ZL%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL.</a> J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).</li>
<li>Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+mRNA+cleavage+by+3%E2%80%B2+tRNase+under+the+direction+of+2%E2%80%B2-O-methyl+RNA+heptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers.</a> Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).</li>
<li>Habu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+gene+expression+by+retroviral+vector-mediated+small-guide+RNAs+that+direct+specific+RNA+cleavage+by+tRNase+ZL%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL.</a> Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).</li>
<li>Nakashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-silencing+by+the+tRNA+maturase+tRNase+ZL+under+the+direction+of+small+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA.</a> Gene Ther. 14, 78-85 (2007).</li>
<li>Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+expression+by+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).</li>
<li>Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+utility+of+heptamer-type+sgRNA+for+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).</li>
<li>Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+inhibition+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells+by+sgRNA+targeting+the+cyclin+D1+mRNA+based+on+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing.</a> PLoS One. 9 (114121), (2014).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+specific+miRNAs+by+naked+14-nt+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs.</a> PLoS One. 7 (38496), (2012).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+naked+RNA+heptamer+targeting+the+human+Bcl-2+mRNA+induces+apoptosis+of+HL60+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells.</a> Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).</li>
<li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+apoptosis+of+leukemic+cells+by+TRUE+gene+silencing+using+small+guide+RNAs+targeting+the+WT1+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA.</a> Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).</li>
<li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gene+expression+by+human+cytosolic+tRNase+ZL+through+5%E2%80%B2-half-tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA.</a> PLoS One. 4, 5908(2009).</li>
<li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytosolic+tRNase+ZL+can+downregulate+gene+expression+through+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA.</a> FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).</li>
<li>Ninomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+small+guide+RNAs+for+tRNase+ZL+from+human+plasma%2C+peripheral+blood+mononuclear+cells%2C+and+cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines.</a> PLoS One. 10, 0118631(2015).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+a+heptamer-type+sgRNA+library+for+potential+therapeutic+agents+against+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).</li>
<li>Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis">http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis</a> (2015).</li>
<li>FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf">http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf</a> (2007).</li>
<li>Shivarov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRUE+gene+silencing+for+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">TRUE gene silencing for hematologic malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 729(2014).</li>
</ol>

A Universidade de Farmácia e Ciências da Vida Aplicadas de Niigata tem um pedido de patente pendente em um subconjunto dos sgRNAs do tipo heptamer.

Na maioria dos casos, os sgRNAs do tipo heptâmero totalmente 2'-O-metilados, 5' e 3'-fosforilados dissolvidos em água para injeção (na concentração de 100 μM) parecem ser estáveis abaixo de -20 ° C por pelo menos um ano, a julgar por sua atividade para induzir apoptose em células cancerígenas. No entanto, sua estabilidade mudaria dependendo de sua sequência, qualidade e pureza. Em alguns casos, o fosfato 5 'ou 3' de uma parte das moléculas de sgRNA parece ser removido espontaneamente durante o armazenamento, a j...

Silenciamento do gene VERDADEIRO (denominado após tR Nase Z L - L e tilizing fficacious silenciamento do gene) é uma das tecnologias de silenciamento do gene dirigida por RNA 1. Esta tecnologia foi desenvolvida com base nas propriedades de tRNase Z L (ou 3 &#39;tRNase), ARNt 3&#39; endorribonuclease processamento: ela pode clivar qualquer ARN alvo em qualquer sítio esperado sob a direcção de um pequeno ARN guias artificiais (sgRNA) através do reconhecimento de uma pré-ARNt ou de tipo micro-pré-ARNt-como a estrutura formada entre o RNA alvo e a sgRNA 2-9. sgRNA, que normalmente é 7-31 nt de comprimento, é categorizada em quatro grupos, 5&#39;-meia-ARNt, ARN heptâmero, ARN linear de 14 nt, e de ARN de gancho. Temos demonstrado a eficácia de silenciamento de genes VERDADEIRO através da introdução de vários sgRNAs artificialmente projetados em células vivas 10-15. Também mostrámos que sgRNAs pode ser absorvida pelas células Without quaisquer reagentes de transfecção e pode regular negativamente os seus níveis de RNA alvo e / ou induzir a apoptose em células cancerosas humanas 16 - 18. Silenciamento de genes VERDADEIRO aparece para trabalhar no intracelular e sistema de rede de transcrição intercelular via tRNase Z L e sgRNAs naturais 19 - 21. Construímos uma biblioteca sgRNA contendo 156 do tipo heptâmero sgRNAs para procurar potenciais sgRNAs do tipo heptâmero terapêuticas para cancros do sangue 22. Temos rastreados para que o efeito sobre a viabilidade de células de mieloma e de leucemia humana, e descobriram que 20 deles pode eficientemente induzir a apoptose em pelo menos uma das linhas celulares de cancro. E quatro deles foram mostrados para reduzir as taxas de crescimento de tumor em experiências de xenoenxerto de ratinho. Aqui apresentamos um protocolo para o rastreio de uma biblioteca sgRNA tipo heptâmero para os potenciais drogas terapêuticas contra o câncer no sangue. O protocolo inclui comopara construir a biblioteca sgRNA, a forma de avaliar o efeito de cada sgRNA sobre a viabilidade celular, e a forma de avaliar ainda mais os sgRNAs eficazes por citometria de fluxo. Análise para ARN alvo celular da sgRNA e avaliação de sgRNAs eficazes em modelos de xenoenxerto de ratinho pode ser realizada de acordo com métodos convencionais 17,22, embora estes não estão incluídas no presente protocolo.

<table><tbody><tr><td>Cartucho de Preparação HC OligoSep</td><td>Nippon Bioservice Nippon Bioservice</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>personalizado</td><td>99-3860</td><td></td></tr><tr><td>Água para injeção grau Água</td><td>Otsuka Pharmaceutical&nbsp;</td><td>7131400A2129</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 médio</td><td>Wako</td><td>189-02025</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Solução mista de penicilina-estreptomicina</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655 Kit de contagem de 180</td><td></td></tr><tr><td>células-8</td><td>DOJINDO</td><td>343-07623</td><td>WST-8 solução</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas, Sunrise Thermo RC-R</td><td>TEKAN</td><td>510-82851</td><td></td></tr><tr><td>FACS Tubo de fundo redondo</td><td>BD Falcon</td><td>60819-820</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P7059-1L</td><td></td></tr><tr><td>PE Anexina V Tampão de ligação</td><td>BD Biosciences</td><td>51-66121E</td><td></td></tr><tr><td>PE Anexina V</td><td>BD Biosciences</td><td>51-65875X</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo 7AAD</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A9400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>, FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>342973</td><td></td></tr></tbody></table>

verdadeiro silenciamento gênico: triagem de um heptâmero tipo guia de pequeno rna biblioteca de agentes terapêuticos potenciais câncer

TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents

Silenciamento do gene VERDADEIRO (denominado após tR Nase Z L - L tilizing e fficacious silenciamento do gene) é um do gene dirigida por ARN de silenciamento tecnologias, que utiliza uma pequena guia de ARN artificial (sgRNA) para guiar endorribonuclease processamento ARNt 3 &#39;, tRNase Z L , para reconhecer um alvo de ARN. sgRNAs podem ser absorvidos pelas células sem quaisquer reagentes de transfecção e pode regular negativamente os seus níveis de RNA alvo e / ou induzir a apoptose em células cancerosas humanas. Temos rastreada uma biblioteca sgRNA contendo 156 sgRNAs do tipo heptâmero para o efeito sobre a viabilidade de células de mieloma e de leucemia humana, e descobriram que 20 deles pode eficientemente induzir a apoptose em pelo menos uma das linhas celulares de cancro. Aqui apresentamos um protocolo para o rastreio de uma biblioteca sgRNA tipo heptâmero para os potenciais drogas terapêuticas contra o câncer no sangue. O protocolo inclui a forma de construir a biblioteca sgRNA, a forma de avaliar o efeito de cada sgRNA sobre a viabilidade celular, e a forma de further avaliar os sgRNAs eficazes por citometria de fluxo. Cerca de 2000 acessos seria esperado para ser obtido por rastreio da biblioteca em grande escala sgRNA composto de 16.384 heptamers.

Os seis tipo heptâmero sgRNAs 5&#39;-AUCUUCA-3 &#39;(H1885), 5&#39;-ACACACA-3&#39; (H3277), 5&#39;-GGGGGCG-3 &#39;(H10927), 5&#39;-GGGGCCC-3&#39; (H10944), 5&#39;-GCCCCCG-3 &#39;(H12287), e 5&#39;-CACCAGC-3&#39; (H13260) foram sintetizados quimicamente como 2&#39;-O-metil ARN contendo 5&#39;- e 3&#39;-fosfatos. Estes sgRNAs foram examinados quanto aos efeitos sobre a viabilidade de uma linha celular de leucemia humana...

Aqui apresentamos um protocolo para o rastreio de uma biblioteca sgRNA tipo heptâmero para os potenciais drogas terapêuticas contra o câncer no sangue.

VERDADEIRO silenciamento gênico: Triagem de um heptâmero tipo Guia de pequeno RNA Biblioteca de agentes terapêuticos potenciais Câncer

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes ...

O objetivo geral deste teste é encontrar medicamentos terapêuticos potenciais contra cânceres sanguíneos. Inicie este procedimento selecionando um subconjunto de sequências Heptâmero. As sequências podem ser aleatórias ou projetadas para direcionar RNAs celulares específicos. Para direcionar RNAs celulares específicos, utilize um programa de computador apropriado para identificar estruturas em alfinete de cabelo que assemelhem-se ao braço T em um RNA alvo. Selecione sequências complementares de sete nucleotídeos imediatamente a jusante do alfinete de cabelo. Utilizando o método de fosforamidito em vidro poroso controlado, ou suporte CPG, sintetize cada um dos Heptâmeros selecionados como um RNA totalmente 2’-O-metilado, fosforilado na extremidade 5’ e 3’, com o sintetizador de DNA-RNA. Mantenha o grupo protetor DMT terminal 5’ no último ciclo da síntese. Após a conclusão do último ciclo, transfira o CPG com o oligonucleotídeo sintetizado da coluna para um frasco de vidro com tampa rosqueável revestida de teflon. Adicione 1 mL de hidróxido de amônio a 29% e incube o tubo a 55

true-gene-silencing-screening-heptamer-type-small-guide-rna-library

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Aqui usamos uma biblioteca esiRNA humanos em uma tela de high-throughput de genes envolvidos na divisão celular. Demonstramos como configurar e realizar uma esiRNA telas, bem como a forma de analisar e validar os resultados.

EsiRNA MISSÃO para a seleção RNAi em células de mamíferos

Aqui usamos uma biblioteca LentiPlex humanos agrupados e tradicionais métodos de seqüenciamento de genes para identificar alvos promover a sobrevivência celular. Demonstramos como configurar e deconvolute uma tela LentiPlex e validar os resultados.

LentiPlex MISSÃO Pooled shRNA Screening Biblioteca em células de mamíferos

RNA de interferência (RNAi) possui muitas vantagens sobre knockout do gene e tem sido amplamente utilizada como uma ferramenta em estudos de genes funcionais. A invenção da tecnologia de RNAi DNA vector baseado fez a longo prazo e knockdown induzível gene possível, e também aumentou a viabilidade de silenciamento do...

DNA Vector baseado em RNA de interferência para estudar a função Gênica em Câncer

Alcançar um nível de compreensão dos processos celulares de sistemas é uma meta da biologia celular moderna. Descrevemos aqui as estratégias para jornalistas luciferase multiplexação de várias funções celulares de pontos finais para interrogar a função do gene usando genoma escala bibliotecas RNAi.

A plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas

Aqui descrevemos um ensaio de gene repórter baseado em células como uma ferramenta valiosa para rastrear bibliotecas químicas em busca de compostos que modulam os mecanismos de controle pós-transcricional exercidos por meio de 3' UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Aqui descrevemos um protocolo para empregar o rastreio com throughput alto RNAi para descobrir destinos de host que podem ser manipulados para aumentar a terapia de vírus Oncolíticos, especificamente a terapia rhabodvirus e vaccinia vírus, mas pode ser facilmente adaptado para outros Oncolíticos plataformas de vírus ou para descobrir genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus em geral.

Rastreio de RNAi todo o genoma para identificar fatores do hospedeiro que modulam o vírus Oncolíticos terapia

Uma biblioteca CRISPR/sgRNA aplicou-se para interrogar os genes codificantes de proteínas. No entanto, a viabilidade de uma biblioteca de sgRNA para descobrir a função de um limite CTCF na regulação gênica permanece inexplorada. Aqui, descrevemos uma biblioteca de sgRNA específico de loci HOX para elucidar a função dos limites CTCF HOX loci.

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca rastreio identificando crítico CTCF limites

A tecnologia CRISPR-Cas9 fornece um método eficiente para editar precisamente o genoma dos mamíferos em qualquer tipo de célula e representa um novo meio para realizar telas genéticas de todo o genoma. Um protocolo detalhado que discute as etapas necessárias para o desempenho bem-sucedido de telas de CRISPR-Cas9 agrupadas em todo o genoma é fornecido aqui.

Telas genéticas com base em CRISPR agrupadas em células de mamíferos

Para identificar novos reguladores de fatores de transcrição, desenvolvemos uma abordagem para tela de bibliotecas RNAi lentivirais ou retrovirais usando um ensaio de repórter transcricional baseado em dupla luciferase. Esta abordagem oferece uma maneira rápida e relativamente barata de selecionar centenas de candidatos em um único experimento.

Identificação de reguladores de fatores de transcrição usando triagem de média-duração de bibliotecas arrayed e um repórter baseado em dupla-luciferase

A triagem de interferência de RNA de alto rendimento (RNAi) usando um pool de shRNAs lentiviral pode ser uma ferramenta para detectar alvos letais sintéticos terapeuticamente relevantes em malignidades. Fornecemos uma abordagem de triagem de shRNA agrupada para investigar os efeitos epigenéticos na leucemia mielóide aguda (LMA).

Triagem de biblioteca shRNA agrupada para identificar fatores que modulam um fenótipo de resistência a drogas

Desenvolvemos uma abordagem oncogenômica comparativa entre espécies utilizando análises genômicas e telas genômicas funcionais para identificar e comparar alvos terapêuticos em tumores surgidos em modelos de camundongos geneticamente modificados e o tipo de tumor humano correspondente.

Perfil Genético e Triagem de Abandono em Escala Genômica para Identificar Alvos Terapêuticos em Modelos Murinos de Tumor Maligno de Bainha de Nervo Periférico

Aprenda a triar bibliotecas de sgRNA tipo heptâmero para identificar agentes terapêuticos potenciais contra cânceres de sangue. Este protocolo utiliza síntese de fosforamidito e análise de estruturas de RNA para descoberta de medicamentos.

VERDADEIRO silenciamento gênico: Triagem de um heptâmero tipo Guia de pequeno RNA Biblioteca de agentes terapêuticos potenciais Câncer (Vídeo) | JoVE Journal

VERDADEIRO silenciamento gênico: Triagem de um heptâmero tipo Guia de pequeno RNA Biblioteca de agentes terapêuticos potenciais Câncer

Explorar mais vídeos