Conversão epigenética como um método seguro e simples para obter células secretoras de insulina a partir de fibroblastos da pele de adultos

O objetivo geral deste procedimento é converter fibroblastos em células secretoras de insulina sem induzir pluripotência ou usar vetores retrovitais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da medicina regenerativa e, em particular, na terapia celular do diabetes. A principal vantagem desta técnica é que podemos obter uma mudança no fenótipo sem induzir um estado pluripotente estável nas células de conversão e sem vetores retrovirais.

Demonstrando o procedimento estará Georgia Pennarossa, pós-doutoranda em nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, adicione 1,5 mililitros de gelatina suína estéril a 0,1% às placas de Petri de 35 milímetros e deixe revestir por duas horas em temperatura ambiente. Em seguida, lave as biópsias de pele humana com PBS suplementado com solução antimicótica antibiótica a 2%.

Em seguida, coloque as biópsias em uma placa de Petri de 100 milímetros e corte-as em fragmentos de aproximadamente dois milímetros cúbicos com bisturis estéreis. Em seguida, coloque de cinco a seis fragmentos de pele na placa de Petri pré-revestida de 35 milímetros. Adicione uma gota de meio fibroblasto sobre cada fragmento e cultive-os a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.

Após seis dias de incubação, descartar cuidadosamente os fragmentos de tecido. Os fibroblastos devem começar a crescer a partir dos fragmentos de tecido e começar a formar uma monocamada celular. Neste procedimento, cultive os fibroblastos a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono até 80% de confluência.

Em seguida, coloque as células em novas placas de cultura. Cultive-os a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono e mantenha a taxa de passagem entre um para dois e um para quatro, dependendo da taxa de crescimento. Em seguida, adicione 0,1% de gelatina suína às placas de cultura de células e deixe revestir por duas horas.

Remova o excesso de solução de revestimento 10 a 30 minutos antes de plaquear os fibroblastos. Em seguida, remova o meio de cultura de fibroblastos das placas de cultura. Lave as células três vezes com PBS suplementado com solução antibiótica antimicótica a 1%.

Em seguida, adicione uma fina camada de solução de tripsina-EDTA. Incube-o a 37 graus Celsius até que a monocamada celular comece a se desprender do fundo da placa de cultura de tecidos e as células se dissociem. Em seguida, diluir a suspensão celular com nove partes do meio de cultura de fibroblastos para neutralizar a ação da tripsina.

Em seguida, conte as células usando uma câmara de contagem ao microscópio à temperatura ambiente. Calcule o volume de meio de cultura de fibroblastos necessário para ressuspender as células e obter a concentração celular de 7,8 vezes 10 elevado ao 4º fibroblasto por centímetro quadrado. Em seguida, centrifugar a suspensão celular a 150 g durante cinco minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda as células com um volume calculado de meio de cultura de fibroblastos. Depois, coloque as células nos pratos pré-revestidos com 0,1% de gelatina e cultive-as por 24 horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. No dia zero, imediatamente antes do uso, prepare a solução estoque de 5-aza-CR dissolvendo 2,44 miligramas de 5-aza-CR em 10 mililitros de meio de alta glicose DMEM.

Esterilize-o por filtração. Em seguida, diluir um microlitro de solução-mãe de 5-aza-CR em um mililitro de meio de cultura de fibroblastos. Para aumentar a plasticidade celular, 24 horas após o plaqueamento celular, remova o meio de cultura dos fibroblastos semeados.

Adicione uma solução estoque micromolar de 5-aza-CR e cultive por 18 horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. No primeiro dia, prepare um novo meio HP. Após a incubação com um micromolar 5-aza-CR, remova o meio e lave as células três vezes com meio HP para garantir que o 5-aza-CR seja enxaguado.

Em seguida, incuabate os fibroblastos tratados com 5-aza-CR com meio HP por três horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Para monitorar a eficiência do tratamento com 5-aza-CR, verifique se há alterações morfológicas. As células devem perder a morfologia alongada típica dos fibroblastos e adquirir uma forma redonda ou oval menor com núcleos aumentados.

Nos dias um a seis, prepare a solução estoque de meio basal pancreático e ativina A. Em seguida, cultive os fibroblastos tratados com 5-aza-CR em meio basal pancreático suplementado com solução estoque de Activin A por seis dias a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono e troque o meio diariamente. Nos dias sete a oito, prepare a solução estoque de ácido retinóico adicionando 16,6 mililitros de DMSO a 50 miligramas de ácido retinóico.

Cultive as células em meio basal pancreático suplementado com solução estoque de Activin A e solução estoque de ácido retinóico por dois dias a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono e troque o meio diariamente. Nos dias nove a 36, cultive as células e o meio basal pancreático suplementado com a solução estoque de ITS, B27 e BFGS e troque o meio diariamente nos primeiros 15 dias e atualize o meio em dias alternados a partir do dia 16. Cultive as células a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.

Esta figura mostra as mudanças morfológicas que ocorrem durante a diferenciação pancreática endócrina. Após sete dias de indução, as células humanas gradualmente se organizam em grupos. Em resposta à adição de ácido retinóico, eles se reorganizam em um padrão reticular e se agrupam em agregados distinguíveis.

Essas formações progridem com o tempo, recrutando células e agregando colônias 3D ampliadas. Finalmente, as colônias tornam-se estruturas esféricas que tendem a se desprender e fluir livremente no meio de cultura, uma reminiscência das ilhotas pancreáticas típicas in vitro. Após 36 dias de indução pancreática, os níveis globais de metilação do DNA das células convertidas epigenéticas humanas retornaram aos observados nos fibroblastos não tratados.

A co-localização de PDX1 com CPEP é observada no final do período de conversão, enquanto esses marcadores pancreáticos endócrinos estão completamente ausentes em fibroblastos não tratados. Este gráfico mostra a quantidade de liberação de insulina das células convertidas epigenéticas em resposta à exposição a 20 milimolares de D-glicose e 20 milimolares de L-glicose. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 38 dias se for executada corretamente.

Após seu desenvolvimento, esta pesquisa abriu caminho para pesquisadores da área de medicina regenerativa explorarem a terapia celular do diabetes em humanos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como converter fibroblastos em células secretoras de insulina sem induzir pluripotência nem usar vetores retrovirais.