Identificação de condições críticas para Immunostaining no Pea Aphid Embriões: Aumento Tissue permeabilidade e diminuir a coloração de fundo

O objetivo geral deste protocolo de imunomarcação é detectar a expressão proteica em embriões de afídeos. São identificadas condições críticas que aumentam a permeabilidade tecidual e reduzem a marcação de fundo, problemas persistentes ao se marcar tecidos embrionários de afídeos. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece condições específicas para uma penetração eficaz dos anticorpos e para a redução da marcação de fundo, aspectos que geralmente não são descritos em um protocolo padrão de imunomarcação.

Tivemos pela primeira vez essa ideia dessa medida quando estávamos estudando como as células germinativas são especificadas em um pulgão-da-ervilha, um modelo de inseto para estudos genômicos e ambientais. A linhagem de laboratório do pulgão-da-ervilha, a. pisum, foi originalmente coletada no centro de Taiwan e tem sido criada em plantas hospedeiras por mais de 300 gerações.

Para germinar, mergulhe as sementes das plantas hospedeiras em água da torneira por três a cinco dias à temperatura ambiente. Reponha a água fresca uma vez por dia. Cultive dez sementes em germinação em um pequeno vaso com solo na câmara de crescimento, sob um fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuro, a 20 graus Celsius.

Aproximadamente 10 dias após o início do crescimento, a altura das plantas geralmente ultrapassa oito centímetros. Mantenha cada vaso de plantas dentro de um béquer de vidro de um litro e transfira os afídeos adultos para as plantas usando um pincel. Em seguida, feche o béquer com uma tampa permeável ao ar, como uma malha de gaze, para impedir que os afídeos escapem.

Incube os afídeos em câmara de crescimento sob um fotoperíodo de 16 horas de luz e oito horas de escuro, a 20 graus Celsius, regando cada vaso de plantas uma vez por dia. Encha um poço de uma placa de análise com cerca de 500 microlitros de paraformaldeído a 4 por cento. Coloque a placa sob um estereomicroscópio com baixa ampliação e submerja um afídeo adulto no paraformaldeído para dissecação.

Disseque os ovários segurando a cabeça e o abdômen com uma pinça, cortando a cutícula dorsal do abdômen e puxando os ovários para fora da cavidade abdominal. Em seguida, fixe três pares de ovários em um tubo de 1,5 mililitro contendo um mililitro de paraformaldeído à temperatura ambiente por 20 minutos, com agitação suave em um agitador. Descarte o tampão de fixação com uma pipeta de vidro e lave os ovários com PBST três vezes por 10 minutos, com agitação suave.

Para tratar os ovários, incube-os primeiro com Proteinase K por 10 minutos com agitação suave para aumentar a permeabilidade dos tecidos embrionários. Após a incubação, descarte a solução de Proteinase K e lave os ovários com 700 microlitros de glicina três vezes por cinco minutos. Em seguida, lave os ovários com PBST duas vezes por 10 minutos.

Fixe novamente os ovários com o tampão de fixação por 15 minutos à temperatura ambiente com agitação suave. Para suprimir a atividade de peroxidase endógena, desidrate serialmente os ovários com diferentes porcentagens de metanol em PBST a 0,2 por cento nas proporções volumétricas de um para três, um para um e três para um, e então incube os ovários adicionalmente com metanol a 100 por cento por uma hora à temperatura ambiente com agitação suave. Em seguida, reidrate serialmente os ovários, conforme instruído no protocolo textual.

Para três pares de ovários em um tubo de 1,5 mililitro, 200 microlitros é o volume mínimo para bloqueio da amostra e coloração com anticorpo. Incube os ovários com a solução de bloqueio DIG-B 1x por quatro horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius, com agitação suave. Após a incubação, descarte o sobrenadante e substitua por solução de bloqueio DIG-B 1x fresca, contendo o anticorpo primário na diluição apropriada.

Incube os ovários por quatro horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius com agitação suave. Após lavar os ovários conforme descrito no protocolo textual, descarte o sobrenadante e substitua por solução bloqueadora DIG-B 1x fresca contendo o anticorpo secundário na diluição apropriada, e realize a coloração dos ovários como anteriormente. Para coloração imunofluorescente, realize a coloração no escuro, porque o anticorpo secundário é sensível à luz.

A espessura dos embriões de afídeos varia entre os estágios de desenvolvimento. Assim, as estratégias de montagem são modificadas para acomodar embriões iniciais, intermediários e tardios. Transfira os ovários, juntamente com o meio de montagem, para a bandeja de células usando uma pipeta de plástico e observe as amostras sob um microscópio estereoscópico com baixa ampliação.

Corte as calosidades associadas ao oviduto lateral usando agulhas para insetos e, em seguida, transfira um ovaríolo isolado para um poço de vidro vazio com uma pipeta. Complete o volume final entre 50 e 100 microlitros usando meio de montagem. Em seguida, transfira um ovaríolo para a lâmina com uma pipeta de vidro.

Disseque câmaras ovocelulares usando pinças para insetos. Para embriões com idade superior à fase seis de desenvolvimento, recomenda-se a separação das câmaras ovocelulares. Para os germários e as duas primeiras câmaras ovocelulares, a separação é opcional.

Transfira uma câmara de ovo dissecada para uma lâmina limpa usando uma pipeta de vidro. Para embriões nas fases um a 10 de desenvolvimento, coloque lentamente uma lamínula sobre os germários ou câmaras de ovo dissecados para evitar bolhas. Alternativamente, para embriões nas fases 11 a 18 de desenvolvimento, monte as câmaras de ovo em uma lâmina com uma ponte de lamínula de um lado só e coloque outra lamínula por cima da amostra.

Para embriões com idade superior à fase 19 de desenvolvimento, monte as câmaras ovulares em uma lâmina com uma ponte de lamínula de dupla face e coloque outra lamínula sobre a amostra. Em seguida, preencha o espaço sob a lamínula superior com meio de montagem para evitar a secagem da amostra. Role suavemente a lamínula superior para obter a orientação adequada para observação.

Por fim, selar a borda das lamínulas, incluindo as lamínulas ponte, com esmalte para unhas antes de realizar a análise de imagem, conforme descrito no protocolo textual. Aqui são mostrados um par de ovários dissecados de uma fêmea adulta. Um ovaríolo é composto por um germário, um a dois sítios O e cinco a sete embriões, todos os quais são acomodados dentro de câmaras ovariolares de maneira semelhante a uma linha de montagem.

Após a fixação com paraformaldeído, recomenda-se altamente a digestão dos ovários em solução de Proteinase K numa concentração de um micrograma por mililitro durante 10 minutos. Os resultados da coloração mostram que a intensidade do sinal aumenta significativamente nos embriões digeridos com Proteinase K. A incubação dos embriões na solução bloqueadora proveniente de um conjunto de tampão baseado em DIG reduz mais a coloração de fundo do que a incubação em soro de cabra normal e albúmina sérica bovina.

A atividade endógena da peroxidase também pode resultar em coloração de fundo elevada. Esses estudos revelam que imergir embriões de afídeos em metanol pode suprimir a atividade da peroxidase de forma muito mais eficiente do que tratar os embriões com peróxido de hidrogênio. As condições críticas reveladas neste estudo podem ser aplicadas para detecção de sinal tanto em células germinativas quanto em células somáticas.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em dois dias, se for executada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar com sucesso a imunomarcação em embriões de afídeos, incluindo a elevação da intensidade do sinal e a redução da marcação de fundo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manipular cada embrião com cuidado para obter uma boa forma dos embriões.

Não se esqueça de que trabalhar com paraformaldeído e DAPI pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento. Após este procedimento, outras medidas, como hibridização *in situ*, podem ser realizadas para responder perguntas adicionais, como se o RNA mensageiro está localizado junto com seu produto proteico nas células embrionárias. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia ambiental de insetos, tais como como as células germinativas são especificadas e como as células ovulares são determinadas em fases reprodutivas distintas em afídeos.