Name: Identificação de condições críticas para Immunostaining no Pea Aphid Embriões: Aumento Tissue permeabilidade e diminuir a coloração de fundo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprenda a otimizar o protocolo de imunomarcação em embriões de Acyrthosiphon pisum, aumentando a permeabilidade tecidual e reduzindo a coloração de fundo. Este método melhora a detecção de proteínas em estudos de biologia do desenvolvimento.

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Somos gratos a Chau-Ti Ting (Fly Core em Taiwan) por fornecer o anticorpo monoclonal 4D9, Technology Commons (TechComm) da Faculdade de Ciências da Vida NTU para microscopia confocal, Hsiao-Ling Lu por revisar o manuscrito e Chen-yo Chung por ajudar nas filmagens. CC agradece particularmente a Charles E. Cook por fornecer sugestões estratégicas e pela edição crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia (101-2313-B-002-059-MY3 e 104-2313-B-002-022-MY3 para GWL e CC) e pela Universidade Nacional de Taiwan (NTU-CESRP 101R4602D3 para CC; 103R4000 para GWL).

1. Cultura de pulgões NOTA:. A cepa laboratorial da parthenogenetic viviparous ervilha pulgão A pisum foram originalmente coletadas no centro de Taiwan e tem sido criados em plantas hospedeiras (a sativum jardim ervilha Pisum ou fava Vicia faba) sob longo dia fotoperíodo para mais de 300 gerações (uma geração: ~ 10 dias). <ol><li> Germinação de sementes <ol><li> Mergulhe as sementes de plantas hospedeiras em água corrente por 3-5 dias em temperatura ambiente. Reabastecer com água fresca, uma vez por dia. NOTA: Como alternativa, colocando sementes de plantas hospedeiras em linha reta em solo úmido pode induzir a germinação também. </li><li> Crescer 10 sementes germinam em uma panela pequena (9 cm de diâmetro x 7 cm de altura) com solo na câmara de crescimento sob fotoperíodo de 16 horas de luz / 8 h escuro, a 20 ° C. </li><li> Cerca de 10 dias após o crescimento começa, transferir pulgões sobre as plantas cuja altura é de mais de 8 cm. </li></ol></li><li> Transferência de pulgões <ol&gt; <li> Mantenha cada vaso de plantas dentro de um copo de vidro de 1 L, transferir 8 pulgões adultos em plantas usando um pincel, e, em seguida, selar o copo com uma tampa permeável ao ar, como malha gaze para evitar a fuga dos pulgões. </li><li> Incubar pulgões em uma câmara de crescimento sob fotoperíodo de 16 horas de luz / 8 h escuro, a 20 ° C. Regue cada vaso de plantas uma vez por dia. </li><li> Para obter a próxima geração de pulgões, reiterar passos 1.1.3-1.2.2 dez dias após a transferência pulgão primário. </li></ol></li></ol> 2. Dissecção e Fixação de Ovários <ol><li> Recentemente preparar 4% de paraformaldeído (PFA) em solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) como o tampão de fixação. </li><li> Encha um poço de uma placa de ponto com PFA (cerca de 500 mL), colocar a placa sob um microscópio estéreo com pequeno aumento, e submergir um pulgão adulto dentro da PFA para dissecção. </li><li> Dissecar ovários, segurando a cabeça e abdômen com um conjunto de pinças, cortando abrir o dorsalcutícula do abdómen, e arrastando os ovários de distância a partir da cavidade abdominal. </li><li> Fix três pares de ovários em um tubo de 1,5 ml contendo 1 ml de PFA à TA durante 20 min. </li><li> Decantar tampão de fixação com uma pipeta de transferência (de vidro ou descartável) e, em seguida, lavar ovários com 0,2% de Triton X-100 em PBS 1x (PBST) 3 vezes durante 10 minutos cada. Leve agitação num misturador / rotador (ângulo de rotação: 60 ° (F60) / velocidade de rotação: 8 RPM) é recomendado tanto para a fixação e lavagem. </li></ol> 3. O tratamento com proteinase K (PK) para aumentar a permeabilidade dos tecidos embrionários NOTA: tratamento PK é aplicada a embriões de extensão banda germe em diante (estágio 11 de desenvolvimento). Para os embriões jovens, este passo é opcional. <ol><li> Serialmente diluir a solução mãe de PK (10 mg / ml) com 1x PBS para a concentração de trabalho de 1 ug / ml. </li><li> Incubar ovários com 1 ug / mL de PK (cerca de 500 mL) durante 10 minutos com agitação suave. </li><li> Decantar PK solutiem seguida, lavar e os ovários com 700 ul de glicina (2 mg / ml) 3 vezes durante 5 minutos cada. </li><li> Lavar ovários com PBST 0,2% duas vezes durante 10 minutos cada. </li><li> Fix ovários novamente com tampão de fixação durante 15 min à temperatura ambiente com agitação suave. </li><li> Elimine o sobrenadante e lava-se com 0,2% ovários PBST duas vezes durante 10 minutos cada. </li></ol> 4. Metanol Incubação para suprimir a peroxidase endógena (POD) atividade NOTA: O metanol incubação não é aplicada aos embriões sujeitos a phalloidin de coloração ou epítopos de anticorpos que são metanol sensível. <ol><li> Desidratar ovários em série com diferentes percentagens de metanol em PBST 0,2% (v / v: 1: 3, 1: 1, 3: 1) através da incubação de ovários em cada concentração da solução de metanol durante 10 min com agitação suave. </li><li> Desidratar ovários com 100% de metanol durante 1 hora à TA com agitação suave. NOTA: Resultados satisfatórios de coloração pode ser ainda obtido a partir de tecidos de pulgões que foram armazenados em 100% de metanol a -20 &amp;# 176; C, durante um mês. </li><li> Seriadamente reidratar ovários com diferentes percentagens de metanol em PBST 0,2% (v / v: 3: 1, 1: 1, 1: 3) através da incubação de ovários em cada concentração da solução de metanol durante 10 min com agitação suave. </li></ol> 5. Coloração de anticorpos <ol><li> Diluir a solução 10x de bloqueio do conjunto tampão à base de DIG (DIG-B) para 1x. NOTA: A solução de bloqueio 1x DIG-B é mais eficaz para a redução da coloração de fundo de reagente padrão de bloqueio composto por 5% (v / v) de soro de cabra normal (NGS) e 0,5% (v / v) de albumina de soro bovino (BSA ) em 0,2% de PBST. </li><li> Incubar os ovários com a solução 1x DIG-B bloqueio durante 2,5 a 4 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C com agitação suave. NOTA: Para três pares de ovários em um tubo de 1,5 ml, 200 ul é o volume mínimo para o bloqueio por amostra e coloração com anticorpo. </li><li> Decantar o sobrenadante e substituir com solução de bloqueio 1x DIG-B fresco contendo o anticorpo primário em diluti apropriadoem proporção. Manchar os ovários durante 4 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C com agitação suave. NOTA: Para o experimento descrito aqui, use as seguintes diluições ideais de anticorpos primários: (1) ApVas1 anticorpos: 1: 500 para a coloração cromogénico, 1:50 para imunofluorescência; (2) anticorpo anti-tubulina α: 1: 500; (3) o anticorpo monoclonal 4D9: 01:25. </li><li> Lavar ovários com 0,2% PBST 4 vezes durante 15 minutos cada. </li><li> Incubar ovários com solução de bloqueio 1x DIG-B durante 1 hora à TA com agitação suave. </li><li> Decantar o sobrenadante e substituir com frescos solução de bloqueio DIG-B 1x contendo anticorpo secundário em razão de diluição apropriado. Manchar os ovários durante 4 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C com agitação suave. <ol><li> Use as seguintes razões de diluição de anticorpos secundários: (1) Para a coloração de imunofluorescência: 1: 500 para Alexa Fluor 633 IgG de cabra anti-coelho ou de cabra Alexa Fluor 488 anti-IgG de ratinho; (2) Para a coloração cromogénico: 1: 200 de IgG de cabra biotinilada anti-coelho. NOTA: O anticorpo secundário biotinilado é aplicada para interagir com o complexo avidina-biotina (ABC) na (cromogénica) a detecção baseada em substrato, através do qual os sinais são amplificados significativamente coloração. </li><li> Para imunofluorescência, realizar coloração no escuro, porque o anticorpo secundário é sensível à luz. </li></ol></li><li> Lavar anticorpo secundário com 0,2% PBST 4 vezes durante 10 minutos cada. </li></ol> 6. Nuclear e F-actina Coloração NOTA: Isto só é aplicada por imunofluorescência. <ol><li> Mancha ovários com 0,2% PBST contendo DAPI (2 ng / ul) e faloidina-TRITC (100 nM) durante 2 horas à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Lavar ovários com 0,2% PBST 4 vezes durante 10 minutos cada. </li><li> Incubar ovários com o meio de montagem O / N a 4 ° C com agitação suave. </li></ol> 7. Desenvolvimento de sinal NOTA: Isto só é aplicada para a coloração cromogênico. <ol><li> Preparação de 100 ul dereagente de avidina-biotina (ABC) para reforçar os sinais através da adição de 1 ml de reagente A (avidina) em 98 ul de 0,2% de PBST, misturando cuidadosamente através de pipetagem suave, e adicionando 1 ml de reagente B (biotina conjugado com peroxidase de rábano ), seguido de mistura imediata. Incubar a mistura durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave. </li><li> Incubar ovários (incluindo as câmaras de ovo dissociados) na mistura de reagentes A e B durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave. </li><li> Lavar a mistura de reagentes A e B com 0,2% de PBST 4 vezes durante 10 minutos cada. </li><li> Transferir ovários submersas em PBST a um poço na placa de ponto com um conta-gotas de plástico. </li><li> Preparar a solução de substrato de 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB): dissolver um comprimido DAB mais outra contendo peróxido de hidrogénio ureia em 1 ml de ddH2O através de vórtice vigoroso durante 1 min. NOTA: DAB, um substrato precipitante de peroxidase, é um cromogénio popular para immunostaining. Ela produz uma brprecipitado insolúvel próprio e depois de ter sido oxidado pelo peroxidase. Os sinais fracos podem ser melhorados pela adição de cloreto de níquel para a solução de substrato (concentração final de 0,05-0,08%). </li><li> Remover a solução de PBST remanescente no poço e voltar a encher com 100 uL da solução de substrato DAB para o desenvolvimento do sinal. </li><li> Monitorar a intensidade de sinais sob um microscópio estéreo em baixa ampliação. </li><li> Pare reacções removendo a solução DAB, seguido de reenchimento com 1x PBS imediatamente. Repita a lavagem duas vezes. </li><li> Transferir ovários de volta para o tubo de 1,5 ml e, em seguida, lava-se com 1x PBS ou PBST duas vezes durante 15 minutos cada. </li><li> Incubar ovários em um meio à base de glicerol de montagem (70% de glicerol) O / N a 4 ° C com agitação suave. </li></ol> 8. Montagem do Aphid Embriões NOTA: A espessura de embriões de afídeos varia entre fases de desenvolvimento. Estratégias de montagem são, portanto, modificado para atender precoces (germaria e encena 0-10), meio (estágios11-18), e tardios embriões (etapas 19-20), que são mostrados na Figura 2B - D. Estadiamento embrionário seguido Miura et al 12. <ol><li> Transferir ovários junto com meio de montagem para a bandeja de celular com um conta-gotas plástico e observar amostras sob um microscópio estéreo em baixa ampliação. </li><li> Corte os cálices associados ao oviduto lateral usando os pinos de insetos e, em seguida, transferir uma ovaríolo isolado para um copo vazio bem com um conta-gotas. Faça-se o volume final de 50-100 ul usando meio de montagem. </li><li> Transferir uma ovaríolo para o slide com um conta-gotas de vidro e depois dissecá câmaras de ovo usando os pinos de insetos. NOTA: Para os embriões com mais de 6 fase de desenvolvimento, sugere a separação de câmaras de ovos; para germaria e as duas primeiras câmaras de ovos com menos de fase 6, a separação é opcional. </li><li> Mudaria de uma câmara de ovo dissecado para uma lâmina limpa usando um conta-gotas de vidro. </li><li> Coloque uma lamela (tamanho: 22 x 22mm) ao longo dos germaria dissecados ou câmaras de ovos (contendo embriões em estágios de desenvolvimento 1-10) lentamente para evitar bolhas. <ol><li> Câmaras de Mount ovo (contendo embriões em estágios do desenvolvimento 11-18) em um slide com a ponte lamela unilateral e colocar outra lamela (tamanho: 18 x 18 mm) no topo da amostra. </li><li> Câmaras de Mount ovo (contendo embriões com idade superior a 19 etapa do desenvolvimento) em um slide com ponte dupla face lamela e colocar outra lamela (tamanho: 18 x 18 mm) no topo da amostra. </li></ol></li><li> Encha o espaço sob o topo lamela com meios de montagem para evitar a secagem da amostra. </li><li> Ligeiramente role o embrião deslizando a lamela para obter a orientação certa para observação. </li><li> Selar em torno da borda de lamelas (incluindo as lamelas ponte) com unha polonês. </li></ol> 9. Análise de Imagem <ol><li> Fotografia contraste de interferência diferencial (DIC) imagens de toda montagem embriões com um compouND microscópio equipado com DIC óptica e uma lente objectiva seco (10X, 20X, 40X) ligado a uma câmara. Instale o software para transferência de imagens entre a câmera eo computador usando as instruções do fabricante. </li><li> Adquirir projeções dos embriões fluorescente etiquetado com uma varredura a laser confocal microscópio 14. Siga as instruções do fabricante para fotografar, z-empilhamento, e projetando 3D com software de imagem. <ol><li> Vire o slide de cabeça para baixo, encontrar a amostra montada com objetivo de 10X, e circundar a área da amostra com uma caneta com base oleada bem. NOTA: Isso faz com identificação da amostra mais fácil quando procurá-lo através de objectivos de um microscópio confocal. </li><li> Adicionar uma gota de óleo na parte superior da área de lamela cujo lado oposto é rotulado como descrito no ponto 9.2.1. </li></ol></li><li> Encontre o plano focal em 40X objetivo de imersão em óleo, em seguida, mudar para um objetivo de imersão em óleo 63X. Mova manualmente o controle de foco fino e fazerwn para capturar o melhor plano focal. NOTA: Para observar detalhes estruturais da germaria e embriões, sugerimos o uso 40X objetivos ou aqueles com maior ampliação. </li><li> Digitalizar o embrião em diferentes canais de excitação e obter uma imagem de z-stack. NOTA: Para tecidos de afídeos de ervilha, reduzir a espessura de cada secção óptica até 1,5 m ou menos. </li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

Identificamos condições óptimas críticas para immunostaining sucesso no pulgão da ervilha A. Pisum, um organismo modelo emergente para estudos genômicos e de desenvolvimento 3,15. Condições otimizadas para aumentar a permeabilidade dos tecidos e reduzindo a coloração de fundo aumentou a intensidade e especificidade dos sinais. Eles diferem de protocolos padrão para a imunocoloração, em outros modelos animais nos passos para a criação de poros em membranas celulares e anticorpo bloqueador a l...

Pulgões são insetos hemípteros com pequenos (1-10 mm) corpos macios. Eles se alimentam de plantas sugando a seiva floema com mouthparts piercing. Além disso, eles contam com uma bactéria endosymbiotic obrigatório, Buchnera aphidicola, para sintetizar aminoácidos essenciais que são deficientes na dieta seiva floema. Pulgões tem uma história de vida complexo que inclui reprodução vivípara parthenogenetic durante a primavera eo verão fotoperíodo longo dia e reprodução ovípara sexual desencadeada por fotoperíodos de curto-dia durante o qual eles estabelecem um número limitado de ovos overwintering 1,2. Na Primavera esses ovos eclodem para produzir a primeira geração de todo-fêmea pulgões (fundatrices), na sequência de muitas rodadas de reprodução parthenogenetic até o outono. A partenogênese cíclico em pulgões, onde fases sexuada e assexuada, alternam no ciclo de vida anual, tem sido considerada como um 1,2 novidade evolucionária. Nos pulgões vivíparos partenogenéticas, Embriogênese ocorre dentro de câmaras de ovos dos túbulos ovarianos (ovaríolos). Em contrapartida, os embriões ovíparos sexuais desenvolver nos ovos fertilizados. Além de plasticidade reprodutiva, os pulgões podem exibir transgeracional polifenismo asa: em resposta a sinais de superlotação e ameaças de predadores, as fêmeas assexuadas unwinged pode vivíparos produzir descendentes voado para a migração de longa distância. Publicação da sequência do genoma do pulgão da ervilha pisum Acyrthosiphon -a primeira sequência de genoma para uma basal inseto-hemimetabolous permite uma maior exploração da plasticidade reprodutiva, asa polifenismo, e outros recursos, incluindo interações inseto-planta, vetorização viral e simbiose em pulgões em um molecular 3 base. Além do genoma sequenciado, ferramentas para caracterizar expressão e função do gene são necessários para promover o afídeo da ervilha como um organismo modelo 4 madura. Nós descrevemos protocolos robustos de todo-mount <em&gt; hibridação in situ para detectar a expressão de ARNm em embriões de afídeos 5-7. Interferência de RNA (RNAi), através de injecção de ARN de cadeia dupla e de alimentação foi usado para silenciamento de genes em ninfas de afídeos e adultos, mas condições estáveis ​​para o gene knockdown nos embriões não foram ainda relatados 8-10. A imunocoloração, uma abordagem baseada em anticorpo que se pode detectar a expressão de proteínas em amostras antes e depois de ARNi knockdown, foi realizada em embriões de ervilha 11-13 afídeos. No entanto, o aumento da permeabilidade do tecido e a eliminação de coloração de fundo é ainda insatisfatória utilizando protocolos convencionais para a imunocoloração nas embriões vivíparos assexuadas de ervilha pulgão. Por exemplo, verificou-se que a penetração do anticorpo aos tecidos diminuiu em embriões gastrulating (fases 8-10) e que os embriões com brotos dos membros morfologicamente identificáveis ​​(etapas 13-14) eram pouco permeável ao anticorpo. Além disso, a coloração de fundo foi visualizado no viviparo assexuadaUS embriões de afídeos de ervilha coradas utilizando o anticorpo contra o marcador da linha germinativa dos vasos, bem como contra a proteína que Engrailed / Invected expressa nos segmentos embrionárias 12,13. Na verdade, a coloração de fundo foi ainda claramente visível em embriões corados com o anticorpo secundário sozinho. A fim de aumentar a permeabilidade, sem danificar a integridade dos tecidos de afídeos, cuidadosamente titulada a concentração de proteinase K e determinaram as condições óptimas para a digestão de tecidos de embriões de afídeos. A fim de evitar coloração não específica na ervilha pulgão, temos procurado por compostos que poderia bloquear eficazmente os embriões e suprimir a actividade endógena de peroxidase (POD), uma enzima utilizada para amplificar os sinais durante a imunocoloração. Um reagente de bloqueio proporcionada por uma digoxigenina (DIG) -based conjunto tampão, em vez do soro de cabra normal utilizado tradicionalmente (NGS) / albumina do soro bovino (BSA), reduziu significativamente a coloração de fundo. Além disso, o metanol foi encontrado para inhimordeu a actividade POD endógena mais eficaz do que o peróxido de hidrogénio (H 2 O 2). Os detalhes a respeito dessas condições específicas de afídeos para immunostaining sobre os embriões serão descritos nas seções a seguir.

<table><tbody><tr><td>30% de perxidase de hidrogênio (H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18304</td><td>Para branqueamento de peroxidase endógena de embriões.</td></tr><tr><td>4' Dicloridrato de 6-diamidino-2-fenil-indol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Para rotular o DNA de fita dupla. TÓXICO. Use luvas, dispense em pequenas alíquotas e feche para minimizar a exposição</td></tr><tr><td>4D9 anticorpo monoclonal de camundongo anti-engrailed/invected</td><td>Estudos de desenvolvimento banco de hibridoma</td><td>AB_528224</td><td>Para rotular os segmentos em desenvolvimento do embrião.</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonal de coelho ApVas1</td><td>Nosso laboratório</td><td>N / A</td><td>Para rotular a proteína Vas1 específica da linha germinativa do pulgão em embriões. Este anticorpo foi feito pelo nosso laboratório.&nbsp;</td></tr><tr><td>Austerlitz Alfinetes de insetos</td><td>ENTOMORAVIA</td><td>N/A</td><td>Para separar cada câmara de ovo de um ovario. Tamanho 000, ESMALTADO PRETO.&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Para bloquear a ligação não específica de anticorpos.</td></tr><tr><td>Câmera conectada ao microscópio composto</td><td>Canon</td><td>EOS 5D</td><td>Para fotografar embriões de pulgões.</td></tr><tr><td>Bandeja colorimétrica de 8 células</td><td>Kartell Labware</td><td>357</td><td>Para desenvolver o sinal de coloração de embriões de pulgões. Diâmetro 95 x 57 mm, profundidade da célula 2 mm.</td></tr><tr><td>Microscópio composto com óptica DIC</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMR</td><td>Para fotografar embriões de pulgões montados nas lâminas.</td></tr><tr><td>Conjunto de tampão de lavagem e bloqueio DIG</td><td>Sigma-Aldrich (Roche)</td><td>11585762001</td><td>Para bloquear a ligação não específica de anticorpos. Diluímos a solução de bloqueio 10x em 1x como reagente bloqueador.</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Ideal-tek</td><td>N/A</td><td>Para dissecção de ovários de pulgões. Peça do fabricante nº 5: 5 SA.&nbsp;</td></tr><tr><td>Conta-gotas de vidro</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para transferir ovários de pulgões da placa de splot para tubos. 150 mm de comprimento total e 5 3/4" de comprimento da ponta.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Para limpeza de embriões de pulgões e montagem.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>N/A</td><td>Para bloquear a atividade enzimática da proteinase K (PK).</td></tr><tr><td>IgG anti-camundongo de cabra conjugado Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td>Para detecção de anticorpo primário de camundongo.</td></tr><tr><td>IgG anti-coelho de cabra conjugado Alexa Fluor 633</td><td>Invitrogen</td><td>A21072</td><td>Para detecção de anticorpo primário de coelho.</td></tr><tr><td>Misturador Intelli</td><td>Equipamento de laboratório ELMI</td><td>RM-2M</td><td>Para melhorar a reação completa de reagentes com ovários.</td></tr><tr><td>Microscopia confocal de varredura a laser</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>Para fotografar embriões de pulgões montados nas lâminas com etiqueta recente.</td></tr><tr><td>metanol&nbsp;</td><td>Burdick e Jackson</td><td>AH2304</td><td>Para branqueamento da peroxidase endógena de embriões.</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Thermo scientific</td><td>10143560</td><td>Para montagem de embriões. Bordas retificadas SUPERFROST, ca./env. 76 x 26 mm.</td></tr><tr><td>Microscópio Óculos de cobertura</td><td>Marienfeld</td><td>0101030</td><td>Para montar embriões nas lâminas. Tamanho 18 x 18 mm. Espessura nº 1 (0,13 a 0,16 mm)</td></tr><tr><td>Microscópio Óculos de cobertura</td><td>Marienfeld</td><td>0101050</td><td>Para montagem de embriões nas lâminas. Tamanho 22 x 22 mm. Espessura nº 1 (0,13 a 0,16 mm)</td></tr> <tr><td>anticorpo monoclonal anti-alfatubulina de camundongo (DM1A)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32293</td><td>Para rotular a distribuição de alfa-tubulina das células.</td></tr><tr><td>Verniz</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para selar as lamínulas nas corrediças.</td></tr><tr><td>Soro de cabra normal (NGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>Para bloquear a ligação não específica de anticorpos.</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td>Para fixação de ovários de pulgões.</td></tr><tr><td>Faloidina-TRITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td>Para rotular a distribuição de F-actina em embriões.</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Como solução isotônica para ovários de pulgões.</td></tr><tr><td>Conta-gotas de plástico</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para transferir ovários de pulgões do tubo para a bandeja de células. Tamanho 3 ml.&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Merck</td><td>124678</td><td>Para criar poros (perfuração) na membrana celular e facilitar o acesso de anticorpos.&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de ponto de pirex</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para dissecção e reações de cor de ovários de pulgões sob microscopia. Cada cavidade com diâmetro de 22 mm e&nbsp; profundidade 7 mm.</td></tr><tr><td>SIGMAFAST 3,3'-diaminobenzidina (DAB) comprimidos&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4168</td><td>Para o desenvolvimento de sinais com substrato. Também chamado de conjunto de comprimidos de substrato de peroxidase DAB.</td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>Leica Microsystems</td><td>EZ4</td><td>Para dissecção e observação de ovários de pulgões.</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Para criar poros (perfuração) na membrana celular.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit VECTASHIELD Elite ABC (Rabbit IgG)</td><td>Laboratórios vetoriais</td><td>PK-6101</td><td>Para aprimoramento do sinal. Incluindo anticorpo secundário IgG anti-coelho biotinilado de cabra, reagentes A e B.</td></tr><tr><td>Meio de montagem VECTASHIELD</td><td>Vector laboratories</td><td>H1000</td><td>Para limpeza de embriões de pulgões e montagem.</td></tr></tbody></table>

identificação de condições críticas para immunostaining no pea aphid embriões: aumento tissue permeabilidade e diminuir a coloração de fundo

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

O Acyrthosiphon pisum ervilha pulgão, com um genoma seqüenciado e abundante plasticidade fenotípica, tornou-se um modelo emergente para estudos genômicos e de desenvolvimento. Como outros pulgões, A. Pisum propagar rapidamente via reprodução vivípara parthenogenetic, onde os embriões se desenvolvem dentro de câmaras de ovo em uma forma de linha de montagem na ovaríolo. Anteriormente nós estabelecemos uma plataforma robusta de todo-mount hibridização in situ permitindo a detecção da expressão de mRNA nos embriões de afídeos. Para analisar a expressão de proteínas, no entanto, os protocolos estabelecidos para a imunocoloração os ovarioles de pulgões assexuadas vivíparos não produziu resultados satisfatórios. Aqui nós relatamos condições otimizadas para aumentar a permeabilidade dos tecidos e diminuição da coloração de fundo, sendo que ambos foram problemas ao aplicar abordagens estabelecidas. Optimizações incluem: (1) incubação de proteinase K (1 ug / ml, 10 min), o qual foi encontrado f essencialou a penetração de anticorpos em embriões de médio e em estágio final de pulgões; (2) a substituição de albumina sérica de soro de cabra / bovina normal com um reagente de bloqueio fornecido por um digoxigenina (DIG) -based conjunto de tampões e (3) aplicação de metanol em vez de peróxido de hidrogénio (H 2 O 2) para o branqueamento da peroxidase endógena; que reduziu significativamente a coloração de fundo nos tecidos de afídeos. Estas condições críticas optimizadas para imunocoloração permitirá a detecção eficaz de produtos de genes em embriões de A. Pisum e outros pulgões.

Neste estudo, realizamos todo mount-immunostaining em embriões de afídeos de ervilha assexuados (Figura 1A). Estas fêmeas produzir descendentes partenogeneticamente e vivíparos. Estes embriões femininos se desenvolvem em câmaras de ovo dos túbulos do ovário (ovarioles) (Figura 1B e Figura 2A). Antes de microscopia, os ovaríolos dissecados são os alvos de coloração; No entanto, a separação de câmaras de ovo é necessário p...

Um protocolo de imunocoloração de montagem total em embriões de pulgões é apresentado, no qual são abordadas as condições críticas para diminuir a coloração de fundo e aumentar a permeabilidade do tecido. Essas condições são desenvolvidas especificamente para a detecção eficaz da expressão de proteínas nos tecidos embrionários de pulgões.

Identificação de condições críticas para Immunostaining no Pea Aphid Embriões: Aumento Tissue permeabilidade e diminuir a coloração de fundo

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

O objetivo geral deste protocolo de imunomarcação é detectar a expressão proteica em embriões de afídeos. São identificadas condições críticas que aumentam a permeabilidade tecidual e reduzem a marcação de fundo, problemas persistentes ao se marcar tecidos embrionários de afídeos. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece condições específicas para uma penetração eficaz dos anticorpos e para a redução da marcação de fundo, aspectos que geralmente não são descritos em um protocolo padrão de imunomarcação.Tivemos pela primeira vez essa ideia dessa medida quando estávamos estudando como as células germinativas são especificadas em um pulgão-da-ervilha, um modelo de inseto para estudos genômicos e ambientais. A linhagem de laboratório do pulgão-da-ervilha, a. pisum, foi originalmente coletada no centro de Taiwan e tem sido criada em plantas hospedeiras por mais de 300 gerações.Para germinar, mergulhe as sementes das plantas hospedeiras em água da torneira por três a cinco dias à temperatura ambiente. Reponha a água fresca uma vez por dia. Cultive dez sementes em germinação em um pequeno vaso com solo na câmara de crescimento, sob um fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuro, a 20 graus Celsius.Aproximadamente 10 dias após o início do crescimento, a altura das plantas geralmente ultrapassa oito centímetros. Mantenha cada vaso de plantas dentro de um béquer de vidro de um litro e transfira os afídeos adultos para as plantas usando um pincel. Em seguida, feche o béquer com uma tampa permeável ao ar, como uma malha de gaze, para impedir que os afídeos escapem.Incube os afídeos em câmara de crescimento sob um fotoperíodo de 16 horas de luz e oito horas de escuro, a 20 graus Celsius, regando cada vaso de plantas uma vez por dia. Encha um poço de uma placa de análise com cerca de 500 microlitros de paraformaldeído a 4 por cento. Coloque a placa sob um estereomicroscópio com baixa ampliação e submerja um afídeo adulto no paraformaldeído para dissecação.Disseque os ovários segurando a cabeça e o abdômen com uma pinça, cortando a cutícula dorsal do abdômen e puxando os ovários para fora da cavidade abdominal. Em seguida, fixe três pares de ovários em um tubo de 1,5 mililitro contendo um mililitro de paraformaldeído à temperatura ambiente por 20 minutos, com agitação suave em um agitador. Descarte o tampão de fixação com uma pipeta de vidro e lave os ovários com PBST três vezes por 10 minutos, com agitação suave.Para tratar os ovários, incube-os primeiro com Proteinase K por 10 minutos com agitação suave para aumentar a permeabilidade dos tecidos embrionários. Após a incubação, descarte a solução de Proteinase K e lave os ovários com 700 microlitros de glicina três vezes por cinco minutos. Em seguida, lave os ovários com PBST duas vezes por 10 minutos.Fixe novamente os ovários com o tampão de fixação por 15 minutos à temperatura ambiente com agitação suave. Para suprimir a atividade de peroxidase endógena, desidrate serialmente os ovários com diferentes porcentagens de metanol em PBST a 0,2 por cento nas proporções volumétricas de um para três, um para um e três para um, e então incube os ovários adicionalmente com metanol a 100 por cento por uma hora à temperatura ambiente com agitação suave. Em seguida, reidrate serialmente os ovários, conforme instruído no protocolo textual.Para três pares de ovários em um tubo de 1,5 mililitro, 200 microlitros é o volume mínimo para bloqueio da amostra e coloração com anticorpo. Incube os ovários com a solução de bloqueio DIG-B 1x por quatro horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius, com agitação suave. Após a incubação, descarte o sobrenadante e substitua por solução de bloqueio DIG-B 1x fresca, contendo o anticorpo primário na diluição apropriada.Incube os ovários por quatro horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius com agitação suave. Após lavar os ovários conforme descrito no protocolo textual, descarte o sobrenadante e substitua por solução bloqueadora DIG-B 1x fresca contendo o anticorpo secundário na diluição apropriada, e realize a coloração dos ovários como anteriormente. Para coloração imunofluorescente, realize a coloração no escuro, porque o anticorpo secundário é sensível à luz.A espessura dos embriões de afídeos varia entre os estágios de desenvolvimento. Assim, as estratégias de montagem são modificadas para acomodar embriões iniciais, intermediários e tardios. Transfira os ovários, juntamente com o meio de montagem, para a bandeja de células usando uma pipeta de plástico e observe as amostras sob um microscópio estereoscópico com baixa ampliação.Corte as calosidades associadas ao oviduto lateral usando agulhas para insetos e, em seguida, transfira um ovaríolo isolado para um poço de vidro vazio com uma pipeta. Complete o volume final entre 50 e 100 microlitros usando meio de montagem. Em seguida, transfira um ovaríolo para a lâmina com uma pipeta de vidro.Disseque câmaras ovocelulares usando pinças para insetos. Para embriões com idade superior à fase seis de desenvolvimento, recomenda-se a separação das câmaras ovocelulares. Para os germários e as duas primeiras câmaras ovocelulares, a separação é opcional.Transfira uma câmara de ovo dissecada para uma lâmina limpa usando uma pipeta de vidro. Para embriões nas fases um a 10 de desenvolvimento, coloque lentamente uma lamínula sobre os germários ou câmaras de ovo dissecados para evitar bolhas. Alternativamente, para embriões nas fases 11 a 18 de desenvolvimento, monte as câmaras de ovo em uma lâmina com uma ponte de lamínula de um lado só e coloque outra lamínula por cima da amostra.Para embriões com idade superior à fase 19 de desenvolvimento, monte as câmaras ovulares em uma lâmina com uma ponte de lamínula de dupla face e coloque outra lamínula sobre a amostra. Em seguida, preencha o espaço sob a lamínula superior com meio de montagem para evitar a secagem da amostra. Role suavemente a lamínula superior para obter a orientação adequada para observação.Por fim, selar a borda das lamínulas, incluindo as lamínulas ponte, com esmalte para unhas antes de realizar a análise de imagem, conforme descrito no protocolo textual. Aqui são mostrados um par de ovários dissecados de uma fêmea adulta. Um ovaríolo é composto por um germário, um a dois sítios O e cinco a sete embriões, todos os quais são acomodados dentro de câmaras ovariolares de maneira semelhante a uma linha de montagem.Após a fixação com paraformaldeído, recomenda-se altamente a digestão dos ovários em solução de Proteinase K numa concentração de um micrograma por mililitro durante 10 minutos. Os resultados da coloração mostram que a intensidade do sinal aumenta significativamente nos embriões digeridos com Proteinase K. A incubação dos embriões na solução bloqueadora proveniente de um conjunto de tampão baseado em DIG reduz mais a coloração de fundo do que a incubação em soro de cabra normal e albúmina sérica bovina.A atividade endógena da peroxidase também pode resultar em coloração de fundo elevada. Esses estudos revelam que imergir embriões de afídeos em metanol pode suprimir a atividade da peroxidase de forma muito mais eficiente do que tratar os embriões com peróxido de hidrogênio. As condições críticas reveladas neste estudo podem ser aplicadas para detecção de sinal tanto em células germinativas quanto em células somáticas.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em dois dias, se for executada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar com sucesso a imunomarcação em embriões de afídeos, incluindo a elevação da intensidade do sinal e a redução da marcação de fundo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manipular cada embrião com cuidado para obter uma boa forma dos embriões.Não se esqueça de que trabalhar com paraformaldeído e DAPI pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento. Após este procedimento, outras medidas, como hibridização *in situ*, podem ser realizadas para responder perguntas adicionais, como se o RNA mensageiro está localizado junto com seu produto proteico nas células embrionárias. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia ambiental de insetos, tais como como as células germinativas são especificadas e como as células ovulares são determinadas em fases reprodutivas distintas em afídeos.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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Identificação de condições críticas para Immunostaining no Pea Aphid Embriões: Aumento Tissue permeabilidade e diminuir a coloração de fundo (Vídeo) | JoVE Journal

Identificação de condições críticas para Immunostaining no Pea Aphid Embriões: Aumento Tissue permeabilidade e diminuir a coloração de fundo

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