Name: Establishment of Cancer Stem Cell Cultures de Human osteossarcoma convencional (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco cancerígenas de osteossarcoma humano usando o ensaio de formação de sarcóferas. Este protocolo visual demonstra a cultura de esferas e marcação de células-tronco para pesquisa oncológica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudo foi apoiado pela ITT (Istituto Toscano Tumori) Grant Proposal 2010.

<ol><li>Reddick, R. L., Michelitch, H. J., Levine, A. M., Triche, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+sarcoma%3A+a+study+of+the+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Osteogenic sarcoma: a study of the ultrastructure.</a> Cancer. 45 (1), 64-71 (1980).</li>
<li>Gatta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Childhood+cancer+survival+trends+in+Europe%3A+a+EUROCARE+Working+Group+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Childhood cancer survival trends in Europe: a EUROCARE Working Group study.</a> J. Clin. Oncol. 23 (16), 3742-3751 (2005).</li>
<li>Olstad, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+heterogeneity+in+human+osteosarcoma+demonstrated+by+enriched+mRNAs+isolated+by+directional+tag+PCR+subtraction+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular heterogeneity in human osteosarcoma demonstrated by enriched mRNAs isolated by directional tag PCR subtraction cloning.</a> Anticancer. Res. 23 (3B), 2201-2216 (2003).</li>
<li>Geller, D. S., Gorlick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma%3A+a+review+of+diagnosis%2C+management%2C+and+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Adv+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma: a review of diagnosis, management, and treatment strategies.</a> Clin Adv Hematol Oncol. 8 (10), 705-718 (2010).</li>
<li>Tang, N., Song, W. X., Luo, J., Haydon, R. C., He, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+development+and+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma development and stem cell differentiation.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 466 (9), 2114-2130 (2008).</li>
<li>Kempf-Bielack, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+relapse+after+combined+modality+therapy%3A+an+analysis+of+unselected+patients+in+the+Cooperative+Osteosarcoma+Study+Group+%28COSS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma relapse after combined modality therapy: an analysis of unselected patients in the Cooperative Osteosarcoma Study Group (COSS).</a> J. Clin. Oncol. 23 (3), 559-568 (2005).</li>
<li>Meyers, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma%3A+a+randomized%2C+prospective+trial+of+the+addition+of+ifosfamide+and%2For+muramyl+tripeptide+to+cisplatin%2C+doxorubicin%2C+and+high-dose+methotrexate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma: a randomized, prospective trial of the addition of ifosfamide and/or muramyl tripeptide to cisplatin, doxorubicin, and high-dose methotrexate.</a> J. Clin. Oncol. 23 (9), 2004-2011 (2005).</li>
<li>Gorlick, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+childhood+osteogenic+sarcoma+and+potential+targets+for+therapeutic+development%3A+meeting+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Biology of childhood osteogenic sarcoma and potential targets for therapeutic development: meeting summary.</a> Clin. Cancer Res. 9 (15), 5442-5453 (2003).</li>
<li>Hayden, J. B., Hoang, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma%3A+basic+science+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop.+Clin.+North+Am%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma: basic science and clinical implications.</a> Orthop. Clin. North Am. 37 (1), 1-7 (2006).</li>
<li>Thomas, D., Kansara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+modifications+in+osteogenic+differentiation+and+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Epigenetic modifications in osteogenic differentiation and transformation.</a> J. Cell. Biochem. 98 (4), 757-769 (2006).</li>
<li>Araki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+retinoblastoma+gene+in+primary+osteosarcomas+and+other+bone+and+soft-tissue+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of the retinoblastoma gene in primary osteosarcomas and other bone and soft-tissue tumors.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 270 (270), 271-277 (1991).</li>
<li>Chou, A. J., Gorlick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+resistance+in+osteosarcoma%3A+current+challenges+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Anticancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy resistance in osteosarcoma: current challenges and future directions.</a> Expert. Rev. Anticancer Ther. 6 (7), 1075-1085 (2006).</li>
<li>Arndt, C. A. S., Crist, W. M. Common musculoskeletal tumorsof childhood and adolescence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArndt%2C+CAS+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. 341 (5), 342-352 (1999).</li>
<li>Longhi, A., Errani, C., De Paolis, M., Mercuri, M., Bacci, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+bone+osteosarcoma+in+the+pediatric+age%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Treat.+Rev%22%5BJournal%5D)">Primary bone osteosarcoma in the pediatric age: state of the art.</a> Cancer. Treat. Rev. 32 (6), 423-436 (2006).</li>
<li>Bacci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+outcome+for+patients+with+nonmetastatic+osteosarcoma+of+the+extremity+treated+at+the+istituto+ortopedico+rizzoli+according+to+the+istituto+ortopedico+rizzoli%2Fosteosarcoma-2+protocol%3A+an+updated+report%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Long-term outcome for patients with nonmetastatic osteosarcoma of the extremity treated at the istituto ortopedico rizzoli according to the istituto ortopedico rizzoli/osteosarcoma-2 protocol: an updated report.</a> J. Clin. Oncol. 18 (24), 4016-4027 (2000).</li>
<li>Clarke, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells-perspectives+on+current+status+and+future+directions%3A+AACR+workshop+on+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells-perspectives on current status and future directions: AACR workshop on cancer stem cells.</a> Cancer. Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).</li>
<li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li>
<li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nat. Med. 3 (7), 730-737 (1997).</li>
<li>Visvader, J. E., Lindeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+solid+tumors%3A+accumulating+evidence+and+unresolved+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in solid tumors: accumulating evidence and unresolved questions.</a> Nat. Rev. Cancer. 8 (10), 755-768 (2008).</li>
<li>Bapat, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of cancer stem cells.</a> Semin. Cancer Biol. 17 (3), 204-213 (2007).</li>
<li>Rubio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+human+adult+stem+cell+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Spontaneous human adult stem cell transformation.</a> Cancer. Res. 65 (8), 3035-3039 (2005).</li>
<li>Burns, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenic+heterogeneity+in+cancer+stem+cells+evolved+from+long-term+cultures+of+telomerase-immortalized+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Tumorigenic heterogeneity in cancer stem cells evolved from long-term cultures of telomerase-immortalized human mesenchymal stem cells.</a> Cancer. Res. 65 (8), 3126-3135 (2005).</li>
<li>Zhang, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+etiology+and+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the etiology and treatment of cancer.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 16 (1), 60-64 (2006).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+transgenes+encoding+components+of+the+Wnt+signaling+pathway+preferentially+induce+mammary+cancers+from+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Evidence that transgenes encoding components of the Wnt signaling pathway preferentially induce mammary cancers from progenitor cells.</a> Proc. Natl Acad. Sci. USA. 100 (26), 15853-15858 (2003).</li>
<li>Sell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origin+of+cancer%3A+dedifferentiation+or+stem+cell+maturation+arrest%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Cellular origin of cancer: dedifferentiation or stem cell maturation arrest?</a> Environ Health Perspect. 101 (Suppl 5), 15-26 (1993).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).</li>
<li>Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+of+oct-3%2F4+defines+differentiation%2C+dedifferentiation+or+self-renewal+of+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression of oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells.</a> Nat. Genet. 24 (4), 372-376 (2000).</li>
<li>Hochedlinger, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+reprogramming+and+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear reprogramming and pluripotency.</a> Nature. 441 (7097), 1061-1067 (2006).</li>
<li>Dean, M., Fojo, T., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stem+cells+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor stem cells and drug resistance.</a> Nat. Rev. Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).</li>
<li>Ma, S., Lee, T. K., Zheng, B. J., Chan, K. W., Guan, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+HCC+cancer+stem+cells+confer+chemoresistance+by+preferential+expression+of+the+Akt%2FPKB+survival+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">CD133+ HCC cancer stem cells confer chemoresistance by preferential expression of the Akt/PKB survival pathway.</a> Oncogene. 27 (12), 1749-1758 (2008).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+cells+isolated+from+mesenchymal+neoplasms+have+tumor+initiating+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Side population cells isolated from mesenchymal neoplasms have tumor initiating potential.</a> Cancer. Res. 67 (17), 8216-8222 (2007).</li>
<li>Ma, I., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+human+aldehyde+dehydrogenase+in+normal+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem.+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">The role of human aldehyde dehydrogenase in normal and cancer stem cells.</a> Stem. Cell. Rev. 7 (2), 292-306 (2011).</li>
<li>Awad, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+ALDH+activity+identifies+chemotherapy-resistant+Ewing%27s+sarcoma+stem+cells+that+retain+sensitivity+to+EWS-FLI1+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High ALDH activity identifies chemotherapy-resistant Ewing's sarcoma stem cells that retain sensitivity to EWS-FLI1 inhibition.</a> PLoS One. 5 (11), e13943(2010).</li>
<li>Fujii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphere-forming+stem-like+cell+populations+with+drug+resistance+in+human+sarcoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Sphere-forming stem-like cell populations with drug resistance in human sarcoma cell lines.</a> Int. J. Oncol. 34 (5), 1381-1386 (2009).</li>
<li>Di Fiore, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+molecular+characterization+of+the+human+osteosarcoma+3AB-OS+cancer+stem+cell+line%3A+a+possible+model+for+studying+osteosarcoma+origin+and+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetic and molecular characterization of the human osteosarcoma 3AB-OS cancer stem cell line: a possible model for studying osteosarcoma origin and stemness.</a> J. Cell. Physiol. 228 (6), 1189-1201 (2013).</li>
<li>Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotent+EGF-responsive+striatal+embryonicprogenitor+cell+produces+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A multipotent EGF-responsive striatal embryonicprogenitor cell produces neurons and astrocytes.</a> J. Neurosci. 12 (11), 4565-4574 (1992).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Gibbs, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-like+cells+in+bone+sarcomas%3A+implications+for+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Stem-like cells in bone sarcomas: implications for tumorigenesis.</a> Neoplasia. 7 (11), 967-976 (2005).</li>
<li>Beccari, N., Mazzi, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeccari%2C+N+%22Manuale+di+tecnica+microscopic.+Casa+Editrice+Dr.+Francesco+Vallardi+Societ%C3%A0+Editrice+Libraria%22">Manuale di tecnica microscopic. Casa Editrice Dr. Francesco Vallardi Società Editrice Libraria</a>. , 99-100 (1966).</li>
<li>Majumdar, M. K., Thiede, M. A., Mosca, J. D., Moorman, M., Gerson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+comparison+of+cultures+of+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+%28MSCs%29+and+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells.</a> J. Cell. Physiol. 176 (1), 57-66 (1998).</li>
<li>Tirino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+bone+sarcomas+contain+CD133%2B+cancer+stem+cells+displaying+high+tumorigenicity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Human primary bone sarcomas contain CD133+ cancer stem cells displaying high tumorigenicity in vivo.</a> FASEB J. 25 (6), 2022-2030 (2011).</li>
<li>Tirino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+solid+tumors%3A+an+overview+and+new+approaches+for+their+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization.</a> FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).</li>
<li>Martins-Neves, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+implications+of+an+enriched+cancer+stem-like+cell+population+in+a+human+osteosarcoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Therapeutic implications of an enriched cancer stem-like cell population in a human osteosarcoma cell line.</a> BMC Cancer. 12 (1), 139(2012).</li>
<li>Tang, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+osteosarcoma+stem+cells+by+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chin.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Enrichment of osteosarcoma stem cells by chemotherapy.</a> Chin. J. Cancer. 30 (6), 426-432 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesse financeiro conflitante.

CSCs têm várias propriedades que permitem a identificação deste subconjunto celular particular na massa do tumor. Na base destas características, tais como resistência adquirida à citotóxica agentes de quimioterapia para a sobre-expressão de ATP-ligação cassete multidrogas transportadores de efluxo 28, 32, 33, ou para a regulação positiva da expressão de enzimas de desintoxicação tais como ALDH 32, para a expressão de um marcador de superfície específico, como CD133, CD44, CD34, CD90, e outros 30, 34, 35, 41, vários métodos diferentes para isolar CSCs foram desenvolvidos 42-44. Uma dessas técnicas é o ensaio de formação de esfera, que se baseia na capacidade das CSCs a crescer sob condições de não-aderentes. A capacidade das células-tronco de tecidos e CSCs para formar esferas foi descrita pela primeira vez em estudos sobre a identificação de células-tronco neurais por Reynolds et al. 37. Subsequentemente, Gibbs et ai. 38 nósEd estes estudos para começar a isolar CSCs de tumores sólidos, em particular, a partir de sarcomas ósseos. Decidimos usar o método de ensaio de formação de esfera ilustrado por Gibbs et al. Isolar CSCs de linhas celulares OSA obtidos a partir de biópsias OS convencionais. Nós adaptado o método original para melhorar os resultados deste ensaio e para facilitar a sua reprodutibilidade por outras linhas de células de cancro. Com referência à realização do ensaio de formação de esfera, verificou-se que o plaqueamento 40.000 células / poço é uma boa prática para a manutenção de células em isolamento no início do ensaio. Este truque é muito importante para evitar a possibilidade de que as colónias esféricas são originários de agregação celular e não a partir da capacidade particular e exclusivo de um único CSC a crescer sob condições de não-aderentes e formar uma colónia esférica. Esta capacidade é um ponto particularmente crítico deste ensaio. Nós também certificou que para obter uma boa taxa de formação de esfera, É suficiente para refrescar alíquotas de factores de crescimento a cada 3 d e não todos os dias, como descrito no método original. No presente estudo, nós também estabelecido e amplamente descrito um bom método para o isolamento das colónias esféricas que se formaram, quando cultivadas sob condições não-aderentes. Este passo é crítico neste ensaio, porque é muito importante para tentar isolar o maior número de esferas quanto possível, que são formadas em cada poço sem danificá-los. É também importante para isolar apenas as esferas e não as células individuais, que podem permanecer em suspensão durante a duração do ensaio. Para superar estes pontos críticos, temos desenvolvido um método de isolamento em particular, que, conforme mostrado acima, deu bons resultados para o isolamento CSC. Obviamente, existe a possibilidade de que nem todas as esferas que se formaram pode ser recuperada, mas a percentagem de perda é muito baixa. Na verdade, temos também a possibilidade de usar um filtro com 40 mm poros para isolar esferas depois que eles se tornam grandes (formaed cerca de 100-200 células). Este isolamento pára a formação de esfera, mas permite que as células individuais, parte do resíduo de metilcelulose, e as mais pequenas esferas para ser filtrada. Esta eliminação é realizada por meio de filtração profunda, tal como descrito no protocolo. Além disso, a selecção das maiores colónias esféricas através dos 40 uM de malha com a consequente perda das colónias mais pequenas esféricas permite seleccionar os CSCs com a maior capacidade para formar colónias esféricas e com maior stemness. Todas estas modificações foram realizadas para melhorar o ensaio e para ajudar os investigadores que estudam CSCs de compreender e reproduzir a etapa mais crítica do método original de ensaio de formação de esfera. Entre os estudos sobre métodos in vitro para CSCs de isolamento, este estudo teve como objetivo mostrar como esse ensaio de formação de esfera adaptada poderia ser um bom método para isolar CSCs delinhas de células SAOS. As adaptações para o método original e a técnica de isolamento detalhada descrito melhorar a sua eficácia. Num curto espaço de tempo, um bom número de CSCs podem ser obtidas e usadas para várias experiências. Portanto, é possível confirmar rapidamente os fenótipos tronco-like e, em particular, para estudar o fenótipo estaminais-como dupla que caracteriza OS-CSCs. Assim, este ensaio pode ser modificado uma boa técnica para isolar e estudar os CSCs sua biologia. No futuro, este método, com adaptações adicionais, podem também ser utilizados para isolar os CSCs de outras linhas celulares de cancro finito obtidos por biópsias de tumores sólidos raras. A possibilidade de isolar CSCs de tumores sólidos raras, tais como SO, não apenas permite a melhoria de estudos sobre o cancro em particular, mas também se estende para estudos de diferentes tipos de cancro para desenvolver melhores métodos para o seu isolamento e para futuros estudos sobre a biologia de este subconjunto celular importante. Portanto, como nóster feito neste estudo, é importante para melhorar os métodos de isolamento CSC através do estudo da CSC biologia, com o objectivo final de encontrar alvos moleculares e desenvolver uma terapia anticancro muito específica dirigida contra este subconjunto celular particular, que é provavelmente responsável por a manutenção do tumor primário, o desenvolvimento da sua recorrência, e a origem de metástases em vários órgãos. O estudo da CSC biologia também é importante para encontrar terapias que poderiam ser incisiva na cura de cânceres, como o OS, para os quais a taxa de sobrevivência após o tratamento neoadjuvante continua a ser muito pobre.

Sarcomas são um grupo heterogêneo de tumores raros do tecido conjuntivo malignas de origem predominantemente a partir da mesoderme embrionária 1. Os diferentes tipos incluem sarcomas ósseos e sarcomas de tecidos moles. sarcomas ósseos, um grupo de tumores primários relativamente pouco frequentes, consistir em vários subtipos, incluindo osteossarcoma (OS). OS, um dos tumores primários mais comuns do tecido ósseo, é um tumor maligno mesenquimal que exibe extensa clínicos, histológicos e heterogeneidades moleculares 2, 3. Infelizmente, OS ocorre predominantemente em crianças e em adultos jovens 4, 5 e representa 60% do os subtipos histológicos comuns de sarcoma do osso na infância 6, 7. oS geralmente afecta as áreas do esqueleto, as quais são caracterizadas pelo crescimento ósseo rápido (por exemplo, a metáfise de ossos longos). Entre os histologicamente diferentes subtipos de OS, sistema operacional convencional, também chamado medular ou OS central, tem um alto grau de malignidade e uma quota share de 80% 8. Este 80% é composto de 60% OS convencional osteoblástica, 10% OS condroblástico, e 10% de SO fibroblástica 6, 8-10. Outros subtipos do sistema operacional incluem anaplásico, telangiectatic, rico em células gigantes e OS de pequenas células. Apesar dos avanços na cirurgia e quimioterapia na gestão OS combinados, o resultado permanece pobre, com uma taxa de sobrevivência a longo prazo de 65-70% em pacientes sem metástase 11, 12. Recorrências distantes ocorrem frequentemente como metástases pulmonares ou, menos frequentemente, como metástases aos ossos distantes e recidivas locais 13. As metástases são frequentemente resistentes aos tratamentos convencionais. Esta resistência é a razão pela qual a sobrevida livre de doença de 10 anos é de aproximadamente 30% em pacientes com doença metastática no momento do diagnóstico 14, 15. Como com o tecido normal, tecido de cancro é composto de uma colecção heterogénea de tipos celulares. As células dentro do tumor parece corresponder a diferentes fases de desenvolvimento. Dentro de qualquer Normal tecido reside uma subpopulação de células com a capacidade de selfrenew, proporcionando assim progenitores e células maduras para a homeostase do tecido. Do mesmo modo, o cancro é composta por uma população heterogénea semelhante de células em diferentes fases de desenvolvimento, com diferentes graus de proliferação e potencial tumorigénico. Um subconjunto destas células de cancro, denominado cancro de células estaminais (CSCs), constitui um reservatório de selfsustaining células com a capacidade para selfrenew exclusiva e manter o potencial de malignidade de tumores, assim gerar as diferentes linhagens de células que constituem a maior parte do tumor 16. Na década de 1990, estudos sobre a leucemia mielóide aguda forneceu a primeira evidência convincente para a existência de CSC subpopulações 17, 18. CSCs já foram isolados a partir de um grande número de tumores sólidos 19, tornando-se um dos temas mais pesquisados na pesquisa do câncer. CSCs pode, de facto surgem a partir de células estaminais normais por mutações em genes que tornam a normaiscélulas cancerosas 20-23 haste. Múltiplas mutações transformando e interações com o microambiente também poderia contribuir para progenitores saudáveis ​​e células maduras que adquirem a capacidade selfrenewal e imortalidade que tipificam CSCs. Existem várias hipóteses sobre esta transformação. Progenitores saudáveis, células maduras saudáveis e células cancerosas, pode dedifferentiate às células-tronco, obtendo um fenótipo estaminais-como ativando genes associados à selfrenewal 24-28. Apesar de vários estudos recentes, as origens da CSCs têm ainda a ser descoberto. Uma característica particular de CSCs é que a sua capacidade para resistir a aproximação multi-terapia, que consiste em cirurgia e quimioterapia combinadas com diferentes drogas. Estudos recentes têm mostrado que os CSCs também podem adquirir resistência a agentes citotóxicos quimioterapia. Possíveis explicações para essa resistência incluem a superexpressão de ATP vinculativo cassete (ABC) transportador de múltiplas drogas (isto é,MDR1 e BCRP1), a sobre-expressão de enzimas metabolizadoras de quimioterapia tais como aldeído desidrogenase 1 (ALDH1), e / ou alterações na cinética do ciclo celular 30-33. A consequência directa de todos os conceitos que têm sido descritos até aqui é que uma terapia de cancro seria eficiente apenas se a subpopulação CSC foram completamente eliminadas, enquanto que a recorrência local ou metástase distante poderia ocorrer se mesmo um único CSC sobreviveram. A descoberta de CSCs em sarcomas humanos 34, particularmente OS 35, ou em quaisquer outros tipos de câncer ósseo e dos tecidos moles, tem grande importância clínica, pois oferece uma possível explicação de por que muitos tratamentos parecem ser eficazes no início, mas os pacientes depois recaída. Portanto, a esperança para o futuro batalha contra OS convencional é encontrar terapias direcionadas novos e específicos com base no desenvolvimento de medicamentos inovadores dirigidos a OS-CSCs graças à caracterização molecular deste subpopulação e para o estudo da biologia CSC. Em 1992, Reynolds e colegas, que investigam se um subconjunto de células estaminais estava presente no cérebro de mamíferos adultos, desenvolveu um método para isolar células que se suspeita serem células 36, 37 da haste semelhante. Este método baseia-se na capacidade particular de estas células para formar colónias esféricas quando cultivadas sob condições não aderentes. Técnicas semelhantes foram empregadas por Gibbs e seus colegas em 2005 para estudar uma subpopulação de células-tronco, como em sarcomas ósseos 38. Para isolar e caracterizar OS-CSCs a partir de culturas de células primárias de diferentes tipos de OS convencional, decidimos adaptar esta técnica para linhas de células do sistema operacional. Aqui, nós descrevemos este método adaptado do ensaio de formação de esferas, chamado &quot;ensaio sarcosphere&quot;, que pode ser utilizado para isolar SO-CSCs a partir de linhas de células primárias derivadas finitos a partir de biópsias humanas de SO convencional. Descrevemos também todas as técnicas used para validar o fenótipo CSC-haste como as de linhas de células isoladas por este ensaio: 1) a avaliação da expressão de genes que caracterizam células estaminais embrionárias pluripotentes (CES) e do gene de CD133, que é um marcador de CSCs; 2) (CFU) ensaio de unidades formadoras de colónias; 3) Avaliação da capacidade destas células para se diferenciarem em osteoblastos e adipócitos sob condições de diferenciação adequados; 4) estudo dos marcadores de superfície de células-tronco mesenquimais (MSCs) (ie, CD44, CD105 e Stro-1) por imunofluorescência e por análise de citometria de fluxo; 5) Avaliação da actividade de ALDH destas células.

<table><tbody><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco com Ca2+ e Mg2+ (DPBS)</td><td>LONZA</td><td>BE17-513F</td><td>_</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco&nbsp; sem Ca2+ e Mg2+ (DPBS)</td><td>LONZA</td><td>BE17-512F</td><td>_</td></tr><tr><td>Porcine Trypsin 1:250</td><td>BD Difco</td><td>215310</td><td>Solvente: DPBS. Concentração de estoque: Pó</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiamina tetracético sal dissódico di-hidratado (EDTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td>Solvente: DPBS. Concentração de estoque:</td></tr><tr><td>Colagenase em pó de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td>Solvente: Solução tampão, pH 7,4. Concentração de estoque: Pó</td></tr><tr><td>de sulfóxido de dimetila (DMSO)</td> <td>BDH Chemicals-VWR</td><td>10323</td><td>_</td></tr><tr><td>Mistura de nutrientes F-12 Ham</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6636</td><td>Solvente: Ultrapure dH2O. Concentração de estoque:</td></tr><tr><td>Pó Sal trissódico de ácido 2-Fosfo-L-ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49752</td><td>Solvente: DPBS. Concentração de estoque: 5 mg/mL</td></tr><tr><td>&beta;-Glicerol fosfato dissódico sal pentahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50020</td><td>Solvente: DPBS. Concentração de estoque: 1 M</td></tr><tr><td>Insulina. Solvente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077</td> Recombinante Humano<td>: NaOH 0,1 M. Concentração de estoque: 10 mM</td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>Solvente: DMSO. Concentração de estoque: 500 mM</td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td>Solvente: DMSO. Concentração de estoque: 200 mM</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td>Solvente: DMSO. Concentração de estoque:&nbsp; 1 mM / 100 &micro;M. Armazenar em nitrogênio líquido para manter a atividade biológica</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>_</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum South America&nbsp;</td><td>EUROCLONE</td><td>ECS0180L</td><td>_</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (PEN-STREP) 10.000 U/mL</td><td>LONZA</td><td>DE17-602E</td><td>_</td></tr><tr><td>Metilcelulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274429</td><td>Solvente: Ultrapure dH2O. Concentração de estoque: 2%</td></tr><tr><td>Cloridrato de putresceína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td>Solvente: Ultrapure dH2O. Concentração de estoque: Pó</td></tr><tr><td>apo-Transferrin&nbsp;</td><td>Solvente Sigma-Aldrich</td><td>T-1147</td><td>: DPBS. Concentração de estoque: 25 mg/mL</td></tr><tr><td>de Fator de Crescimento Epidérmico Humano (EFGF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5036</td><td>Solvente: DPBS pH 7,4. Concentração de estoque: 10 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Fator de Crescimento de Fibroblastos-Humano Básico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td>Solvente: DPBS + 0,2% BSA. Concentração de estoque: 25 &micro; g / mL</td></tr><tr><td>de Ácido Selenoso</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>211176</td><td>Solvente: DPBS. Concentração de estoque: 30 mM</td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>Solvente: ETOH. Concentração de estoque: 10 mM</td></tr><tr><td>Azul de Toluidina O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198161</td><td>Solvente: Ultrapure dH2O. Concentração de estoque: Óleo em pó</td></tr><tr><td>Red O</td><td>ICN Biochemicals</td><td>155984</td><td>Solvente: 2-Propanol. Concentração de estoque: Naftol em pó</td></tr><tr><td>AS-MX Fosfato Dissódico Sal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5000</td><td>Solvente: DMSO. Concentração de estoque: Pó</td></tr><tr><td>Fast Blue BB Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3378</td><td>Solvente: Tris HCL, pH 9,0. Concentração de estoque: Pó</td></tr><tr><td>Fast Red Violet LB Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3381</td><td>Solvente: Tris HCL, pH 9,1. Concentração de estoque:</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino em pó, Fração V (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A-4503</td><td>Solvente: DPBS. Concentração de estoque: 2%</td></tr> <tr><td>de vermelho de alizarina S</td><td>ICN Biochemicals</td><td>100375</td><td>Solvente: ultrapuro dH 2O. Concentração de estoque:</td></tr><tr><td>Solução de formaldeído</td> em pó <td>Sigma-Aldrich</td><td>533998</td><td>4%</td></tr> <tr><td>Triton-100X</td><td>MERCK</td><td>11869</td><td>Solvente: DPBS. Concentração de estoque: 0,2%. Perigo - Use apenas sob o capuz químico</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>MERCK</td><td>2315</td><td>Solvente: DPBS . Concentração de estoque: 200 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>MERCK</td><td>109634</td><td>Perigo - Use apenas sob o capuz químico</td></tr><tr><td>Ab-CD105&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Monoclonal de camundongo [SN6] a CD105 (FITC)</td><td>Abcam</td><td>ab11415</td><td>Líquido. Aplicação:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Citometria de Fluxo (Citografia de Fluxo)</td></tr><tr><td>Ab-CD44&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Monoclonal de camundongo&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; [F10-44-2] a CD44 (PE/Cy7&reg;))</td><td>Abcam</td><td>ab46793</td><td>Líquido. Aplicação:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Citometria de Fluxo (Citografia de Fluxo)</td></tr><tr><td>Ab-CD45&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Monoclonal de camundongo&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; [MEM-28] a CD45 (PerCP))&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab65952</td><td>Líquido. Aplicação:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Citometria de Fluxo (Citagem de Fluxo)</td></tr><tr><td>Ab-CD105&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Anticorpo Purificado CD105 Humano)&nbsp;</td><td>Solvente MHCD10500 Invitrogen</td><td></td><td>: DPBS. Concentração de estoque: Liofilizado. Aplicação: Coloração de imunofluorescência (IF)</td></tr><tr><td>Ab-CD44&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Anticorpo Anti-CD44)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>EPR1013Y(ab51037)</td><td>Solvente: DPBS. Concentração de estoque: Liofilizado. Aplicação: Coloração de imunofluorescência (IF)</td></tr><tr><td>Ab-Stro-1&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Mouse anti-STRO-1)&nbsp;</td><td>Solvente 398401 Invitrogen</td><td></td><td>: DPBS. Concentração de estoque: Liofilizado. Aplicação:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Citometria de Fluxo (Flow Cyt)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Coloração de imunofluorescência (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (IgG anti-coelho (Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L))</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>Solvente: DPBS. Concentração de estoque: Liofilizado. Aplicação: Coloração de imunofluorescência (IF)</td></tr><tr><td>FITC Anti-Mouse IG (FITC-Rabbit Anti Mouse IgG (H+L))</td><td>Invitrogen</td><td>61-6511</td><td>Solvente: DPBS. Concentração de estoque: Liofilizado. Aplicação:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Citometria de Fluxo (Flow Cyt)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Coloração de imunofluorescência (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 635 Faloidina&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A34054</td><td>Solvente: DPBS. Concentração de estoque: Liofilizado. Aplicação: Coloração de imunofluorescência (IF)</td></tr><tr><td>AutoMACS&trade; Buffer de Separação MACS Running Buffer</td><td>Miltenyi</td><td>130,091,221</td><td>Líquido. Armazene a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>QIAzol&reg; Reagente de Lise</td><td>QIAGEN</td><td>79306</td><td>Perigo - Use apenas sob o capuz químico</td></tr><tr><td>QUANTITECT&reg; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Kit de Transcrição Reversa</td><td>QIAGEN</td><td>205314</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Clorograma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Líquido. Perigo - Use apenas sob o capô químico Capuz</td></tr><tr><td>de fluxo laminar</td><td>GELAIRE</td><td>BSB6A</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Capuz químico</td><td>ARREDI TECNICI&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Villa</td><td>Modello&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; DYNAMICA</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>EPPENDORF</td><td>5415R</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopia Confocal de Varredura a Laser LSM 5109 Meta&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>iCycler PCR Thermalcycler&nbsp;</td><td>BIORAD</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>CyFlow&reg; ESPAÇO&nbsp;</td><td>(PARTEC)</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscópio Invertido Axiovert 200M&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Recipiente de congelamento</td>, <td>Nalgene</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Original Pipet-Aid</td><td>pbiBrand</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Micropipetas</td><td>EPPENDORF_</td><td>&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipeta de Vidro Pasteur</td><td>SIGMA_</td><td>&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>VICTOR3 e comércio; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>PERKIN ELMER_</td><td>&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos cônicos&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (15 e 50 mL)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>352096 (para 15 mL)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 352070 (para 50 mL)</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Células Multipoços Tratadas com TC de Fundo Plano de 24 Poços</td><td>BD FALCON</td><td>353047</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de Múltiplos Poços de Fundo Plano Ultra Baixo com 6 Poços Transparentes</td><td>CORNING</td><td>3471</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (5 e 10 mL)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>357543 (para 5 mL)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 357551 (para 10mL)</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Seringa (5mL)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>B|BRAUN</td><td>4617053V</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri 100X20 mm&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>353003</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>R&ouml; Tubos de Água&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (3,5 mL, 55x12mm, PS)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>55,484</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri 60X15 mm&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>353004</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Criogeniais 1,5 mL&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>NALGENE</td><td>5000-1020</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Frascos de Cultura de Células 25 cm&sup2; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>353014</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtro de Rede de Nylon, Hidrofílico</td><td>MERCK NY4104700</td><td></td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Suporte de Filtro Swinnex</td><td>MERCK</td><td>SX0002500</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinça Perry</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Lanceta</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Denunciar</td><td>_</td><td>_</td><td>_</td></tr></tbody></table>

establishment of cancer stem cell cultures de human osteossarcoma convencional

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

As melhorias atuais na terapia contra o osteossarcoma (OS) ter prolongado a vida de pacientes com câncer, mas a taxa de sobrevivência de cinco anos continua a ser pobre quando a metástase ocorreu. A teoria de haste do cancro celular (CSC) sustenta que há um subconjunto de células tumorais dentro do tumor que têm características tronco-semelhantes, incluindo a capacidade de manter o tumor e para resistir a múltiplos fármacos de quimioterapia. Portanto, uma melhor compreensão da biologia OS e patogénese é necessária, a fim de avançar no desenvolvimento de terapias específicas para erradicar este subconjunto particular e para reduzir a morbidade e mortalidade entre os pacientes. Isolando CSCs, estabelecendo culturas de células de CSCs, e estudar sua biologia são passos importantes para melhorar a nossa compreensão da biologia OS e patogênese. O estabelecimento de origem humana OS-CSCs a partir de biópsias de OS tem sido possível usando vários métodos, incluindo a capacidade de criar culturas de células estaminais em 3 dimensões sob nonadherecondições NT. Sob estas condições, os CSCs são capazes de criar colónias flutuantes esféricas formadas por células estaminais filhas; essas colônias são denominadas &quot;esferas celulares&quot;. Aqui, descrevemos um método para estabelecer culturas CSC de culturas de células primárias de OS convencional obtidos a partir de biópsias OS. Nós descrever claramente as várias passagens necessários para isolar e caracterizar CSCs.

A presença de células-tronco cancerosas (CSCs) em sarcomas ósseos foi recentemente ligada à sua patogênese. Neste artigo, apresentamos o isolamento de CSCs de culturas de células primárias obtidas a partir de biópsias humanas de osteossarcoma convencional (OS) que utilizam a capacidade dos CSCs a crescer sob condições não aderentes.

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures de Human osteossarcoma convencional

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

O objetivo geral deste ensaio é isolar células-tronco cancerígenas de uma linhagem celular limitada obtida de osteossarcomas humanos. A principal vantagem deste trabalho é demonstrar claramente aos pesquisadores da área de oncologia como isolar, in vitro, células-tronco cancerígenas. Essas células podem então ser utilizadas para pesquisar terapias contra o osteossarcoma e outros tumores sólidos.Em geral, indivíduos novos nesse assunto terão dificuldades se não souberem como isolar as colônias de sarcoma. A demonstração visual disso é fundamental, pois a etapa de isolamento é difícil de realizar e de compreender. Tivemos pela primeira vez a ideia para esta técnica quando lemos sobre o ensaio de formação de esferoides.Descrito por Gypsum e colaboradores. O procedimento será demonstrado pela Dra. Gaia Palmini, estudante de doutorado, e pelo Dr. Roberto Zonefrati, técnico do meu laboratório. Para começar, prepare todo o meio de cultura necessário.Tamp&otilde;es de digest&atilde;o e outras solu&ccedil;&otilde;es que ser&atilde;o necess&aacute;rias para o procedimento. Em seguida, estabele&ccedil;a uma linhagem celular finita de osteossarcoma, isolando o osteossarcoma de uma bi&oacute;psia por agulha ou cir&uacute;rgica confirmada. E subcultive as c&eacute;lulas obtidas conforme descrito no artigo textual complementar.Uma vez que o cultivo celular de osteossarcoma tenha sido estabelecido e a placa esteja próxima à confluência, remova o meio por aspiração e tripsinize as células para liberá-las da placa. Transfira as células para um tubo novo e pipete suavemente a suspensão celular para cima e para baixo para dispersar quaisquer agregados celulares.Em seguida, colete dez microlitros da suspensão celular e transfira para uma câmara de hemocitômetro. Coloque a câmara de hemocitômetro sob um microscópio de contraste de fase e calcule a concentração de células na suspensão. Então, adicione 280.000 células a 35 mililitros de meio de crescimento de sarcosferas, contendo metilcelulose, e misture suavemente a solução usando uma pipeta, para dispersar quaisquer agregados.Transfira cinco mililitros da mistura celular para cada poço de placas de seis poços com aderência ultra baixa. Após o plaqueamento, utilize um microscópio invertido para observar a aparência das células e verificar se estão bem isoladas. Incube as células em um incubador a 37 graus Celsius, com cinco por cento de dióxido de carbono.A cada três dias, adicione álcoois frescos de beta FGF e EGF a cada poço para renovar a concentração dos fatores de crescimento. Examine o andamento do ensaio de sarcosferas observando as células ao microscópio aos sete, 14, 20, 21 e 28 dias. Quando você observar a presença de grandes sarcosferas pretas, todas agrupadas no centro do poço, interrompa o cultivo e inicie o processo de desintegração.Quando for hora de isolar o sarcosfero, use uma pipeta estéril de 1.000 microlitros para transferir o meio contendo os sarcosferos para uma seringa com um suporte estéril para filtro de membrana. Após remover completamente o meio contendo os sarcosferos, adicione cinco mililitros de meio de crescimento ao poço e enxágue para ter certeza. E colete quaisquer esferas remanescentes.Em seguida, utilize um microscópio para confirmar se todas as sarcosferas foram recuperadas. Caso contrário, lave novamente o poço até que a coleta das esferas esteja completa. A seguir, filtre a suspensão através do suporte de filtro de membrana por gravidade, a fim de não danificar as esferas, e certifique-se de que nenhuma sarcosfera atravesse o filtro.Durante este processo, remova quaisquer bolhas de ar utilizando suavemente uma pipeta de vidro estéril. Depois que todas as sarcosferas tiverem sido filtradas, lave a unidade de filtração adicionando dez mililitros de meio de crescimento diretamente à seringa e permitindo que o líquido filtre sem pressão, a fim de garantir a eliminação de células isoladas. Uma vez que a suspensão de sarcosferas tenha sido filtrada, é necessário descartar o filtrado líquido e prestar atenção especial à recuperação das sarcosferas, que ficam emaranhadas na malha do filtro.Neste momento, desmonte a unidade de filtro, removendo-a da seringa. E coloque-a em uma placa de Petri de 100 milímetros. Remova o filtro de rede do suporte do filtro de membrana utilizando uma pinça estéril tipo peri.E transfira o filtro para um novo recipiente de cultura de 60 milímetros. Em seguida, lave o filtro com rede agitando-o suavemente, adicionando cinco mililitros de meio de crescimento para liberar as sarcosferas do emaranhado da membrana.Em seguida, coloque a membrana em um poço e confirme por observação microscópica que não há mais esferas emaranhadas na membrana. Lave a membrana novamente e, em seguida, verifique novamente a membrana ao microscópio caso ainda haja esferas emaranhadas. Quando não restarem mais esferas na membrana, incube-as em meio de crescimento para cultivar as sarcosferas em uma monocamada.Monitore o crescimento das células-tronco de osteossarcoma, obtidas a partir dos sarcosferoides, até que as células atinjam cerca de 90% de confluência em uma placa de Petri de 60 milímetros. Além dos inúmeros protocolos descritos neste artigo, os métodos para avaliar a capacidade de diferenciação, atividade de ALDH, citometria de fluxo, imunofluorescência e análise de RT-PCR estão detalhados no protocolo textual complementar.As amostras de osteossarcoma são obtidas por aspiração com agulha ou por corte cirúrgico. E, se tratadas adequadamente, levam aproximadamente um mês para as culturas primárias atingirem confluência em uma placa de Petri de 100 milímetros. Após a expansão, as células são semeadas em placas de seis poços com aderência ultrabaixa, para iniciar o ensaio de sarcosferas.Esta placa mantém as células em estado suspenso e impede a adesão ao substrato. Após sete dias, observam-se várias colônias esféricas pequenas cercadas por células isoladas. E após 28 dias, observam-se vários sarcosferas grandes.Uma vez que as colônias esféricas são isoladas, células cancerígenas com características de células-tronco podem ser expandidas a partir de sarcosferas individuais colocando-as em placas de aderência normal. As colorações imunofluorescentes mostraram um fenótipo semelhante ao de células-tronco mesenquimais, já que as células expandidas foram positivas para CD44 e CD105, e moderadamente positivas para Stro-1. A RT-PCR também confirmou positivamente o fenótipo de célula-tronco embrionária pela expressão de três genes marcadores de células-tronco embrionárias.Nanog, Oct3/4 e Sox2. E o gene CD133, um marcador para células-tronco do osteossarcoma. A técnica detalhada de isolamento que mostramos neste vídeo abrirá caminho para que outros pesquisadores estudem células-tronco cancerígenas, mostrando-lhes como compreender e reproduzir as etapas mais críticas do ensaio de formação de esferoides.Este ensaio modificado é uma boa técnica para o isolamento de células-tronco cancerígenas e para o estudo de sua biologia. Este método, com adaptações adicionais, também pode ser utilizado para isolar células-tronco cancerígenas de outras linhagens celulares tumorais finitas, obtidas por biópsias de tumores sólidos.Em conclusão, o isolamento de células-tronco cancerígenas de diversos tipos de tumores permitirá o estudo de sua biologia, com o objetivo final de identificar alvos moleculares e desenvolver terapias anti-câncer altamente específicas direcionadas contra subconjuntos celulares particulares.

establishment-cancer-stem-cell-cultures-from-human-conventional

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este artigo descreve a preparação do tecido acabado de melanoma obtidas em culturas primárias de células, e como para remover contaminações de eritrócitos e fibroblastos a partir de células tumorais. Finalmente, descrevemos como...

Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Células-tronco de câncer putativos Melanoma

O isolamento de células-tronco cancerosas (CSCs) diretamente a partir de tecidos humanos é requisito para a sua caracterização biológica. Este manuscrito descreve uma metodologia para o isolamento de CSCs próstata de tecidos humanos, além de fornecer dicas sobre solução de problemas etapas difíceis.

Isolamento de células-tronco cancerosas em amostras de câncer de próstata humano

Células-tronco cancerosas (CSCs) estão implicados na reincidência do tumor devido a chemoresistance. Nós otimizamos um protocolo para a seleção e expansão dos CSCs de linhas celulares de cancro do ovário. Ao tratar as células com a cisplatina quimioterapêutico e a cultura de uma célula-tronco nos meios de promoção para enriquecer culturas CSC não aderentes.

Enriquecimento para resistente à quimioterapia do cancro do ovário células-tronco de linhas de células humanas

Os ensaios de esferas in vitro são comumente usados para identificar células-tronco cancerígenas. Aqui, comparamos ensaios de esferas únicas com multicélulas. Os ensaios baseados em células únicas mais trabalhosos ou a suplementação de metilcelulose fornecem resultados mais precisos, enquanto os ensaios baseados em várias células realizados em meio líquido podem ser altamente influenciados pela densidade celular.

Avaliação das Propriedades Stem Cell em carcinomas de células do ovário humano utilizar multi e individuais baseados em células Esferas Ensaios

O seguinte protocolo incide sobre o estabelecimento de uma cultura primária de sarcoma de tecidos moles paciente-derivado (STS). Este modelo pode nos ajudar a compreender melhor o fundo molecular e perfil farmacológico destas malignidades raras e poderia representar um ponto de partida para novas pesquisas que visam melhorar a gestão do STS.

Estabelecimento de uma cultura primária de Sarcoma macio do tecido derivado de paciente

Nós descrevemos um protocolo detalhado para a isolação de pilhas tumor-iniciando dos xenoenxertos paciente-derivados do sarcoma humano pela seleção fluorescência-ativada da pilha, usando o antígeno-1 humano da leucócito (HLA-1) como um marcador negativo, e para a validação mais adicional e caracterização destas pilhas tumor-iniciando HLA-1-Negative.

Isolamento e caracterização de células iniciantes tumorais de sarcoma de xenoenxertos derivados do paciente

Fenótipos de célula dormente e ativo câncer foram caracterizados utilizando imagens de fase quantitativa. Ensaios de proliferação, migração e morfologia celular foram integrados e analisados em um método simples.

Uma lapso de tempo, livre de rótulo, quantitativa fase estudo de células cancerosas humanas latentes e ativos de imagem

Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de pluripotentes induzidas (iPSCs) as células-tronco do paciente fibroblastos derivada de síndrome de Li-Fraumeni (LFS), diferenciação de iPSCs através de células-tronco mesenquimais (MSCs) de osteoblastos e modelagem em vivo tumorigênese usando osteoblastos paciente-derivado do LFS.

Modelagem de osteossarcoma usando síndrome de Li-Fraumeni paciente-derivado induzido Pluripotent Stem Cells

O objetivo dessa metodologia é identificar células-tronco cancerígenas (CSC) em linhas de células cancerosas e amostras primárias de tumor humano com o protocolo de formação da esfera, de forma robusta, utilizando ensaios funcionais e caracterização phenotípica com citometria de fluxo e ocidental Borrão.

Obtenção de esferas de células-tronco cancerígenas de tumores ginecológicos e de câncer de mama

O presente protocolo descreve o método para estabelecer um modelo de camundongo xenoenxerto derivado do paciente (PDX) usando tecido de osteossarcoma humano.

Estabelecimento de modelo de camundongo xenoenxerto derivado de pacientes com tecidos de osteossarcoma humano

Aprenda a isolar células-tronco cancerígenas de osteossarcoma humano usando o ensaio de formação de sarcóferas. Este protocolo visual demonstra a cultura de esferas e marcação de células-tronco para pesquisa oncológica.

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures de Human osteossarcoma convencional

Explorar mais vídeos