Isolamento e diferenciação de células tronco derivadas de tecido adiposo de Suínos Subcutânea tecidos adiposos

O objetivo geral deste procedimento é isolar células-tronco derivadas de tecido adiposo de tecidos brancos adiposos subcutâneos suínos para avaliar sua capacidade de se diferenciar em adipócitos mesenquimais, osteócitos e condócitos. Este método pode ajudar a responder questões-chave da pesquisa sobre obesidade. É uma boa ferramenta para revelar o mecanismo molecular envolvido na regulação do desenvolvimento do tecido adiposo.

A principal vantagem desta técnica é que um grande número de células estromavasculares pode ser coletado, permitindo uma análise detalhada da diferenciação e biologia dos adipócitos. A implicação desta técnica direciona-se à pesquisa em terapia com células-tronco, já que as células-tronco derivadas de tecido adiposo de porco exibem multipotência para transdiferenciação em múltiplas linhagens celulares. Comece posicionando o leitão em posição prona sobre uma mesa cirúrgica limpa.

Raspe todo o cabelo ao longo da linha média do pescoço até a cauda e esfregue a pele dorsal com iodo-povidona 7,5% três vezes. Após a terceira esfregaço, deixe o iodo atuar na superfície da pele por cerca de 10 minutos. Em seguida, pulverize a pele com etanol 70%.

E utilize compressas de gaze embebidas em etanol para limpar a pele em um único sentido, removendo o desinfetante até que nenhuma cor evidente seja observada. Em seguida, faça uma incisão da região do pescoço até a perna. Depois, segurando a gordura e a pele com pinça, use um bisturi para separar a camada de gordura dorsal suína dos tecidos adiposos subcutâneos e a camada adjacente de pele dos músculos.

Imediatamente mergulhe o tecido cutâneo e adiposo em um béquer esterilizado de 200 mililitros, contendo DMEM sem soro, a 37 graus Celsius, e pulverize o exterior do béquer com etanol 70%. Em seguida, coloque o béquer dentro de uma câmara de fluxo laminar para cultura celular e posicione uma tampa de folha de alumínio esterilizada, com três camadas e medindo 40 por 30 centímetros, ao lado do béquer. Transfira o tecido, com a pele voltada para baixo, para cima da folha de alumínio.

E use pinças e tesoura para remover o tecido muscular remanescente do tecido adiposo. Corte a gordura em pedaços quadrados de 7 por 7 centímetros e, em seguida, transfira os pedaços de gordura para um novo béquer esterilizado de 200 mililitros contendo DMEM sem soro, a 37 graus Celsius. Agora, coloque um suporte de fatiamento personalizado, equipado com uma lâmina de corte de aço carbono, sobre a folha de cobertura e posicione um dos pedaços de gordura sobre o cortador com a camada de gordura voltada para baixo.

Corte a gordura em pedaços com aproximadamente 1 milímetro de espessura, o mais próximo possível da pele, mas sem cortar a pele. Em seguida, use uma tesoura para picar os fragmentos de tecido adiposo o mais finamente possível e adicione-os a um frasco Erlenmeyer de 250 mililitros contendo meio de digestão filtrado suplementado com colagenase. Incube o frasco com agitação suave durante 90 minutos a 45 RPM, em um agitador orbital a 37 graus Celsius.

Quando o meio de digestão se tornar uma suspensão homogênea, sem coágulos significativos de tecido, interrompa a digestão com um volume igual de meio de cultura contendo DMEM F-12 com 10% de FBS. Para coletar as células-tronco derivadas de adipócitos suínos, filtre a suspensão de tecido adiposo digerido através de uma única camada de musselina para dentro de um frasco serológico esterilizado de 250 mililitros, usando pinça para pressionar o centro da musselina, a fim de orientar e auxiliar a passagem do material digerido. Drene e torça a musselina com a pinça para completar a passagem e distribua o meio em quatro tubos cónicos de centrífuga de 50 mililitros.

Coletar as células estromais-vasculares por centrifugação. Em seguida, desprezar o sobrenatante sem perturbar os pellets para remover a maior parte da camada de gordura superior contendo os adipócitos maduros. A seguir, ressuspender os pellets em 10 mililitros de DMEM com pipetagem e agitação suave.

Centrifugue as células novamente e re-suspenda os pellets em 10 mililitros de tampão de lise ACK. Após sete minutos à temperatura ambiente, interrompa a lise das hemácias com a adição de 10 mililitros de DMEM a cada tubo, agitando suavemente os tubos para misturar. Em seguida, centrifugue as células novamente.

Lave as células mais duas vezes com 10 mililitros de DMEM e, em seguida, reúna os sobrenadantes por meio de uma peneira de 100 mícrons em um único tubo cônico de 50 mililitros. Pipete suavemente a suspensão celular várias vezes para distribuir uniformemente as células e conte as células pelo método de exclusão com azul de tripano. Por fim, semeie as células-tronco derivadas de adipócitos de porco numa densidade de 6 vezes 10 à 4ª por centímetro quadrado em um recipiente de cultura de tamanho apropriado contendo meio de cultura celular.

E incubar as células a 37 graus Celsius e 5%CO2, para facilitar a formação de uma monocamada. A morfologia das células-tronco derivadas do tecido adiposo de suínos, obtidas da fração estromal-vascular, é semelhante à das células-tronco derivadas do tecido adiposo de camundongo ou humano, apresentando uma morfologia alongada semelhante à de fibroblastos, observada 24 horas após a semeadura. As células-tronco derivadas do tecido adiposo de suínos tornam-se confluente em até 72 horas, momento em que estão prontas para diferenciação em adipócitos ou em outros tipos mesenquimais.

Essas células também exibem um forte potencial adipogênico após indução química, e adipócitos maduros podem ser observados após nove dias de diferenciação, com mais de 90% das células-tronco derivadas de tecido adiposo de suíno demonstrando diferenciação adipogênica. Marcadores de superfície de células-tronco mesenquimais, incluindo CD 29, CD 44, CD 90 e MHC 1, são altamente expressos nas células-tronco derivadas de tecido adiposo de suíno, enquanto CD 4a, CD 31, CD 45 e MHC II são mal detectáveis, demonstrando que essas células-tronco derivadas de tecido adiposo de suíno exibem características do tipo mesenquimal sem contaminação significativa por células-tronco endoteliais ou hematopoiéticas. Além disso, as células-tronco derivadas de tecido adiposo de suíno diferenciadas podem ser identificadas como adipócitos, osteócitos ou condócitos, por meio do uso de corantes específicos para tecidos, demonstrando que essas células derivadas da fração estromal-vascular mantêm uma multipotência típica de progenitores do tipo mesenquimal.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de adotar uma boa técnica asséptica para cultura celular e executar todas as etapas o mais rapidamente possível, a fim de maximizar a viabilidade das células. Uma vez dominada a técnica, as células podem ser colhidas de dois a três porcos em seis horas, se o procedimento for realizado corretamente.

Essa técnica padrão abriu caminho para pesquisadores da obesidade na área do diabetes explorarem as chaves moleculares, como fatores de transcrição, que controlam a diferenciação de adipócitos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células-tronco derivadas de tecido adiposo de porco e avaliar a capacidade pluripotente dessas células de se diferenciarem em adipócitos, osteócitos e condrócitos.