Name: A separação imunomagnética Sca1 de gordura Depot-específica alta células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASC) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco mesenquimais Sca1 positivas de tecido adiposo de camundongos usando separação imunomagnética. Este método enriquece células de diferentes depósitos de gordura para estudos de biologia de células-tronco.

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Este trabalho é apoiado pelo NIH DK095137 (de THC). Agradecemos aos membros do laboratório atuais e antigos que contribuíram para o desenvolvimento e sofisticação dos métodos descritos.

Declaração de Ética: A Universidade de Michigan Comitê de Uso e tratamento dos animais (UCUCA) aprovou todos os métodos e protocolos, de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Instituto de Pesquisa Animal Laboratory, Conselho Nacional de Pesquisa). Os ratinhos são mantidos no biotério da Universidade de Michigan e é dado livre acesso a comida e água e mantidos numa / ciclo de luz escuro de 12 h. 1. Preparações <ol><li> Preparar meios de cultura primária com DMEM, 10% de FBS, 1x P / S / G e 1x antibióticos / antifúngicos. Isto irá ser utilizado para manter tecidos na digestão antes. Coloque estoque e da alíquota em 37 banho de água ºC. </li><li> Prepare cinco mililitros de solução de colagenase Tipo III em 5 mg / ml dissolvida em HBSS (+ Ca, Mg +) para cada tipo de almofada de gordura a ser isolado, até cinco ratos. Por exemplo, quando se isola SQ e VIS de um único genótipo, fazer 10 ml, se do tipo selvagem e mutante SQ e VIS, fazer 20 ml. Ajustar o pH para 7,4 e steirritar filtro. Aliquota em tubos de 50 ml. Separe longe da luz. </li><li> Use 70% de etanol para desinfectar campo cirúrgico. Limpe e cubra com uma almofada azul. Borrife um pouco de etanol no bloco azul. </li><li> Use os 22 g de agulhas de definir uma almofada absorvente para a placa de isopor e cortar com uma tesoura. Pulverizar o pad com etanol, em seguida, definir a bordo na plataforma azul e cubra com outra almofada azul até começando dissecção. </li><li> Encha dois tubos de 50 ml com etanol e coloque em uma posição adjacente ao campo cirúrgico. Coloque as tesouras e pinças do etanol. </li><li> Encher outro tubo de 50 ml com PBS acrescido 1x anti-anti para enxaguar etanol off instrumentos cirúrgicos. </li><li> Na capa, etiqueta 60 mm pratos para cada tipo de tecido e encher com meios de cultura aquecido a 37 ºC. Colocar as placas adjacentes à área cirúrgica. </li></ol> 2. Isolamento de subcutânea (SQ) Fat Pads <ol><li> Euthanize rato com uma overdose de isoflurano e pneumotórax. </li><li> Suavementespray de rato com 70% de etanol e leigos supina. Pin as patas para a placa de espuma com 22 agulhas G. </li><li> Faça um pequeno corte na pele do abdômen inferior. Segurando a parte superior do corte com a pinça, pegue a tesoura e separar a pele do peritônio. </li><li> Uma vez que a pele é separada do peritoneu do abdómen ao tórax, reflectir a pele para longe do peritoneu para a cabeça, fazendo cortes laterais na pele ao longo do lado do corpo. </li><li> Refletir o restante da pele segurando a gordura inguinal longe do corpo e fixar para baixo à placa com 22 agulhas G. </li><li> Mudar para uma tesoura fina e fórceps. Agarre a almofada de gordura inguinal com a pinça na origem perto do peritônio e snip de distância entre a pele e gordura inguinal progredindo em direção a virilha evitando a contaminação do SQ com a pele. </li><li> Coloque a almofada de gordura inguinal insolated no prato mm marcado 60. </li></ol> 3. Isolamento da Visceral (VIS) bolsas de gordura <ol><li> De uma maneira semelhante ao passo 2.5, cortar o peritoneu aberto para expor o almofadas de gordura visceral e intestino. </li><li> Mova o intestino em direção ao tórax. </li><li> Agarre a almofada de gordura VIS na extremidade distal e puxe para cima. Dissecar a almofada de gordura VIS, tendo o cuidado de excluir do epidídimo (ou uterina, se utilizando do sexo feminino camundongos) do tecido. </li><li> Coloque no prato rotulados e repita o passo 3.3 para o bloco restante VIS. </li></ol> 4. A colagenase digestão da gordura Pads <ol><li> Mova 60 mm pratos para a capa de cultura de tecidos e aspirar off mídia. </li><li> Picar as bolsas de gordura com tesoura curva, em seguida, adicionar a solução de colagenase. Certifique-se de lavar as tesouras e pinças entre tipos de tecido com etanol e PBS. </li><li> Agitar a 300 rpm e 37 ° C durante 10-20 minutos, até que os tecidos são digeridos. É aceitável se algumas peças de SQ ainda são visíveis. Esta questão será abordada em uma etapa posterior. </li><li> Adicionar 25 ml de meio de cultura para a solução de colagenase para parar o collagtratamento Enase e pipeta cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta 10 ml sorológico para dispersar os tecidos digeridos. </li><li> As células da estirpe utilizando um filtro de células 100 mm. Centrifugar durante 10 minutos a 300 x g. </li><li> Cuidadosamente decantar media para não perturbar o sedimento e adicionar 5 ml de água estéril para o sedimento e gentilmente pipeta de suspender as células. Espera 2 minutos para lisar os eritrócitos. </li><li> Adicionar 25 ml de meio com células FBS e deformação de 10% através de um novo filtro de células 100 mm. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 300 x g. Decantar e meios sedimento ressuspender em 1 ml de meio de cultura. </li><li> Contar as células com um hemocitómetro utilizando 1: 1 de azul de tripano. </li><li> Placa 1 X 10 6 células num poço de uma placa de 6 poços. </li></ol> 5. Separação celular Magnetic <ol><li> Depois de cerca de 4 a 6 horas de adesão celular, lavar as células duas vezes com HBSS (-Ca, Mg). Separar as células aderentes utilizando 0,05% de tripsina. Diluir suspensão de células de tripsina em 1 ml de tampão de separação e rotação para5 min a 300 x g. </li><li> Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 500 ul de tampão. Remove-se uma alíquota de 10 ul e contar as células utilizando um hemocitómetro. </li><li> células de centrifugação durante 5 min a 300 x g. </li><li> Aspirar o sobrenadante completamente. Ressuspender as células em 90 ul de tampão. Adiciona-se 10 de anticorpo primário anti-Sca1-FITC ul. Misture bem e incubar por 10 minutos a 4 ºC no escuro. </li><li> Lavar as células com 1 ml de tampão e células de centrifugação durante 5 minutos a 300 x g. Remover o sobrenadante completamente. </li><li> Ressuspender as células em 80 ul de tampão. Adicionar 20 pi microesferas anti-FITC. Misture bem e incubar durante 15 min a 4 ºC no escuro. </li><li> Lavar as células com 1 ml de tampão e células de centrifugação durante 5 minutos a 300 x g. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 ul de tampão. </li><li> Coloque coluna no suporte magnético e lave coluna com 500 ul de tampão. </li><li> Adicionar a suspensão de células em coluna. Evitar bolhas enquanto pipetagem. </li><li> Recolher o Sca1 não marcado - &lt;/ Sup&gt; células e lavagem da coluna 3 vezes com 500 ul de tampão. Apenas adicionar novo buffer quando o reservatório está vazio. Evitar bolhas enquanto pipetagem. </li><li> Remover a coluna do suporte magnético e coloque em um tubo de 15 ml. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão de coluna e eluir Sca1 + empurrando o êmbolo fornecido através do reservatório coluna. </li><li> Girar as fracções de células durante 5 min a 300 x g. Ressuspender as células em 1 ml de meio de cultura. </li><li> Remove-se uma alíquota de 10 ul das fracções marcadas e não marcadas e contar as células utilizando um hemocitómetro. </li><li> Placa cada fracção de células em um poço de uma placa de 6 poços. </li></ol> 6. Verificação de Separação Immunomagnetic de Sca1 alta ACSs com Citometria de Fluxo <ol><li> Lavar as células duas vezes com HBSS (-Ca, Mg) e dissociar as células usando tripsina a 0,05%. </li><li> células centrifugar a 300 xg por 5 min. Ressuspender as células em meios de cultura 1 ml e contar com um hemocitômetro. </li><li> Obter&gt; 10 6 </sup&gt; células em 1 mL de meios de cultura e centrifugar a 300 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e repita o passo 6.3 mais duas vezes. </li><li> Ressuspender as células com 1 ml de soro de cabra 2% + BSA a 2% e de bloco, durante 30 min à TA. </li><li> células centrifugar a 300 xg por 5 min. </li><li> Remover solução de bloqueio. </li><li> Adicionar ratazana IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 g, 1: 400) ou anti-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 g, 1: 400), em 100 ul de PBS com soro de cabra 2% e 2% de BSA + PBS a 4 ° C durante 30 min no escuro. </li><li> Adicionar 1 ml de PBS frio a células. Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e repita o passo 6.9 mais duas vezes. </li><li> Ressuspender as células em 1 ml de PBS. Passa suspensões de células através de um coador de células de 100 um em preparação para a análise por citometria de fluxo. </li></ol>

<ol><li>Chun, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pericellular+collagenase+directs+the+3-dimensional+development+of+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue.</a> Cell. 125 (3), 577-591 (2006).</li>
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<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
<li>Tokunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+depot-specific+gene+signature+and+ECM+remodeling+of+Sca1%28high%29+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells.</a> Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).</li>
<li>Chun, T. H., Inoue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+adipocyte+differentiation+and+peri-adipocyte+collagen+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover.</a> Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).</li>
<li>Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ready-to-use%2C+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li>
<li>Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ly-6A+%28Sca-1%29+GFP+Transgene+is+Expressed+in+all+Adult+Mouse+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).</li>
<li>Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+adipocyte+cellular+lineage+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo.</a> Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).</li>
<li>Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+depot-specific+activation+of+adipocyte+precursor+cells+at+the+onset+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).</li>
<li>Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+Expression+of+Extracellular+Matrix+in+Subcutaneous+Adipose+Tissue+Development+and+Adipogenesis%3B+Comparison+with+Visceral+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue.</a> Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).</li>
<li>Ong, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Specific+Cell-Surface+Markers+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Subcutaneous+and+Visceral+Fat+Depots%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Aqui demonstramos o isolamento e separação de células imunomagnética de ASC de murino a partir de diferentes camadas de gordura e o seu uso em experiências in vitro. O método apresentado é eficaz para o isolamento rápido de um grande número de ASC SCA1-positivo, o que é vantajoso sobre o isolamento tecnicamente complexo e caro mediada por FACS de ASC 9,14. Ao contrário de FACS, a separação imunomagnética célula não permite a utilização de antigénio múltiplos para a identificação de uma população de c...

Stem antigénio da célula 1 (Sca1 ou Ly6A / E) foi pela primeira vez identificado como um marcador de superfície celular expressa por hematopoiéticos e células estaminais mesenquimais 5,6. A fracção do estroma vascular (SVF) de tecido adiposo obtidas a partir de depósitos de gordura do rato é uma população heterogénea de células compreendendo de fibroblastos, macrófagos, células endoteliais vasculares, células neuronais, adipócitos e células progenitoras 7. Células progenitoras de adipócitos, ou células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASCs) são células não-lípidos carregados que residem na matriz extracelular rica em colagénio perivascular (ECM) 8. Aproximadamente 50% de SVF consistem de ASC, os quais são caracterizados como linhagem negativa (Lin -) e CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. A maior parte destas células são Sca1 +: CD24 - progenitores de adipócitos, que são capazes de diferenciação de adipócitos in vitro; no entanto, apenas uma fracção das células (0,08% de SVF) constitui Sca1 <saté&gt; +: CD24 + células que são totalmente capazes de proliferar e se diferenciar em adipócitos nas condições in vivo 9. Apesar do potencial ressalva de usar Sca1 + SVF sem discriminar células CD24 + de CD24 - células, isolando Sca1 + ASC de depósitos de gordura, através de separação de células imunomagnï¿½ica é uma abordagem eficiente e prático para determinar o fenótipo de células-autônoma de células progenitoras adipócitos primário. No campo da obesidade e da diabetes, fibrose tecidual e a inflamação desempenha um papel crítico no desenvolvimento e na manutenção de diabetes Tipo 3-2. Recentemente, Tokunaga et al. mostraram que células de alta SCA1 isoladas de inguinal (ou subcutânea, SQ) e perigonadal (ou visceral, VIS) C57BL6 / J depósitos de gordura apresentam diferentes assinaturas genéticas e ECM remodelação in vitro 10. MMP14 (MT1-MMP), um membro prototípico da membrana-tipo metaloproteinase de matriz (MMP) da família medeia o desenvolvimento de tecido adiposo branco (WAT) através da sua actividade colagenolítica 1. Exemplos de ensaios que podem ser realizados com as células isoladas e enriquecidas por meio do seguinte protocolo incluem cultura tridimensional, os estudos de diferenciação, os ensaios de degradação de colagénio, e a sequenciação de ARN 10,11. Ensaios de degradação deve ser conduzida com colágeno extraído-ácido para garantir a preservação da telopï¿½tido 11,12. O protocolo a seguir irá demonstrar os métodos para isolar células estromais vasculares primárias de diferentes depósitos de gordura e enriquecer as células progenitoras adipócitos usando separação de células imunomagnï¿½ica. A validade da separação de células será avaliada com citometria de fluxo e através da utilização de ratinhos Sca1-GFP que expressam GFP em células Sca1 +, conduzido por um promotor Sca1 13.

<table><tbody><tr><td>Tipo 3 colagenase</td><td>Worthington Bioquímica</td><td>LS004182</td><td>digestão tecidual</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Meio de cultura com alto teor de glicose</td></tr><tr><td>Caneta / estreptococo / glutamina (100x)</td> <td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Antibiótico</td></tr><tr><td>anti-anti (100x)</td> <td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Antifúngico</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x, pH 7,4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (0,05%)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>BD Bioscience</td><td>352360</td><td>100-&mu; Filtro de célula m</td></tr><tr><td>Placas de 60 mm</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td>Tesoura Grande</td></tr><tr><td></td><td>FST</td><td>14091-11</td><td>Ponta fina e curva</td></tr><tr><td>Pinça Grande</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Fina</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G 5/8" agulhas</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas 22G de 1,5"</td><td>BD</td><td>305159</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 50 ml Colunas</td> de separação <td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Kit de microesferas Anti-Sca1 (FITC)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-529</td><td>FITC-anti-Sca1 1&ordm; Microesferas Ab e anti-FITC 2&ordm; Ab</td></tr><tr><td>AutoMACS buffer de corrida</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Separador MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas de chux azul</td><td>Fisher</td><td>276-12424</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas absorventes</td><td>Fisher</td><td>19-165-621</td><td></td></tr><tr><td>Placa de isopor</td><td></td><td></td><td>Use de tubos de 50 ml</td></tr><tr><td>70% de etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rato IgG2a Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>R2a21</td><td></td></tr><tr><td>Rato IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>MSCA21</td><td></td></tr><tr><td>Rato IgG2a R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>R2a04</td><td></td></tr><tr><td>Rato IgG2a anti-rato F4/80 R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>MF48004</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de fundo redondo</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (&ndash; Ca, &ndash; Mg)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (+Ca, +Mg)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>Para solução de colagenase</td></tr><tr><td>Colágeno tipo I (2,7 mg/ml em ácido acético de 37 mm</td><td>Preparar em casa12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>0,34 N NaOH</td><td>Preparar em casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>Corning</td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 ácido carboxílico, éster succinimidílico, isômeros mistos</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>0.89 M NaHCO3&nbsp; </td><td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr></tbody></table>

a separação imunomagnética sca1 de gordura depot-específica<sup&gt; alta</sup&gt; células-tronco derivadas de tecido adiposo (asc)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

O isolamento de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs) é um método importante no campo da biologia do tecido adiposo, adipogênese e remodelação da matriz extracelular (MEC). In vivo, o ambiente rico em ECM consistindo de colágenos fibrilares fornece um suporte estrutural aos tecidos adiposos durante a progressão e regressão da obesidade. A remodelação fisiológica da MEC mediada por metaloproteinases da matriz (MMPs) desempenha um papel importante na regulação do tamanho e função do tecido adiposo1,2. A perda da remodelação fisiológica da MEC colagenolítica pode levar ao acúmulo excessivo de colágeno (fibrose tecidual), infiltração de macrófagos e, finalmente, perda da homeostase metabólica, incluindo resistência à insulina3,4. Quando uma alteração fenotípica do tecido adiposo é observada em modelos de camundongos direcionados a genes, isolar ASCs primários de depósitos de gordura para estudos in vitro é uma abordagem eficaz para definir o papel do gene específico na regulação da função dos ASCs. A seguir, definimos uma separação imunomagnética de Sca1ASCs altos.

Enriquecimento de altas ASC SCA1 de diferentes bolsas de gordura. As células estromais vasculares isoladas a partir de SQ visor de gordura do tipo fibroblastos, esticado a forma da célula, independentemente do nível de expressão Sca1 (Figura 1A). Por outro lado, VIS (eWAT derivados) células de baixa SCA1 alta e SCA1 demonstrar diferença distinta na sua forma celular. Como quadr...

Apresentamos as técnicas necessárias para isolar a fração vascular estromal (SVF) de depósitos de tecido adiposo inguinal (subcutâneo) e perigonadal (visceral) de camundongos para avaliar sua expressão gênica e atividade colagenolítica. Este método inclui o enriquecimento de células-tronco derivadas de alto teor adiposo (ASCs) Sca1 usando separação celular imunomagnética.

A separação imunomagnética Sca1 de gordura Depot-específica<sup&gt; alta</sup&gt; células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASC)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar células-tronco mesenquimais positivas para Sca1 a partir de diferentes depósitos de gordura de camundongo. A principal vantagem desta técnica é que, ao utilizar a separação celular baseada em microesferas imunomagnéticas, as células-tronco derivadas de tecido adiposo provenientes de diferentes depósitos de gordura podem ser efetivamente enriquecidas para experimentações subsequentes. Em geral, pesquisadores novos nesta metodologia enfrentarão dificuldades, pois a intensidade e a duração da digestão tecidual mediada por colagenase devem ser otimizadas para obter um número adequado de células para a separação.Para isolar os compartimentos de gordura subcutânea, comece colocando o camundongo sobre uma placa de dissecação de espuma na posição supina e borrifando o animal com etanol a 70%. Após fixar as patas à placa, faça uma pequena incisão na pele do abdômen inferior. Em seguida, segurando o topo do corte com pinça, use tesoura para separar a pele e o peritônio do abdômen até o tórax.Fazendo cortes laterais na pele ao longo do lado do corpo, puxe a pele para longe do peritônio em direção à cabeça. Em seguida, puxe para trás a pele restante, segurando a gordura inguinal afastada do corpo, e use agulhas de calibre 22 para fixar a pele na tábua. A seguir, use a pinça para segurar um dos tecidos adiposos inguinais em sua origem próxima ao peritônio e use tesoura fina para cortar entre a pele e a gordura inguinal, avançando em direção à virilha, evitando contaminar o tecido adiposo subcutâneo com a pele.Em seguida, coloque o coxim adiposo inguinal isolado em uma placa de 60 milímetros rotulada como SQ contendo meio de cultura a 37 graus Celsius e colete o coxim adiposo inguinal do outro lado do animal da mesma maneira. Para isolar os coxins adiposos viscerais, corte o peritônio para expor os coxins adiposos viscerais e o intestino. Em seguida, mova o intestino para o lado, em direção ao tórax.Segurando a bolsa de gordura visceral na extremidade distal, puxe suavemente o tecido adiposo para cima e dissecione-o, tomando cuidado para excluir o tecido epididimal. Em seguida, coloque a bolsa de gordura em uma placa de 60 milímetros rotulada com VIS contendo meio de cultura a 37 graus Celsius. Quando todas as bolsas de gordura tiverem sido coletadas, transfira as placas para uma câmara de cultura celular e aspire o meio.Use uma tesoura curva para picar os coxins. Em seguida, adicione os pedaços de gordura a tubos individuais de 50 mililitros contendo colagenase recém-preparada. Agite os tubos a 300 RPM e 37 graus Celsius por 10 a 20 minutos, até que os tecidos sejam digeridos.Algumas partes do tecido do coxim adiposo subcutâneo ainda podem estar visíveis. Adicione 20 mililitros de meio de cultura à solução de colagenase para interromper a digestão e use uma pipeta serológica de 10 mililitros para aspirar e dispensar a pasta de tecido 10 vezes, a fim de dissociar completamente os tecidos digeridos. Filtre as células através de filtros celulares de 100 mícrons e centrifugue os tecidos.Em seguida, decante cuidadosamente o meio, tomando cuidado para não perturbar os pellets, e ressuspenda suavemente ambos os grupos de células em cinco mililitros de água estéril. Aguarde dois minutos para que os eritrócitos sejam lisados. Em seguida, interrompa a reação em cada tubo com 25 mililitros de meio suplementado com FBS.Filtre ambas as populações de adipócitos através de novos filtros celulares de 100 mícrons, centrifugue novamente e então reconstitua os pellets em um a três mililitros de meio. Após a contagem pelo método de exclusão de azul de tripano, plaque separadamente 1 × 10⁶ células do tecido adiposo subcutâneo e células viscerais em poços individuais de uma placa de cultura celular de seis poços. Após a tripsinização das células, dilua a tripsina com um mililitro de tampão de separação e então centrifugue as placas de cultura.Suspendemos as células em 500 microlitros por tubo de tampão de separação e centrifugamos as células novamente. Agora, ressuspenda as células em 90 microlitros por tubo de tampão de separação e adicione 10 microlitros do anticorpo primário anti-Sca1 FITC à suspensão celular. Após 10 minutos de incubação a quatro graus Celsius no escuro, lave as células com um mililitro de tampão de separação por tubo.Após a centrifugação, as células são ressuspendidas em 80 microlitros de tampão de separação por suspensão celular. Em seguida, adicione 20 microlitros de microesferas anti-FITC em cada poço e coloque as placas a quatro graus Celsius, protegidas da luz, durante 15 minutos. Ao final da incubação, lave as células com um mililitro de tampão de separação e ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão fresco por tubo.Agora, coloque uma coluna no suporte magnético e lave a coluna com 500 microlitros de tampão de separação. Transfira as células do cultivo de tecido do coxim adiposo subcutâneo para a coluna, tomando cuidado para evitar bolhas, e colete as células negativas para Sca1 não marcadas em um tubo cônico de 15 mililitros. Quando todas as células tiverem passado, lave a coluna três vezes com 500 microlitros de tampão de separação.Em seguida, transfira a coluna do ímã para um novo tubo cônico de 15 mililitros e empurre um mililitro de tampão de separação fresco através da coluna para eluir as células positivas para Sca1. Por fim, centrifugue ambas as frações celular positiva e negativa para Sca1 e reconstitua os pellets em um mililitro de meio de cultura. Em seguida, conte o número de células em cada fração e plaque as frações em poços individuais de uma nova placa de cultura celular de seis poços.Células estromais vasculares isoladas de gordura subcutânea exibem uma forma alongada semelhante à de fibroblastos, independentemente do seu nível de expressão de Sca1. Assim como as células derivadas de gordura inguinal subcutânea com alta expressão de Sca1, as células derivadas de gordura epididimal visceral com alta expressão de Sca1 apresentam uma forma celular alongada semelhante à de fibroblastos. Já as células VIS Sca1 baixas exibem uma forma epiteloide.Células Sca1 altas isoladas de camundongos Sca1-GFP são facilmente identificadas como células GFP positivas em cultura de tecidos. De fato, quando essas células são avaliadas por citometria de fluxo, a maioria das células GFP positivas é confirmada como expressando proteínas Sca1 em suas superfícies celulares, conforme detectado por anticorpo anti-Sca1. Combinado com análises de PCR em tempo real, pode-se demonstrar a expressão diferencial das metaloproteinases matriciais colagenolíticas entre células-tronco derivadas de adipócitos Sca1 altas provenientes de gordura inguinal e epididimal.Além disso, quando géis de colágeno tipo I marcados com fluoresceína são utilizados para avaliar a atividade de degradação pericelular, observa-se uma atividade marcadamente aumentada de remodelação do colágeno mediada por células-tronco derivadas do tecido adiposo visceral Sca1 high. Uma vez dominado, o isolamento de células do tecido adiposo pode ser concluído em duas horas, se realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter um campo cirúrgico limpo e organizado para garantir um isolamento eficiente do tecido adiposo.Após este procedimento, outros métodos, como um ensaio de degradação de colágeno, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre o remodelamento tecidual mediado por células-tronco derivadas de tecido adiposo. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de obesidade e biologia da matriz explorarem o papel das células-tronco derivadas de tecido adiposo no remodelamento e na função do tecido adiposo em camundongos e humanos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter e enriquecer células primárias positivas para Sca1 a partir de depósitos de tecido adiposo.

immunomagnetic-separation-fat-depot-specific-sca1high-adipose-derived

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo demonstra uma técnica para isolar e cultivar células-tronco derivadas do tecido adiposo do arco periaórtico murino marcadas com fluorescência (ADSCs) do tecido adiposo do arco periaórtico murino. Após o isolamento, os NCADSCs são detectados, classificados usando classificação de células ativadas por fluorescência e, posteriormente, cultivados em uma placa, promovendo a proliferação celular.

Isolando células-tronco derivadas de tecido adiposo do tecido adiposo periaórtico murino

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Isolamento Eficiente de Células-Tronco e Adipócitos Derivados do Adiposo a partir do Tecido Adiposo Suíno

Aprenda a isolar células-tronco mesenquimais Sca1 positivas de tecido adiposo de camundongos usando separação imunomagnética. Este método enriquece células de diferentes depósitos de gordura para estudos de biologia de células-tronco.

A separação imunomagnética Sca1 de gordura Depot-específica

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