Name: A separação imunomagnética Sca1 de gordura Depot-específica alta células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASC) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco mesenquimais Sca1 positivas de tecido adiposo de camundongos usando separação imunomagnética. Este método enriquece células de diferentes depósitos de gordura para estudos de biologia de células-tronco.

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Este trabalho é apoiado pelo NIH DK095137 (de THC). Agradecemos aos membros do laboratório atuais e antigos que contribuíram para o desenvolvimento e sofisticação dos métodos descritos.

Declaração de Ética: A Universidade de Michigan Comitê de Uso e tratamento dos animais (UCUCA) aprovou todos os métodos e protocolos, de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Instituto de Pesquisa Animal Laboratory, Conselho Nacional de Pesquisa). Os ratinhos são mantidos no biotério da Universidade de Michigan e é dado livre acesso a comida e água e mantidos numa / ciclo de luz escuro de 12 h. 1. Preparações <ol><li> Preparar meios de cultura primária com DMEM, 10% de FBS, 1x P / S / G e 1x antibióticos / antifúngicos. Isto irá ser utilizado para manter tecidos na digestão antes. Coloque estoque e da alíquota em 37 banho de água ºC. </li><li> Prepare cinco mililitros de solução de colagenase Tipo III em 5 mg / ml dissolvida em HBSS (+ Ca, Mg +) para cada tipo de almofada de gordura a ser isolado, até cinco ratos. Por exemplo, quando se isola SQ e VIS de um único genótipo, fazer 10 ml, se do tipo selvagem e mutante SQ e VIS, fazer 20 ml. Ajustar o pH para 7,4 e steirritar filtro. Aliquota em tubos de 50 ml. Separe longe da luz. </li><li> Use 70% de etanol para desinfectar campo cirúrgico. Limpe e cubra com uma almofada azul. Borrife um pouco de etanol no bloco azul. </li><li> Use os 22 g de agulhas de definir uma almofada absorvente para a placa de isopor e cortar com uma tesoura. Pulverizar o pad com etanol, em seguida, definir a bordo na plataforma azul e cubra com outra almofada azul até começando dissecção. </li><li> Encha dois tubos de 50 ml com etanol e coloque em uma posição adjacente ao campo cirúrgico. Coloque as tesouras e pinças do etanol. </li><li> Encher outro tubo de 50 ml com PBS acrescido 1x anti-anti para enxaguar etanol off instrumentos cirúrgicos. </li><li> Na capa, etiqueta 60 mm pratos para cada tipo de tecido e encher com meios de cultura aquecido a 37 ºC. Colocar as placas adjacentes à área cirúrgica. </li></ol> 2. Isolamento de subcutânea (SQ) Fat Pads <ol><li> Euthanize rato com uma overdose de isoflurano e pneumotórax. </li><li> Suavementespray de rato com 70% de etanol e leigos supina. Pin as patas para a placa de espuma com 22 agulhas G. </li><li> Faça um pequeno corte na pele do abdômen inferior. Segurando a parte superior do corte com a pinça, pegue a tesoura e separar a pele do peritônio. </li><li> Uma vez que a pele é separada do peritoneu do abdómen ao tórax, reflectir a pele para longe do peritoneu para a cabeça, fazendo cortes laterais na pele ao longo do lado do corpo. </li><li> Refletir o restante da pele segurando a gordura inguinal longe do corpo e fixar para baixo à placa com 22 agulhas G. </li><li> Mudar para uma tesoura fina e fórceps. Agarre a almofada de gordura inguinal com a pinça na origem perto do peritônio e snip de distância entre a pele e gordura inguinal progredindo em direção a virilha evitando a contaminação do SQ com a pele. </li><li> Coloque a almofada de gordura inguinal insolated no prato mm marcado 60. </li></ol> 3. Isolamento da Visceral (VIS) bolsas de gordura <ol><li> De uma maneira semelhante ao passo 2.5, cortar o peritoneu aberto para expor o almofadas de gordura visceral e intestino. </li><li> Mova o intestino em direção ao tórax. </li><li> Agarre a almofada de gordura VIS na extremidade distal e puxe para cima. Dissecar a almofada de gordura VIS, tendo o cuidado de excluir do epidídimo (ou uterina, se utilizando do sexo feminino camundongos) do tecido. </li><li> Coloque no prato rotulados e repita o passo 3.3 para o bloco restante VIS. </li></ol> 4. A colagenase digestão da gordura Pads <ol><li> Mova 60 mm pratos para a capa de cultura de tecidos e aspirar off mídia. </li><li> Picar as bolsas de gordura com tesoura curva, em seguida, adicionar a solução de colagenase. Certifique-se de lavar as tesouras e pinças entre tipos de tecido com etanol e PBS. </li><li> Agitar a 300 rpm e 37 ° C durante 10-20 minutos, até que os tecidos são digeridos. É aceitável se algumas peças de SQ ainda são visíveis. Esta questão será abordada em uma etapa posterior. </li><li> Adicionar 25 ml de meio de cultura para a solução de colagenase para parar o collagtratamento Enase e pipeta cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta 10 ml sorológico para dispersar os tecidos digeridos. </li><li> As células da estirpe utilizando um filtro de células 100 mm. Centrifugar durante 10 minutos a 300 x g. </li><li> Cuidadosamente decantar media para não perturbar o sedimento e adicionar 5 ml de água estéril para o sedimento e gentilmente pipeta de suspender as células. Espera 2 minutos para lisar os eritrócitos. </li><li> Adicionar 25 ml de meio com células FBS e deformação de 10% através de um novo filtro de células 100 mm. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 300 x g. Decantar e meios sedimento ressuspender em 1 ml de meio de cultura. </li><li> Contar as células com um hemocitómetro utilizando 1: 1 de azul de tripano. </li><li> Placa 1 X 10 6 células num poço de uma placa de 6 poços. </li></ol> 5. Separação celular Magnetic <ol><li> Depois de cerca de 4 a 6 horas de adesão celular, lavar as células duas vezes com HBSS (-Ca, Mg). Separar as células aderentes utilizando 0,05% de tripsina. Diluir suspensão de células de tripsina em 1 ml de tampão de separação e rotação para5 min a 300 x g. </li><li> Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 500 ul de tampão. Remove-se uma alíquota de 10 ul e contar as células utilizando um hemocitómetro. </li><li> células de centrifugação durante 5 min a 300 x g. </li><li> Aspirar o sobrenadante completamente. Ressuspender as células em 90 ul de tampão. Adiciona-se 10 de anticorpo primário anti-Sca1-FITC ul. Misture bem e incubar por 10 minutos a 4 ºC no escuro. </li><li> Lavar as células com 1 ml de tampão e células de centrifugação durante 5 minutos a 300 x g. Remover o sobrenadante completamente. </li><li> Ressuspender as células em 80 ul de tampão. Adicionar 20 pi microesferas anti-FITC. Misture bem e incubar durante 15 min a 4 ºC no escuro. </li><li> Lavar as células com 1 ml de tampão e células de centrifugação durante 5 minutos a 300 x g. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 ul de tampão. </li><li> Coloque coluna no suporte magnético e lave coluna com 500 ul de tampão. </li><li> Adicionar a suspensão de células em coluna. Evitar bolhas enquanto pipetagem. </li><li> Recolher o Sca1 não marcado - &lt;/ Sup&gt; células e lavagem da coluna 3 vezes com 500 ul de tampão. Apenas adicionar novo buffer quando o reservatório está vazio. Evitar bolhas enquanto pipetagem. </li><li> Remover a coluna do suporte magnético e coloque em um tubo de 15 ml. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão de coluna e eluir Sca1 + empurrando o êmbolo fornecido através do reservatório coluna. </li><li> Girar as fracções de células durante 5 min a 300 x g. Ressuspender as células em 1 ml de meio de cultura. </li><li> Remove-se uma alíquota de 10 ul das fracções marcadas e não marcadas e contar as células utilizando um hemocitómetro. </li><li> Placa cada fracção de células em um poço de uma placa de 6 poços. </li></ol> 6. Verificação de Separação Immunomagnetic de Sca1 alta ACSs com Citometria de Fluxo <ol><li> Lavar as células duas vezes com HBSS (-Ca, Mg) e dissociar as células usando tripsina a 0,05%. </li><li> células centrifugar a 300 xg por 5 min. Ressuspender as células em meios de cultura 1 ml e contar com um hemocitômetro. </li><li> Obter&gt; 10 6 </sup&gt; células em 1 mL de meios de cultura e centrifugar a 300 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e repita o passo 6.3 mais duas vezes. </li><li> Ressuspender as células com 1 ml de soro de cabra 2% + BSA a 2% e de bloco, durante 30 min à TA. </li><li> células centrifugar a 300 xg por 5 min. </li><li> Remover solução de bloqueio. </li><li> Adicionar ratazana IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 g, 1: 400) ou anti-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 g, 1: 400), em 100 ul de PBS com soro de cabra 2% e 2% de BSA + PBS a 4 ° C durante 30 min no escuro. </li><li> Adicionar 1 ml de PBS frio a células. Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e repita o passo 6.9 mais duas vezes. </li><li> Ressuspender as células em 1 ml de PBS. Passa suspensões de células através de um coador de células de 100 um em preparação para a análise por citometria de fluxo. </li></ol>

<ol><li>Chun, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pericellular+collagenase+directs+the+3-dimensional+development+of+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue.</a> Cell. 125 (3), 577-591 (2006).</li>
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<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
<li>Tokunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+depot-specific+gene+signature+and+ECM+remodeling+of+Sca1%28high%29+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells.</a> Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).</li>
<li>Chun, T. H., Inoue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+adipocyte+differentiation+and+peri-adipocyte+collagen+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover.</a> Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).</li>
<li>Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ready-to-use%2C+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li>
<li>Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ly-6A+%28Sca-1%29+GFP+Transgene+is+Expressed+in+all+Adult+Mouse+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).</li>
<li>Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+adipocyte+cellular+lineage+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo.</a> Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).</li>
<li>Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+depot-specific+activation+of+adipocyte+precursor+cells+at+the+onset+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).</li>
<li>Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+Expression+of+Extracellular+Matrix+in+Subcutaneous+Adipose+Tissue+Development+and+Adipogenesis%3B+Comparison+with+Visceral+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue.</a> Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).</li>
<li>Ong, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Specific+Cell-Surface+Markers+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Subcutaneous+and+Visceral+Fat+Depots%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Aqui demonstramos o isolamento e separação de células imunomagnética de ASC de murino a partir de diferentes camadas de gordura e o seu uso em experiências in vitro. O método apresentado é eficaz para o isolamento rápido de um grande número de ASC SCA1-positivo, o que é vantajoso sobre o isolamento tecnicamente complexo e caro mediada por FACS de ASC 9,14. Ao contrário de FACS, a separação imunomagnética célula não permite a utilização de antigénio múltiplos para a identificação de uma população de c...

Stem antigénio da célula 1 (Sca1 ou Ly6A / E) foi pela primeira vez identificado como um marcador de superfície celular expressa por hematopoiéticos e células estaminais mesenquimais 5,6. A fracção do estroma vascular (SVF) de tecido adiposo obtidas a partir de depósitos de gordura do rato é uma população heterogénea de células compreendendo de fibroblastos, macrófagos, células endoteliais vasculares, células neuronais, adipócitos e células progenitoras 7. Células progenitoras de adipócitos, ou células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASCs) são células não-lípidos carregados que residem na matriz extracelular rica em colagénio perivascular (ECM) 8. Aproximadamente 50% de SVF consistem de ASC, os quais são caracterizados como linhagem negativa (Lin -) e CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. A maior parte destas células são Sca1 +: CD24 - progenitores de adipócitos, que são capazes de diferenciação de adipócitos in vitro; no entanto, apenas uma fracção das células (0,08% de SVF) constitui Sca1 <saté&gt; +: CD24 + células que são totalmente capazes de proliferar e se diferenciar em adipócitos nas condições in vivo 9. Apesar do potencial ressalva de usar Sca1 + SVF sem discriminar células CD24 + de CD24 - células, isolando Sca1 + ASC de depósitos de gordura, através de separação de células imunomagnï¿½ica é uma abordagem eficiente e prático para determinar o fenótipo de células-autônoma de células progenitoras adipócitos primário. No campo da obesidade e da diabetes, fibrose tecidual e a inflamação desempenha um papel crítico no desenvolvimento e na manutenção de diabetes Tipo 3-2. Recentemente, Tokunaga et al. mostraram que células de alta SCA1 isoladas de inguinal (ou subcutânea, SQ) e perigonadal (ou visceral, VIS) C57BL6 / J depósitos de gordura apresentam diferentes assinaturas genéticas e ECM remodelação in vitro 10. MMP14 (MT1-MMP), um membro prototípico da membrana-tipo metaloproteinase de matriz (MMP) da família medeia o desenvolvimento de tecido adiposo branco (WAT) através da sua actividade colagenolítica 1. Exemplos de ensaios que podem ser realizados com as células isoladas e enriquecidas por meio do seguinte protocolo incluem cultura tridimensional, os estudos de diferenciação, os ensaios de degradação de colagénio, e a sequenciação de ARN 10,11. Ensaios de degradação deve ser conduzida com colágeno extraído-ácido para garantir a preservação da telopï¿½tido 11,12. O protocolo a seguir irá demonstrar os métodos para isolar células estromais vasculares primárias de diferentes depósitos de gordura e enriquecer as células progenitoras adipócitos usando separação de células imunomagnï¿½ica. A validade da separação de células será avaliada com citometria de fluxo e através da utilização de ratinhos Sca1-GFP que expressam GFP em células Sca1 +, conduzido por um promotor Sca1 13.

<table><tbody><tr><td>Tipo 3 colagenase</td><td>Worthington Bioquímica</td><td>LS004182</td><td>digestão tecidual</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Meio de cultura com alto teor de glicose</td></tr><tr><td>Caneta / estreptococo / glutamina (100x)</td> <td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Antibiótico</td></tr><tr><td>anti-anti (100x)</td> <td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Antifúngico</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x, pH 7,4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (0,05%)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>BD Bioscience</td><td>352360</td><td>100-&mu; Filtro de célula m</td></tr><tr><td>Placas de 60 mm</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td>Tesoura Grande</td></tr><tr><td></td><td>FST</td><td>14091-11</td><td>Ponta fina e curva</td></tr><tr><td>Pinça Grande</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Fina</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G 5/8" agulhas</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas 22G de 1,5"</td><td>BD</td><td>305159</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 50 ml Colunas</td> de separação <td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Kit de microesferas Anti-Sca1 (FITC)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-529</td><td>FITC-anti-Sca1 1&ordm; Microesferas Ab e anti-FITC 2&ordm; Ab</td></tr><tr><td>AutoMACS buffer de corrida</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Separador MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas de chux azul</td><td>Fisher</td><td>276-12424</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas absorventes</td><td>Fisher</td><td>19-165-621</td><td></td></tr><tr><td>Placa de isopor</td><td></td><td></td><td>Use de tubos de 50 ml</td></tr><tr><td>70% de etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rato IgG2a Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>R2a21</td><td></td></tr><tr><td>Rato IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>MSCA21</td><td></td></tr><tr><td>Rato IgG2a R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>R2a04</td><td></td></tr><tr><td>Rato IgG2a anti-rato F4/80 R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>MF48004</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de fundo redondo</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (&ndash; Ca, &ndash; Mg)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (+Ca, +Mg)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>Para solução de colagenase</td></tr><tr><td>Colágeno tipo I (2,7 mg/ml em ácido acético de 37 mm</td><td>Preparar em casa12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>0,34 N NaOH</td><td>Preparar em casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>Corning</td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 ácido carboxílico, éster succinimidílico, isômeros mistos</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>0.89 M NaHCO3&nbsp; </td><td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr></tbody></table>

a separação imunomagnética sca1 de gordura depot-específica<sup&gt; alta</sup&gt; células-tronco derivadas de tecido adiposo (asc)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

O isolamento de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs) é um método importante no campo da biologia do tecido adiposo, adipogênese e remodelação da matriz extracelular (MEC). In vivo, o ambiente rico em ECM consistindo de colágenos fibrilares fornece um suporte estrutural aos tecidos adiposos durante a progressão e regressão da obesidade. A remodelação fisiológica da MEC mediada por metaloproteinases da matriz (MMPs) desempenha um papel importante na regulação do tamanho e função do tecido adiposo1,2. A perda da remodelação fisiológica da MEC colagenolítica pode levar ao acúmulo excessivo de colágeno (fibrose tecidual), infiltração de macrófagos e, finalmente, perda da homeostase metabólica, incluindo resistência à insulina3,4. Quando uma alteração fenotípica do tecido adiposo é observada em modelos de camundongos direcionados a genes, isolar ASCs primários de depósitos de gordura para estudos in vitro é uma abordagem eficaz para definir o papel do gene específico na regulação da função dos ASCs. A seguir, definimos uma separação imunomagnética de Sca1ASCs altos.

Enriquecimento de altas ASC SCA1 de diferentes bolsas de gordura. As células estromais vasculares isoladas a partir de SQ visor de gordura do tipo fibroblastos, esticado a forma da célula, independentemente do nível de expressão Sca1 (Figura 1A). Por outro lado, VIS (eWAT derivados) células de baixa SCA1 alta e SCA1 demonstrar diferença distinta na sua forma celular. Como quadr...

Apresentamos as técnicas necessárias para isolar a fração vascular estromal (SVF) de depósitos de tecido adiposo inguinal (subcutâneo) e perigonadal (visceral) de camundongos para avaliar sua expressão gênica e atividade colagenolítica. Este método inclui o enriquecimento de células-tronco derivadas de alto teor adiposo (ASCs) Sca1 usando separação celular imunomagnética.

A separação imunomagnética Sca1 de gordura Depot-específica<sup&gt; alta</sup&gt; células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASC)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar células-tronco mesenquimais positivas para Sca1 a partir de diferentes depósitos de gordura de camundongo. A principal vantagem desta técnica é que, ao utilizar a separação celular baseada em microesferas imunomagnéticas, as células-tronco derivadas de tecido adiposo provenientes de diferentes depósitos de gordura podem ser efetivamente enriquecidas para experimentações subsequentes. Em geral, pesquisadores novos nesta metodologia enfrentarão dificuldades, pois a intensidade e a duração da digestão tecidual mediada por colagenase devem ser otimizadas para obter um número adequado de células para a separação.Para isolar os compartimentos de gordura subcutânea, comece colocando o camundongo sobre uma placa de dissecação de espuma na posição supina e borrifando o animal com etanol a 70%. Após fixar as patas à placa, faça uma pequena incisão na pele do abdômen inferior. Em seguida, segurando o topo do corte com pinça, use tesoura para separar a pele e o peritônio do abdômen até o tórax.Fazendo cortes laterais na pele ao longo do lado do corpo, puxe a pele para longe do peritônio em direção à cabeça. Em seguida, puxe para trás a pele restante

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo demonstra uma técnica para isolar e cultivar células-tronco derivadas do tecido adiposo do arco periaórtico murino marcadas com fluorescência (ADSCs) do tecido adiposo do arco periaórtico murino. Após o isolamento, os NCADSCs são detectados, classificados usando classificação de células ativadas por fluorescência e, posteriormente, cultivados em uma placa, promovendo a proliferação celular.

Isolando células-tronco derivadas de tecido adiposo do tecido adiposo periaórtico murino

Em 2001, pesquisadores da UCLA descreveu o isolamento de uma população de células-tronco adultas, chamadas células-tronco derivadas de tecido adiposo ou ASC, a partir de tecido adiposo. Este artigo descreve o isolamento de ASC de lipoaspirates usando, um protocolo de digestão enzimática manual utilizando colagenase.

Isolamento manual de células-tronco adiposo-derivadas de Lipoaspirates Humanos

A heterogeneidade transcricional dentro das células estromais derivadas do tecido adiposo humano pode ser definida no nível de célula única usando marcadores de superfície celular e genes osteogênicos.  Descrevemos um protocolo que utiliza citometria de fluxo para o isolamento de subpopulações celulares com potencial osteogênico aumentado, que pode ser usado para melhorar a reconstrução esquelética craniofacial.

Isolamento e Enriquecimento da Human adiposo-derivadas células estromais para Osteogenesis Aprimorado

Este protocolo fornece um método livre de enzimas para isolar as células-tronco mesenquímicas de abdominoplastia e amostras lipoaspirate usando um método explant. A ausência de enzimas duras ou etapas de centrífuga fornece células-tronco clinicamente relevantes que podem ser usadas para estudos in vitro ou transferidas de volta para a clínica.

Um método sem enzimas para isolamento e expansão de células-tronco mesenchymal derivadas do adiposo humano

Este protocolo descreve a abordagem técnica para isolar subpopulações de células estromais adipogênicas e fibroinflamatórias de depósitos de tecido adiposo branco intra-abdominal murino (WAT) por classificação de células ativadas por fluorescência ou separação de esferas imunomagnéticas.

Isolamento de Subpopulações de Células Estromais Adipogênicas e Fibro-Inflamatórias de Depósitos Adiposos Intra-Abdominais Murinos

Apresentamos um método simples para isolar células progenitoras adiposas altamente viáveis de almofadas de gordura epidímica do rato usando a triagem celular ativada por fluorescência.

Preparação de células progenitoras adiposas adiposas de tecidos adiposos epidímicos do rato

O presente protocolo descreve uma metodologia aprimorada para o isolamento de ADSC, resultando em um tremendo rendimento celular com ganho de tempo em comparação com a literatura. Este estudo também fornece um método simples para a obtenção de um número relativamente grande de células viáveis após a crioppreservação a longo prazo.

Técnica para obtenção de células-tronco mesenquimais a partir da caracterização do tecido adiposo e da fração vascular estromal em criopreservação a longo prazo

Este protocolo descreve uma metodologia para isolar e identificar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do tecido adiposo de ratos Sprague Dawley.

Isolamento e Identificação de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas do Tecido Adiposo de Ratos Sprague Dawley

O tecido adiposo é uma excelente fonte de células-tronco mesenquimais. Aqui, trazemos a extração, cultivo e caracterização passo a passo de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs) do tecido adiposo epididimal de camundongos suíços.

Isolamento, expansão in vitro e caracterização de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo epididimal de camundongos

Este protocolo descreve todos os procedimentos, desde a cultura de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano (ADSCs) e coleta de sobrenadante até a extração de vesículas extracelulares (EVs) usando ultracentrifugação.

Purificação e Caracterização de Vesículas Extracelulares de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas de Tecido Adiposo Humano

Aqui, apresentamos um método padrão para isolar eficientemente células-tronco e adipócitos derivados do adiposo, caracterizado por redução de &gt;90% no tempo de processamento, alta viabilidade celular e ampla compatibilidade.

Isolamento Eficiente de Células-Tronco e Adipócitos Derivados do Adiposo a partir do Tecido Adiposo Suíno

Aprenda a isolar células-tronco mesenquimais Sca1 positivas de tecido adiposo de camundongos usando separação imunomagnética. Este método enriquece células de diferentes depósitos de gordura para estudos de biologia de células-tronco.

A separação imunomagnética Sca1 de gordura Depot-específica

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