A separação imunomagnética Sca1 de gordura Depot-específica ^alta células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASC)

O objetivo geral deste procedimento é isolar células-tronco mesenquimais positivas para Sca1 de várias almofadas de gordura de camundongo. A principal vantagem desta técnica é que, usando a classificação de células baseada em esferas imunomagnéticas, as células-tronco derivadas do tecido adiposo de diferentes depósitos de gordura podem ser efetivamente enriquecidas para experimentos subsequentes. Geralmente, os investigadores novos neste método terão dificuldades porque a força e a duração da digestão do tecido mediada pela colagenase devem ser otimizadas para obter um número adequado de células para classificação.

Para isolar as bolsas de gordura subcutânea, comece colocando o camundongo em uma placa de dissecação de espuma em decúbito dorsal e borrifando o animal com etanol a 70%. Depois de prender as patas à prancha, faça uma pequena incisão na pele da parte inferior do abdômen. Em seguida, segurando a parte superior do corte com uma pinça, use uma tesoura para separar a pele e o peritônio do abdômen ao tórax.

Fazer cortes laterais na pele, ao longo da lateral do corpo, reflete a pele do peritônio em direção à cabeça. Em seguida, puxe a pele restante, mantendo a gordura inguinal longe do corpo, e use agulhas de calibre 22 para prender a pele na placa. Em seguida, use a pinça para agarrar uma almofada de gordura inguinal em sua origem perto do peritônio e use uma tesoura fina para cortar entre a pele e a gordura inguinal, progredindo em direção à virilha e evitando contaminar a almofada de gordura subcutânea com a pele.

Em seguida, coloque a almofada de gordura inguinal isolada em um prato de 60 milímetros rotulado com SQ contendo meio de cultura de 37 graus Celsius e colha a almofada de gordura inguinal do outro lado do animal da mesma maneira. Para isolar as bolsas de gordura visceral, corte o peritônio para expor as bolsas de gordura visceral e o intestino. Em seguida, mova o intestino para o lado, em direção ao tórax.

Segurando a almofada de gordura visceral na extremidade distal, puxe suavemente o tecido adiposo e disseque-o, tomando cuidado para excluir o tecido epididimal. Em seguida, coloque a almofada de gordura em um prato de 60 milímetros rotulado com VIS contendo meio de cultura de 37 graus Celsius. Quando todas as almofadas de gordura tiverem sido coletadas, transfira os pratos para uma capa de cultura de tecidos e aspire o meio.

Use uma tesoura curva para picar as almofadas. Em seguida, adicione os pedaços de gordura a tubos individuais de 50 mililitros contendo colagenase recém-preparada. Em seguida, agite os tubos a 300 RPM e 37 graus Celsius por 10 a 20 minutos, até que os tecidos sejam digeridos.

Alguns pedaços de tecido de gordura subcutânea ainda podem ser visíveis. Adicione 20 mililitros de meio de cultura à solução de colagenase para interromper a digestão e use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para aspirar e dispensar a pasta de tecido 10 vezes para dissociar totalmente os tecidos digeridos. Filtre as células através de filtros de células de 100 mícrons e centrifugue os tecidos.

Em seguida, decantar cuidadosamente o meio, tomando cuidado para não perturbar os pellets, e ressuspender suavemente os dois grupos de células em cinco mililitros de água estéril. Aguarde dois minutos para que os eritrócitos sejam lisados. Em seguida, interrompa a reação em cada tubo com 25 mililitros de meio suplementado com FBS.

Filtre ambas as populações de adipócitos através de novos filtros de células de 100 mícrons, gire-os novamente e, em seguida, ressuspenda os pellets em um a três mililitros de meio. Após a contagem por exclusão de azul de tripano, coloque separadamente uma vez dez elevado ao sexto tecido adiposo subcutâneo e células viscerais em poços individuais de uma placa de cultura de células de seis poços. Depois de tripsinizar as células, diluir a tripsina com um mililitro de tampão de separação e, em seguida, centrifugar as placas de cultura.

Suspendemos as células em 500 microlitros por tubo de tampão de separação e centrifugamos as células novamente. Agora, ressuspenda as células em 90 microlitros por tubo de tampão de separação e misture 10 microlitros de anticorpo primário anti-Sca1 FITC na suspensão celular. Após 10 minutos de incubação a quatro graus Celsius no escuro, lave as células com um mililitro de tampão de separação por tubo.

Após a rotação, as células são ressuspensas em 80 microlitros de tampão de separação por suspensão celular. Em seguida, misture 20 microlitros de microesferas Anti-FITC em cada poço e coloque as placas a quatro graus Celsius, protegidas da luz por 15 minutos. No final da incubação, lave as células em um mililitro de tampão de separação e ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão fresco por tubo.

Agora, coloque uma coluna no suporte magnético e enxágue a coluna com 500 microlitros de tampão de separação. Transfira as células da cultura de tecido de almofada de gordura subcutânea para a coluna, tomando cuidado para evitar bolhas, e colete as células Sca1 negativas não marcadas em um tubo cônico de 15 mililitros. Quando todas as células tiverem passado, lave a coluna três vezes com 500 microlitros de tampão de separação.

Em seguida, transfira a coluna do ímã para um novo tubo cônico de 15 mililitros e mergulhe um mililitro de tampão de separação novo através da coluna para eluir as células positivas Sca1. Finalmente, desacelere as frações celulares positivas e negativas de Sca1 e ressuspenda os pellets em um mililitro de meio de cultura. Em seguida, conte o número de células em cada fração e coloque as frações em poços individuais de uma nova placa de cultura de células de seis poços.

As células estromais vasculares isoladas da gordura subcutânea exibem uma forma de célula esticada semelhante a fibroblastos, independentemente de seu nível de expressão de Sca1. Como as células altas Sca1 derivadas da gordura inguinal subcutânea, as células altas Sca1 derivadas da gordura epididimal visceral exibem uma forma de célula esticada semelhante a fibroblastos. Enquanto as células baixas VIS Sca1 exibem uma forma epitelioide.

Células Sca1 altas isoladas de camundongos Sca1-GFP isolados são facilmente identificadas como células GFP positivas em cultura de tecidos. De fato, quando essas células são avaliadas por citometria de fluxo, a maioria das células positivas para GFP é confirmada para expressar proteínas Sca1 em suas superfícies celulares, conforme detectado pelo anticorpo anti-Sca1. Juntamente com análises de PCR em tempo real, a expressão diferencial das metaloproteinases da matriz colagenolítica entre células-tronco derivadas de gordura Sca1 derivadas de gordura inguinal e epididimal pode ser demonstrada.

Além disso, quando géis de colágeno tipo I marcados com fluoresceína são usados para avaliar a atividade de degradação pericelular, observa-se um aumento acentuado da atividade de remodelação do colágeno mediada por células-tronco viscerais derivadas de Sca1 com alto teor de gordura. Uma vez dominado, o isolamento das células do coxim adiposo pode ser concluído em duas horas se for realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter um campo cirúrgico limpo e organizado para garantir um isolamento eficiente da almofada de gordura.

Após este procedimento, outros métodos, como um ensaio de degradação do colágeno, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a remodelação do tecido mediada por células-tronco derivadas do tecido adiposo. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da obesidade e biologia da matriz explorarem o papel das células-tronco derivadas do tecido adiposo na remodelação e função do tecido adiposo em camundongos e humanos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter e enriquecer células Sca1 positivas primárias de depósitos de tecido adiposo.