A separação imunomagnética Sca1 de gordura Depot-específica

O objetivo geral deste procedimento é isolar células-tronco mesenquimais positivas para Sca1 a partir de diferentes depósitos de gordura de camundongo. A principal vantagem desta técnica é que, ao utilizar a separação celular baseada em microesferas imunomagnéticas, as células-tronco derivadas de tecido adiposo provenientes de diferentes depósitos de gordura podem ser efetivamente enriquecidas para experimentações subsequentes. Em geral, pesquisadores novos nesta metodologia enfrentarão dificuldades, pois a intensidade e a duração da digestão tecidual mediada por colagenase devem ser otimizadas para obter um número adequado de células para a separação.

Para isolar os compartimentos de gordura subcutânea, comece colocando o camundongo sobre uma placa de dissecação de espuma na posição supina e borrifando o animal com etanol a 70%. Após fixar as patas à placa, faça uma pequena incisão na pele do abdômen inferior. Em seguida, segurando o topo do corte com pinça, use tesoura para separar a pele e o peritônio do abdômen até o tórax.

Fazendo cortes laterais na pele ao longo do lado do corpo, puxe a pele para longe do peritônio em direção à cabeça. Em seguida, puxe para trás a pele restante, segurando a gordura inguinal afastada do corpo, e use agulhas de calibre 22 para fixar a pele na tábua. A seguir, use a pinça para segurar um dos tecidos adiposos inguinais em sua origem próxima ao peritônio e use tesoura fina para cortar entre a pele e a gordura inguinal, avançando em direção à virilha, evitando contaminar o tecido adiposo subcutâneo com a pele.

Em seguida, coloque o coxim adiposo inguinal isolado em uma placa de 60 milímetros rotulada como SQ contendo meio de cultura a 37 graus Celsius e colete o coxim adiposo inguinal do outro lado do animal da mesma maneira. Para isolar os coxins adiposos viscerais, corte o peritônio para expor os coxins adiposos viscerais e o intestino. Em seguida, mova o intestino para o lado, em direção ao tórax.

Segurando a bolsa de gordura visceral na extremidade distal, puxe suavemente o tecido adiposo para cima e dissecione-o, tomando cuidado para excluir o tecido epididimal. Em seguida, coloque a bolsa de gordura em uma placa de 60 milímetros rotulada com VIS contendo meio de cultura a 37 graus Celsius. Quando todas as bolsas de gordura tiverem sido coletadas, transfira as placas para uma câmara de cultura celular e aspire o meio.

Use uma tesoura curva para picar os coxins. Em seguida, adicione os pedaços de gordura a tubos individuais de 50 mililitros contendo colagenase recém-preparada. Agite os tubos a 300 RPM e 37 graus Celsius por 10 a 20 minutos, até que os tecidos sejam digeridos.

Algumas partes do tecido do coxim adiposo subcutâneo ainda podem estar visíveis. Adicione 20 mililitros de meio de cultura à solução de colagenase para interromper a digestão e use uma pipeta serológica de 10 mililitros para aspirar e dispensar a pasta de tecido 10 vezes, a fim de dissociar completamente os tecidos digeridos. Filtre as células através de filtros celulares de 100 mícrons e centrifugue os tecidos.

Em seguida, decante cuidadosamente o meio, tomando cuidado para não perturbar os pellets, e ressuspenda suavemente ambos os grupos de células em cinco mililitros de água estéril. Aguarde dois minutos para que os eritrócitos sejam lisados. Em seguida, interrompa a reação em cada tubo com 25 mililitros de meio suplementado com FBS.

Filtre ambas as populações de adipócitos através de novos filtros celulares de 100 mícrons, centrifugue novamente e então reconstitua os pellets em um a três mililitros de meio. Após a contagem pelo método de exclusão de azul de tripano, plaque separadamente 1 × 10⁶ células do tecido adiposo subcutâneo e células viscerais em poços individuais de uma placa de cultura celular de seis poços. Após a tripsinização das células, dilua a tripsina com um mililitro de tampão de separação e então centrifugue as placas de cultura.

Suspendemos as células em 500 microlitros por tubo de tampão de separação e centrifugamos as células novamente. Agora, ressuspenda as células em 90 microlitros por tubo de tampão de separação e adicione 10 microlitros do anticorpo primário anti-Sca1 FITC à suspensão celular. Após 10 minutos de incubação a quatro graus Celsius no escuro, lave as células com um mililitro de tampão de separação por tubo.

Após a centrifugação, as células são ressuspendidas em 80 microlitros de tampão de separação por suspensão celular. Em seguida, adicione 20 microlitros de microesferas anti-FITC em cada poço e coloque as placas a quatro graus Celsius, protegidas da luz, durante 15 minutos. Ao final da incubação, lave as células com um mililitro de tampão de separação e ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão fresco por tubo.

Agora, coloque uma coluna no suporte magnético e lave a coluna com 500 microlitros de tampão de separação. Transfira as células do cultivo de tecido do coxim adiposo subcutâneo para a coluna, tomando cuidado para evitar bolhas, e colete as células negativas para Sca1 não marcadas em um tubo cônico de 15 mililitros. Quando todas as células tiverem passado, lave a coluna três vezes com 500 microlitros de tampão de separação.

Em seguida, transfira a coluna do ímã para um novo tubo cônico de 15 mililitros e empurre um mililitro de tampão de separação fresco através da coluna para eluir as células positivas para Sca1. Por fim, centrifugue ambas as frações celular positiva e negativa para Sca1 e reconstitua os pellets em um mililitro de meio de cultura. Em seguida, conte o número de células em cada fração e plaque as frações em poços individuais de uma nova placa de cultura celular de seis poços.

Células estromais vasculares isoladas de gordura subcutânea exibem uma forma alongada semelhante à de fibroblastos, independentemente do seu nível de expressão de Sca1. Assim como as células derivadas de gordura inguinal subcutânea com alta expressão de Sca1, as células derivadas de gordura epididimal visceral com alta expressão de Sca1 apresentam uma forma celular alongada semelhante à de fibroblastos. Já as células VIS Sca1 baixas exibem uma forma epiteloide.

Células Sca1 altas isoladas de camundongos Sca1-GFP são facilmente identificadas como células GFP positivas em cultura de tecidos. De fato, quando essas células são avaliadas por citometria de fluxo, a maioria das células GFP positivas é confirmada como expressando proteínas Sca1 em suas superfícies celulares, conforme detectado por anticorpo anti-Sca1. Combinado com análises de PCR em tempo real, pode-se demonstrar a expressão diferencial das metaloproteinases matriciais colagenolíticas entre células-tronco derivadas de adipócitos Sca1 altas provenientes de gordura inguinal e epididimal.

Além disso, quando géis de colágeno tipo I marcados com fluoresceína são utilizados para avaliar a atividade de degradação pericelular, observa-se uma atividade marcadamente aumentada de remodelação do colágeno mediada por células-tronco derivadas do tecido adiposo visceral Sca1 high. Uma vez dominado, o isolamento de células do tecido adiposo pode ser concluído em duas horas, se realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter um campo cirúrgico limpo e organizado para garantir um isolamento eficiente do tecido adiposo.

Após este procedimento, outros métodos, como um ensaio de degradação de colágeno, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre o remodelamento tecidual mediado por células-tronco derivadas de tecido adiposo. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de obesidade e biologia da matriz explorarem o papel das células-tronco derivadas de tecido adiposo no remodelamento e na função do tecido adiposo em camundongos e humanos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter e enriquecer células primárias positivas para Sca1 a partir de depósitos de tecido adiposo.