Detecção simultânea de c-Fos Ativação de mesolímbico e mesocortical dopamina Sites Recompensa Após Naive açúcar e gordura ingestão em ratos

O objetivo geral deste protocolo experimental é determinar se o VTA e suas principais zonas de projeção mesotelencefáticas de DA exibiriam ativação coordenada e simultânea de c-Fos após nova ingestão de óleo de milho, glicose, frutose ou soluções de sacarina. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurobiologia, como motivação, e identificar se vários locais do cérebro são ativados de forma coordenada em resposta a estímulos palatáveis. A principal vantagem dessa técnica é que ela combina os ensaios comportamentais estabelecidos, as técnicas de ativação celular e as análises estatísticas.

Para configurar o aparelho, use um tubo de centrífuga calibrado com uma rolha de ladrão e um tubo de metal com ângulo de 45 graus para fornecer uma medição precisa da solução apresentada ao rato. Prenda-o à gaiola doméstica por uma mola de metal esticada e para permitir a visibilidade da calibração. Três a cinco dias antes do treinamento, restrinja as rações alimentares ao rato para reduzir seu peso corporal para 85% do peso original, a fim de aumentar a motivação para consumir a solução.

Enquanto isso, forneça 10 mililitros de solução pré-treinamento, com sacarina a 0,2%, ao animal por quatro dias, durante uma sessão de uma hora, para maximizar a probabilidade de o rato amostrar a solução de teste subsequente com curta latência. Pese o tubo antes e depois de cada sessão para obter a medição da ingestão. Em seguida, realize um teste de admissão no quinto dia em subgrupos que recebem uma das seis soluções.

Certifique-se de que os ratos aproveitem a solução com latência curta e exclua os sujeitos do estudo se esse requisito não for atendido. Para preparar o tecido, depois de sacrificar o animal, remova o cérebro do crânio rapidamente. Use os rongeurs para quebrar e remover cuidadosamente o osso do cérebro, começando de trás para frente.

Trabalhe na área abaixo do cerebelo e certifique-se de que os rongeurs estejam entre o osso e a pia-máter meníngea. Depois que a parte superior e as laterais do crânio forem removidas, use uma pequena espátula para levantar o cérebro de sua base e corte os nervos cranianos com uma tesoura pequena. Em seguida, fixe o cérebro em solução de paraformaldeído a 4% durante a noite a quatro graus Celsius.

No dia seguinte, coloque o cérebro na solução de sacarose em temperatura ambiente, até que se acomode no fundo do recipiente. Depois disso, remova o bulbo olfatório. Em seguida, remova o cerebelo e a ponte.

Em seguida, monte o cérebro coronalmente, com a parte caudal fixada ao estágio do micrótomo, e corte cortes coronais de 40 mirômetros. Neste procedimento, trate as seções com cinco mililitros de soro de cabra normal a 5% e Triton x-100 a 0,2% em PBS, por uma hora. Em seguida, incubar as seções tratadas com anticorpo primário a quatro graus Celsius por 36 horas, nos poços contendo um mililitro de PBS.

Após 36 horas, enxágue as seções três vezes com cinco mililitros de PBS por 10 minutos de cada vez. Em seguida, incubar as seções com anticorpo secundário em temperatura ambiente por duas horas, nos poços contendo um mililitro de PBS. Depois, enxágue as seções três vezes em cinco mililitros de PBS por 10 minutos de cada vez.

Em seguida, incubar as seções enxaguadas por duas horas em uma mistura de peroxidase de raiz-forte Avidin disponível comercialmente. Após duas horas, enxágue as seções três vezes em cinco mililitros de PBS, por dez minutos de cada vez. Em seguida, reagir os cortes com DAB na presença de peróxido de hidrogênio, por cinco a dez minutos.

Depois disso, rotule duas vezes as seções VTA incubando-as com um anticorpo tirosina hidroxilase, em cinco mililitros de PBS, durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, enxágue as seções três vezes em cinco mililitros de PBS, por dez minutos de cada vez. Em seguida, incubar os cortes com anticorpo secundário em cinco mililitros de PBS, em temperatura ambiente, por duas horas.

Após duas horas, enxágue as seções três vezes em cinco mililitros de PBS, por dez minutos de cada vez. Para visualizar o anticorpo usando um complexo de peroxidase de anticorpo secundário, reaja com uma combinação de DAB e uma solução de sulfato de níquel a 0,3% por cinco a dez minutos. Conte as células clicando duas vezes no ícone do software.

Vá para a barra de menus, clique em Aquisição e, em seguida, em Live Image. Depois disso, coloque a região de interesse em foco e clique na tela para estabelecer um ponto de referência. Em seguida, vá para a barra de ferramentas da grade e clique em Exibir grade e Usar rótulos de grade.

Contorne a região de interesse com um traço predeterminado. Em seguida, conte todas as células em cada região de interesse e selecione Mais na barra lateral esquerda para registrar as contagens das células c-Fos. Considere uma célula positiva para c-Fos quando um círculo vermelho-escuro definido é observado.

Repita esse processo para cada local e garanta que a confiabilidade entre avaliadores dos dois avaliadores desinformados para cada seção em cada região de interesse sempre exceda 0,8. Depois, conte os neurônios positivos para c-Fos nas regiões de interesse. Delinear se a imunorreatividade do c-Fos está presente nas células TH-positivas e TH-negativas no VTA.

Esta imagem mostra que a ingestão de gordura ou açúcar aumenta diferencialmente a ativação de c-Fos em toda a amígdala, bem como nas subáreas basolateral e central-cortico-medial da amígdala. Nesta imagem, a ativação real da amígdala c-Fos foi observada em animais expostos à ingestão de óleo de milho, glicose e frutose. A ativação de C-Fos no VTA também foi observada em animais expostos ao óleo de milho e água.

As setas pretas indicam as células TH c-Fos positivas, duplamente rotuladas, representativas, enquanto as setas cinzas indicam as células representativas apenas c-Fos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três a quatro semanas, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de seguir a metodologia, o armazenamento e a contagem precisos.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.