Desenvolvimento de um In Vitro Ocular Platform para testar as lentes de contato

O objetivo geral deste modelo de olho in vitro é simular o volume lacrimal fisiológico, o fluxo lacrimal natural, a exposição ao ar e o desgaste mecânico produzido durante o piscar de olhos, para avaliar o desempenho das lentes de contato. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo das lentes de contato, como prever o desempenho das lentes de contato e dispositivos oftálmicos relacionados no olho. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um modelo in vitro simples e econômico para simular vários fatores oculares, que atualmente não está disponível.

Embora esse método seja projetado para fornecer informações sobre o desempenho das lentes de contato, ele também pode ser usado para testar outros sistemas oftálmicos, como a lente de contato inteligente de glicose atualmente em desenvolvimento pelo Google e pela Novartis. A demonstração visual desse método é importante para entender como o modelo de olho opera e como ele pode ser usado de forma eficaz em vários cenários de pesquisa. As partes da pálpebra e do globo ocular do modelo são feitas de PDMS.

Primeiro, prepare o PDMS. Usando uma seringa, transfira 10 mililitros de base PDMS para um tubo de centrífuga de 15 ou 50 mililitros. Em seguida, pesar e misturar uma adição de 10% peso por volume de solução de elastômero.

Use uma haste de agitação para misturar bem a solução. Agora, despeje a solução PDMS nos moldes do globo ocular e da pálpebra. Encha os moldes com cuidado para evitar prender bolhas de ar.

Deixe o PDMS assentar em temperatura ambiente durante a noite, durante o qual ele polimerizará e pequenas bolhas de ar se dissolverão do molde. No dia seguinte, transfira os moldes para um forno ajustado para 75 graus Celsius por uma hora. Em seguida, coloque os moldes em um freezer de 80 graus Celsius negativos por alguns minutos.

O PDMS encolherá um pouco. Em seguida, solte as amostras do molde usando uma espátula. Em seguida, conecte um tubo de PTFE a um acoplador de perna igual e prenda-o à peça da pálpebra.

Este tubo introduz fluidos entre as amostras. Agora sintetize a peça do globo ocular a partir de agarose ou um ágar semelhante. Primeiro, faça 100 mililitros de 2% de agarose em solução.

Quando a solução esfriar a cerca de 40 graus Celsius, despeje-a no molde do globo ocular. O excesso de ágar pode ser congelado para uso posterior. Deixe a solução esfriar por 30 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, remova as peças do globo ocular com uma espátula.

Para estudos de microbiologia, esterilize os moldes do globo ocular com uma autoclave ou irradiação UV. Depois de executar a ventilação na coifa por pelo menos 10 minutos, higienize as superfícies com álcool etanol 70%. Efectuar este procedimento com as córneas de bovinos em condições estéreis numa capela de fluxo laminar.

Disseque os olhos imediatamente após a colheita. Use apenas ferramentas autoclavadas e não coloque nada a menos de dez centímetros da borda frontal do espaço de trabalho. Comece a trabalhar com o olho bovino mergulhando-o em solução de iodopovidona a 0,5% por dois minutos.

Em seguida, remova o olho da solução de iodopovidona e lave o olho com PBS a um pH de 7,4. Agora use uma pinça para transferir suavemente o olho para uma placa de Petri de vidro, com a córnea voltada para cima. Remova o excesso de músculo e tecido adiposo cortando os pontos de fixação escleral com uma tesoura de dissecção de extremidade romba.

Eliminar o excesso de tecido num copo esterilizado destinado a dejetos animais. Em seguida, usando uma microtesoura, remova a conjuntiva do olho. Envolva o olho com gaze estéril, mas mantenha a gaze a pelo menos um centímetro do limbo.

A execução correta desta etapa é fundamental para o sucesso. Em seguida, usando um bisturi, faça uma incisão na esclera a cerca de dois milímetros da região do limbo para evitar penetrar na coróide subjacente e no corpo vítreo. Em seguida, estenda cuidadosamente a incisão em 360 graus, sem deformar a córnea de sua curvatura natural.

Agora, usando uma pinça fina, remova a córnea do olho. Tome cuidado extra ao executar esta etapa. Em seguida, remova cuidadosamente qualquer tecido uveal aderente, se houver algum remanescente, da córnea e enxágue a córnea com PBS.

Armazene a córnea a 31 graus Celsius em meio de cultura, como o meio 199 contendo 3% de soro bovino fetal. Para adicionar a córnea ao modelo experimental, apoie-a na peça do globo ocular e prenda as duas peças juntas. Detalhes sobre o design e a produção da peça palpebral para o modelo são abordados no protocolo de texto.

Esta seção cobre sua montagem e a adição de solução de lágrima artificial. Para começar, prenda o globo ocular sintetizado e as peças da pálpebra ao modelo do olho. Em seguida, conecte a tubulação conectada a uma seringa e uma bomba microfluídica ao modelo e verifique se um movimento consistente é gerado.

Primeiro, prepare o tubo com solução lacrimal artificial. Em seguida, coloque manualmente o globo ocular e a pálpebra em contato em um plano nivelado. Agora, ligue a bomba em um fluxo fisiológico entre um e 1,5 microlitros por minuto.

Para experimentos de administração de medicamentos, coloque a lente de contato contendo medicamentos na ocular. Deixe o fluido de fluxo fluir para uma placa de 12 poços. Nos intervalos de tempo desejados, quantifique o analito ou a concentração do medicamento no fluxo usando métodos padrão.

Para avaliar a deposição de componentes lacrimais em uma lente de contato, execute o experimento pelo tempo desejado, descartando o fluxo, remova a lente de contato e analise-a, conforme necessário. O modelo descrito é compatível com uma variedade de oculares que podem ser usadas para várias análises in vitro. Neste exemplo, as peças do globo ocular montadas são sintetizadas a partir de PDMS e ágar, e a córnea usada é uma córnea bovina ex vivo.

A liberação de um antibiótico moxifloxacino das lentes de contato foi avaliada. Quando medido no modelo tradicional de frasco, a liberação do medicamento ocorreu em duas horas, seguida por uma fase de platô. Em contraste, o novo modelo de olho mostrou que a liberação do medicamento foi lenta e sustentável por até 24 horas.

O modelo foi usado em seguida para estudar a deposição de colesterol em lentes de contato. O colesterol no estudo foi marcado com fluorescência e visualizado usando microscopia confocal de varredura a laser. Diferenças substanciais foram observadas em estudos de deposição realizados em um frasco em comparação com o modelo de olho.

Uma vez dominado, este modelo de olho levaria 10 minutos para ser configurado se for usado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de garantir que o fluido lacrimal caia na placa do poço coletor. Após este procedimento, outros métodos como microscopia confocal ou espectrofotometria podem ser realizados para avaliar a deposição de componentes lacrimais no material ou ilusão de drogas do cristalino.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo de lentes de contato explorarem a deposição de fluido lacrimal e a administração de medicamentos. Não se esqueça de que, ao trabalhar com produtos biológicos ou químicos, seja seguro e estéril.