In Vitro A desmontagem do vírus influenza A caps�eos por centrifugação em gradiente

O objetivo geral desta centrifugação em gradiente de velocidade é analisar os capsídeos do vírus da influenza A em condições que simulam o ambiente endocítico ao qual os vírus em entrada estão expostos durante a entrada celular. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre como os capsídeos do vírus da influenza A se desmontam durante a entrada celular, como, por exemplo, o efeito específico de um pH levemente ácido na estabilidade do capsídeo. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a análise quantitativa do processo de desnudamento do vírus da influenza A sob condições experimentais definidas.

Além de fornecer informações sobre como é iniciado o desencapsidamento do vírus da influenza A, este método também pode ser aplicado ao estudo de outros vírus envelopados com mecanismos de desencapsidamento relacionados. Demonstrando o procedimento, estará Firat Nebloglu, um ex-aluno do meu laboratório. Após preparar os buffers e reagentes estoque de acordo com o protocolo descrito, para cada condição de pH a ser testada, prepare uma mistura mestra de buffer com detergente misturando nove mililitros de cloreto de sódio um molar, seis mililitros de NP40 a 10%, 2,4 mililitros do estoque de inibidor de protease 25X e nove mililitros de água duplamente destilada.

Em seguida, para cada condição de pH, pipete 4,4 mililitros da mistura mestra em um tubo cônico de 50 mililitros. Para valores de pH acima de 5,8, adicione 0,6 mililitro da respectiva solução estoque de Tris 500 miliMolar ajustada ao pH no tubo. Para valores de pH 5,8 e inferiores, adicione 0,6 mililitro da respectiva solução estoque de MES 500 miliMolar ajustada ao pH.

Prepare cinco mililitros de solução tampão, contendo cloreto de sódio 300 miliMolar, inibidor de protease 2X, Tris 60 miliMolar, ajustado a pH 7,4 e água bidestilada. Esta solução servirá como tampão de gradiente livre de detergente. Em seguida, adicione cinco mililitros do estoque de glicerol 50% a cinco mililitros das misturas de tampão com e sem detergente, resultando em seis soluções diferentes de glicerol 25%.

Utilize tiras de pH para verificar os valores de pH. Prepare uma solução de glicerol a 15% misturando uma proporção de três para sete de estoque de glicerol a 50% com água destilada. Usando uma seringa de cinco mililitros e uma agulha, adicione três mililitros da solução de glicerol a 15% a seis tubos de ultracentrifugação ultralimpos.

Lave a agulha com água bidestilada após cada etapa. Use uma seringa de cinco mililitros e uma agulha longa para injetar cuidadosamente 3,4 mililitros de solução de glicerol a 25% sob a camada de glicerol a 15%, tomando cuidado para não misturar as duas camadas. Uma interface entre ambas as camadas é claramente visível.

Repita isso para todas as seis condições a serem testadas com as respectivas soluções de glicerol ajustadas ao pH. Em seguida, em uma cabine de segurança biológica Classe II, utilize um mililitro de fluido alantoico clarificado e diluído, contendo o vírus da influenza A, para recobrir suavemente os gradientes de glicerol. Transfira os tubos para as cubas do rotor, equilibre os tubos opostos e coloque-os cuidadosamente em um rotor de ultracentrifugação SW-41 previamente resfriado.

Centrifugue a 2100 rpm e 12 graus Celsius por 150 minutos. Após a centrifugação, utilize uma pipeta Pasteur limpa e um aspirador para remover cuidadosamente ambas as camadas de glicerol. Em seguida, com 40 mililitros de tampão amostral LDS 1X não redutor, reconstitua completamente o precipitado pipetando para cima e para baixo antes de transferir a amostra para um tubo de microcentrifugação de 1,5 mililitro.

Para realizar a eletroforese SDS-PAGE, aqueça todas as amostras a 95 graus Celsius por 10 minutos. Carregue 20 microlitros dos pellets dissolvidos em um gel miniatura Bis-Tris em gradiente pré-moldado e execute a 200 Volts por uma hora em tampão de corrida MOPS SDS 1X. Incube o gel em solução fixadora por uma hora.

Lave uma a duas vezes com água e cora durante a noite em uma placa de cultura celular de 15 centímetros com um volume suficiente de solução de Coomassie coloidal, sob agitação suave e à temperatura ambiente. Dessature o gel em água bidestilada, substituindo o líquido a cada 15 a 20 minutos até que o fundo do gel fique transparente. Armazene o gel em água bidestilada a quatro graus Celsius até que seja escaneado para quantificação das bandas.

Por fim, escaneie o gel em alta resolução e utilize um software sob medida comercialmente disponível para a quantificação das intensidades das bandas proteicas. Subtraia o sinal de fundo de uma região próxima às bandas respectivas e normalize os valores em relação aos valores do controle sem detergente. Neste experimento, o X31 derivado de fluido alantoico clarificado foi submetido à centrifugação em gradiente de velocidade em níveis de pH entre 7,4 e 5,0 e analisado por SDS-PAGE.

Sem detergente presente no gradiente, vírions intactos são pelotizados, conforme indicado pelo padrão característico de bandas, representando HA, NP e M1 no gel corado com Comassie. Após a adição de NP40 à camada inferior de glicerol, o envelope viral, incluindo HA, NA e M2, foi solubilizado e apenas o núcleo viral sedimentou no pellet durante a ultracentrifugação. A partir de um pH inferior a 6,5, a proteína M1 é progressivamente perdida da fração do pellet, atingindo um mínimo entre pH 5,8 e pH 5,4.

Abaixo de pH 5,8, os vRNP foram dissociados e, portanto, perdidos no pellet. A partir das bandas proteicas analisadas, foram revelados dois limiares de pH distintos para a desmontagem da camada de M1 e para a dissociação dos agregados de vRNP, sendo eles pH 6,5 e pH 5,8, respectivamente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que, dependendo da linhagem ou mutante específica do vírus da influenza A, podem ser observadas propriedades diferentes de desmontagem.

Após este procedimento, outros métodos como microscopia eletrônica podem ser realizados para obter informações adicionais, como a estrutura dos capsídeos do vírus da influenza isolados.