In Vitro A desmontagem do vírus influenza A caps�eos por centrifugação em gradiente

O objetivo geral desta centrifugação por gradiente de velocidade é analisar os capsídeos do vírus influenza A sob condições que imitam o meio endocítico que os vírus que chegam encontram durante a entrada na célula. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre como os capsídeos do vírus influenza A se desmontam durante a entrada nas células, como o efeito específico do pH levemente ácido na estabilidade do capsídeo. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a análise quantitativa do processo de desrevestimento do vírus influenza A sob condições experimentais definidas.

Além de fornecer informações sobre como o desrevestimento do vírus influenza A é iniciado, esse método também pode ser aplicado ao estudo de outros vírus de envelope com mecanismos de desrevestimento relacionados. Demonstrando o procedimento, estará Firat Nebloglu, um ex-aluno do meu laboratório. Depois de preparar tampões de estoque e reagentes de acordo com o protocolo de texto, para cada condição de pH a ser testada, prepare a mistura mestre de tampão detergente misturando nove mililitros de um cloreto de sódio molar, seis mililitros de 10% NP40, 2,4 mililitros do estoque de inibidor de protease 25X e nove mililitros de água duplamente destilada.

Em seguida, para cada condição de pH, pipete 4,4 mililitros da mistura principal em um tubo cônico de 50 mililitros. Para valores de pH acima de 5,8, adicione 0,6 mililitros da respectiva solução estoque de Tris 500 milimolar ajustada ao pH ao tubo. Para valores de pH 5,8 e inferiores, adicione 0,6 mililitros da respectiva solução estoque MES de 500 milimolares com pH ajustado.

Faça cinco mililitros de solução tampão, contendo 300 miliMolar cloreto de sódio, inibidor de protease 2X, 60 miliMolar Tris, ajustado para pH 7,4 e água bidestilada Isso servirá como o amortecedor de gradiente de controle sem detergente. Em seguida, adicione cinco mililitros do estoque de glicerol a 50% a cinco mililitros das misturas tampão contendo detergente e sem detergente, resultando em seis soluções diferentes de glicerol a 25%.

Use tiras de pH para verificar os valores de pH. Prepare uma solução de glicerol a 15% misturando uma proporção de três a sete de estoque de glicerol a 50% com água destilada. Usando uma seringa de cinco mililitros e uma agulha, adicione três mililitros de solução de glicerol a 15% a seis tubos de centrifugação ultraclaros.

Lave a agulha em água bidestilada após cada etapa. Use uma seringa de cinco mililitros e uma agulha longa para injetar cuidadosamente 3,4 mililitros de solução de glicerol a 25% sob a camada de glicerol a 15%, tomando cuidado para não misturar as duas camadas. Uma interface entre as duas camadas é claramente visível.

Repita isso para todas as seis condições para testar com as respectivas soluções de glicerol ajustadas ao pH. Em seguida, em um gabinete de biossegurança Classe II, use um mililitro de fluido alantóide diluído e clarificado, contendo o vírus influenza A, para sobrepor suavemente os gradientes de glicerol. Transfira os tubos para as caçambas do rotor, equilibre os tubos opostos e coloque-os cuidadosamente em um rotor de ultracentrifugação SW-41 pré-resfriado.

Centrifugue a 2100 rpm e 12 graus Celsius por 150 minutos. Após a centrifugação, use uma pipeta Pasteur limpa e um aspirador para remover cuidadosamente as duas camadas de glicerol. Em seguida, com 40 mililitros de tampão de amostra LDS 1X não redutor, ressuspenda completamente o pellet pipetando para cima e para baixo antes de transferir a amostra para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Para realizar o SDS-PAGE, aqueça todas as amostras a 95 graus Celsius por 10 minutos. Carregue 20 microlitros dos pellets dissolvidos em um mini-gel Bis-Tris de gradiente pré-moldado e execute a 200 Volts por uma hora em buffer de corrida 1X MOPS SDS. Incubar o gel em solução de fixação durante uma hora.

Enxágue uma a duas vezes com água e manche durante a noite em uma placa de cultura de células de 15 centímetros com um volume suficiente de solução coloidal de Coomassie, agitando suavemente em temperatura ambiente. Destain o gel em água duplamente destilada, substituindo o líquido a cada 15 a 20 minutos até que o fundo do gel fique claro. Armazene o gel em água duplamente destilada a quatro graus Celsius até que seja escaneado para quantificação da banda.

Por fim, escaneie o gel em alta resolução e use um software personalizado disponível comercialmente para quantificação das intensidades das bandas de proteínas. Subtraia o sinal de fundo de uma região próxima às respectivas bandas e normalize os valores para os valores de controle sem detergente. Neste experimento, X31 derivado de fluido alantóide clarificado foi submetido a centrifugação com gradiente de velocidade em níveis de pH entre 7,4 e 5,0 e analisado por SDS-PAGE.

Sem detergente presente no gradiente, os vírions intactos são peletizados, conforme refletido pelo padrão característico das bandas, representando HA, NP e M1 no gel corado com Coomassie. Após a adição de NP40 à camada inferior de glicerol, o envelope viral, incluindo HA, NA e M2, foi solubilizado e o núcleo viral sozinho sedimentado no pellet durante a ultracentrifugação. A partir de um pH abaixo de 6,5, M1 é gradualmente perdido da fração do pellet, atingindo um mínimo entre pH 5,8 e pH 5,4.

Abaixo de pH 5,8, os vRNPs foram dissociados e, portanto, perdidos do pellet. A partir das bandas de proteínas analisadas, foram revelados dois limiares de pH distintos para desmontagem da camada M1 e dissociação de feixes de vRNP, incluindo pH 6,5 e pH 5,8, respectivamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que, dependendo da cepa ou mutante do vírus influenza A específico, diferentes propriedades de desmontagem podem ser observadas.

Após este procedimento, outros métodos, como microscopia eletrônica, podem ser realizados para obter informações adicionais, como a estrutura dos capsídeos isolados do vírus influenza.