Name: In Vitro A desmontagem do vírus influenza A capsï¿½eos por centrifugação em gradiente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Aprenda a analisar a desmontagem de capsídeos do vírus influenza A por centrifugação em gradiente de velocidade. Este método permite estudar os efeitos do pH ácido na estabilidade capsidal e compreender os mecanismos de entrada viral.

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Agradecemos Yohei Yamauchi e Roberta Mancini por nos fornecer reagentes. O laboratório AH foi apoiada pelas redes de formação inicial Marie Curie (ITN), o Conselho Europeu de Investigação (ERC), e pela Swiss National Science Foundation (Sinergia).

1. Preparação de tampões e soluções de Stock <ol><li> Preparar tampão de MNT (MES 20 mM, Tris 30 mM e NaCl 100 mM) por dissolução de 470 mg de Tris, cloridrato de 390 mg de hidrato de MES e 580 mg de NaCl em 80 ml ​​de ddH 2 O. Ajustar o tampão a pH 7,4 e trazê-lo para um volume final de 100 ml com ddH 2 O. </li><li> Preparar três soluções idênticas de tampão 500 mM MES dissolvendo 9,76 g MES hidratado em 80 ml ​​de dH2O cada um. Ajustar as memórias intermédias para um pH de 5,8, 5,4, e 5,0, respectivamente, por titulação com NaOH concentrado. Traga cada tampão para um volume final de 100 mL com dH2O </li><li> Preparar duas soluções idênticas de tampão Tris 500 mM por dissolução de 7,88 g de Tris cloridrato em 80 ml ​​de dH2O cada e ajustar o pH para 7,4 e 6,4, respectivamente, por titulação com HCl concentrado. Traga o tampão para um volume final de 100 mL com dH2O </li><li> Preparar a solução de glicerol a 50% em dH 2 O e agita-se bem até a GlycErol é homogeneamente misturada. Filtrar a solução através de uma unidade de filtro Steritop (0,22 de tamanho de poro) para um frasco de vidro. </li><li> Preparar solução a 10% de NP-40 e NaCl 1 M em dH2O </li><li> Prepare 25x inibidor de protease concentrada por dissolução de dois comprimidos em 4 ml DDH 2 O. </li></ol> 2. Preparação de gradientes de glicerol <ol><li> Prepare 5 ml de tampão detergente de mistura principal solução para cada condição de pH (300 mM de NaCl, 2% de NP-40, inibidores da protease 2x concentrado) de teste (pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4, e 5.0). Para este efeito, mistura 9 ml de NaCl 1 M, 6 ml de 10% de NP-40, 2,4 ml de solução stock de inibidor de protease, 25x e 9 ml de ddH 2 0. </li><li> Para cada condição pipeta pH 4,4 ml da mistura principal em um tubo de 50 ml. </li><li> Para valores de pH acima de 5,8 adicionar 0,6 ml da respectiva solução de estoque de 500 mM de Tris com pH ajustado ao tubo. Para pH 5,8 e inferior adicionar 0,6 ml da respectiva solução de MES 500 mM com o pH ajustado. </li><li> Faça 5ml de solução tampão contendo NaCl 300 mM, inibidor de protease de 2x, Tris 60 mM ajustado para pH 7,4 e ddH 2 O. Isto irá servir como tampão de gradiente de controlo sem detergente. </li><li> Se necessário, ajustar com precisão o pH das soluções para pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4, e 5,0 por adição de soluções de HCI ou NaOH concentrado, respectivamente. </li><li> Adicionar 5 ml de solução stock de glicerol a 50% e 5 ml de as misturas tampão contendo detergente e sem detergente, resultando em seis diferentes soluções de glicerol a 25%. Verifique os valores de pH utilizando papel indicador de pH. NOTA: No caso de o pH medido difere significativamente do valor desejado, as respectivas soluções devem ser preparadas novamente. </li><li> Preparar solução de glicerol a 15% por mistura de estoque de glicerol a 50% com dH 2 O em uma proporção de 3: 7. </li></ol> 3. Ultracentrifugação da IAV <ol><li> Adicionar solução de glicerol a 3 ml de 15% em tubos de centrifugação ultra-claros (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) usando uma seringa de 5 ml e uma needle (21 G, 9 cm de comprimento). Não deixar gotas para a parede interior do tubo como este poderia perturbar a integridade do gradiente. Repetir este para um total de seis tubos de centrifugação, uma para cada um dos cinco condições de pH para testar e uma para a amostra de controlo. </li><li> Com cuidado, coloque solução de glicerol a 3,4 ml de 25% sob a camada de glicerol 15%, utilizando uma seringa de 5 ml e uma agulha longa. Tome cuidado para não misturar as duas camadas. Repita este procedimento para todas as seis condições para testar com as respectivas soluções de glicerol com o pH ajustado. NOTA: Trabalho na classe II biossegurança gabinete para as etapas seguintes. </li><li> Suavemente sobrepor os gradientes de glicerol com 30 ul clarificadas fluido alantóide que contém IAV (X31, H3N2) diluído em 1 ml de tampão de MNT (corresponde a cerca de 20-30 ug da proteína virai total) para cada gradiente. </li><li> Equilíbrio oposição tubos e colocá-los em um rotor SW41 ultracentrifugação. Centrifugar durante 150 minutos, a 55000 x g, e 12 ° C. </li><li> Após a centrifugação, cuidadosamenteremover o sobrenadante, isto é, ambas as camadas de glicerol, usando uma pipeta de Pasteur limpa e um aspirador. Ressuspender o sedimento em 40 ul (1x) não redutoras tampão de amostra LDS. É importante para pipetar para cima e para baixo várias vezes para dissolver completamente o sedimento. Transferir a amostra para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li></ol> 4. SDS-PAGE de fracções de pellets e coloração com Coomassie <ol><li> Aquecer todas as amostras a 95 ° C durante 10 min. Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem analisadas por SDS-PAGE. </li><li> Carga de 20 ul das pelotas dissolvidas em um gradiente de pré-molde (4-12%) em gel de mini-Bis-Tris e correr durante 1 h a 200 V em MOPS SDS 1x tampão de corrida. </li><li> Fazer a solução de fixação com 40% de metanol e ácido acético glacial a 10% em DDH 2 O. </li><li> Incubar o gel na solução de fixação durante 1 hora e manchar durante a noite numa placa de cultura celular 15 cm, com um volume suficiente de solução de Coomassie coloidal enquanto suavementeagitação à temperatura ambiente. NOTA: É importante para fechar o prato, a fim de evitar a evaporação da solução de coloração. </li><li> Destain o gel em ddH 2 O. Substitua o DDH 2 O a cada 15-20 minutos até que o fundo gel torna-se clara. Armazenar o gel em ddH2O a 4 ° C até ser digitalizada para quantificação banda. </li><li> Digitalizar o gel em alta resolução e use um software disponível ou personalizado comercialmente para a quantificação de intensidades das bandas de proteína. Subtrair o sinal de fundo a partir de uma região próxima às respectivas bandas e normalizar estes valores para as amostras de controlo sem detergente (a pH 7,4). </li></ol>

<ol><li>Taubenberger, J. K., Kash, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+Virus+Evolution%2C+Host+Adaptation%2C+and+Pandemic+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+%26+microbe%22%5BJournal%5D)">Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation.</a> Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).</li>
<li>Skehel, J. J., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+binding+and+membrane+fusion+in+virus+entry%3A+the+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin.</a> Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).</li>
<li>de Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+influenza+a+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS pathogens. 7 (3), e1001329(2011).</li>
<li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).</li>
<li>Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanism+of+influenza+virus+entry+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells.</a> J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).</li>
<li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).</li>
<li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+virus+entry+via+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Dissecting virus entry via endocytosis.</a> J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).</li>
<li>Yoshimura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+Cell+Entry+Mechanism+of+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus.</a> Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).</li>
<li>White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-fusion+activity+of+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Membrane-fusion activity of influenza virus.</a> Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).</li>
<li>Martin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+transport+of+influenza+virus+ribonucleoproteins%3A+The+viral+matrix+protein+%28M1%29+promotes+export+and+inhibits+import%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import.</a> Cell. 67 (1), 117-130 (1991).</li>
<li>Palese, P., Shaw, M. L. Chapter 47. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalese%2C+P+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1690 (2006).</li>
<li>Chou, Y. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+Different+Influenza+Viral+RNA+Segments+in+the+Cytoplasm+before+Viral+Budding+as+Shown+by+Single-molecule+Sensitivity+FISH+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis.</a> PLoS Pathog. 9 (5), e1003358(2013).</li>
<li>Martin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+incoming+influenza+virus+nucleocapsids+into+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus.</a> Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).</li>
<li>Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+M1+protein+and+low+pH+on+nuclear+transport+of+influenza+virus+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins.</a> Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-Controlled+Two-Step+Uncoating+of+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus.</a> Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).</li>
<li>Stauffer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+priming+by+acidic+pH+and+high+K%2B+is+required+for+efficient+uncoating+of+influenza+A+virus+cores+after+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration.</a> Journal of Virology. , (2014).</li>
<li>Zhirnov, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+of+matrix+protein+M1%2FM+from+virions+occurs+at+different+pH+for+orthomyxo-+and+paramyxoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses.</a> Virology. 176 (1), 274-279 (1990).</li>
<li>Banerjee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus+uses+the+aggresome+processing+machinery+for+host+cell+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry.</a> Science. 346 (6208), 473-477 (2014).</li>
<li>Huotari, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cullin-3+regulates+late+endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cullin-3 regulates late endosome maturation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).</li>
<li>Yamauchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+Deacetylase+8+Is+Required+for+Centrosome+Cohesion+and+Influenza+A+Virus+Entry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry.</a> PLoS Pathog. 7 (10), e1002316(2011).</li>
<li>Bachmayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Solubilization+of+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+from+Influenza+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses.</a> Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).</li>
<li>Reginster, M., Nermut, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Characterization+of+Influenza+Virus+Cores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores.</a> Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).</li>
<li>Nermut, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+Investigation+on+the+Fine+Structure+of+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus.</a> Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).</li>
<li>Schulze, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+influenza+virus%3A+II.+A+model+based+on+the+morphology+and+composition+of+subviral+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles.</a> Virology. 47 (1), 181-196 (1972).</li>
<li>Candiano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+silver%3A+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li>
<li>Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+virus+uncoating%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of virus uncoating.</a> Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).</li>
<li>Yamauchi, Y., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+entry+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Virus entry at a glance.</a> Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).</li>
<li>Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+Influenza+C+Viruses%2C+Distinct+from+That+of+Influenza+A+and+B+Viruses+Requires+Neutral-Alkaline+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH.</a> Virology. 200 (1), 284-291 (1994).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

cápsides virais são complexos macromoleculares metaestáveis. Enquanto a montagem de viriões requer a encapsidação e condensação do genoma do vírus, o início da próxima ronda de infecção depende de desmontagem desta estrutura capsídeo compacto. Vírus evoluíram para explorar vários mecanismos celulares para controlar o ciclo de revestimento-desencapsulamento, incluindo receptores celulares, chaperones, enzimas proteolíticas, forças físicas proporcionadas pelas proteínas do motor ou helicases, bem como o pH e interruptores...

Vírus da Influenza A (IAV) é um vírus envolvido que pertence à família de Orthomyxoviridae. Seus genes são codificados em uma, de sentido negativo e segmentada genoma de ARN de cadeia simples. Nos seres humanos, IAV causa infecções respiratórias, que ocorrem em surtos epidêmicos sazonais e tem o potencial para pandemias globais 1. Após a ligação de resíduos de ácido siálico na superfície das células de acolhimento 2, IAV é internalizado por endocitose dependente de clatrina e vias independentes de clatrina 3-8. O meio ácido (pH &lt;5,5) nos vacúolos de endocitose desencadeia uma mudança conformacional na IAV pico glicoproteína hemaglutinina (HA), o que resulta na fusão do vírus e no final da membrana endossomal 9. Uma vez que a cápside IAV (aqui também referido como &quot;núcleo&quot; viral) escapou de endossomas tardios (EIE), que é não revestidos no citosol seguido por transporte das ribonucleoproteínas virais (vRNPs) no núcleo - o local de Oa replicação do vírus e transcrição F 10-13. Antes da activação de ácido HA do vírus sofre uma redução gradual do pH no sistema endocítico, que prepara o núcleo para a sua desmontagem posterior 14-16. Neste &quot;priming&quot; intensificar os canais de íon M2 na membrana viral mediar o influxo de prótons e K +10,14,16. A mudança na concentração iônica no interior vírus perturba as interações construir pela proteína da matriz viral M1 ea vRNP pacote de oito, e facilita IAV uncoating no citoplasma seguindo a fusão da membrana 10,14-17. análise directa e quantitativa do passo de iniciação tem sido dificultada pelo facto de endossomas são difíceis de aceder experimentalmente. O processo de entrada é, aliás, altamente não-síncrona. Além disso, ensaios de ponto final, como qRT-PCR de RNA ou da infecciosidade medições virais libertados, não fornecem uma imagem detalhada sobre o estado bioquímico do capsi virald em qualquer etapa de entrada. Enquanto perturbação da endossomas por siRNA ou tratamento de drogas tem contribuído significativamente para a compreensão de entrada IAV 18-20, ajuste fino é difícil e propenso a efeitos colaterais não específicos no programa endosome maturação rigidamente controlado. Para evitar estes problemas, nós adaptamos um protocolo previamente desenvolvido in vitro, com base na utilização de centrifugação em gradiente de velocidade de 17. Em contraste com outras tentativas 21,22, 23,24, que eram na maior parte baseados em combinações de clivagem proteolítica e tratamento com detergente, seguido por análise de EM, esta abordagem permitiu um resultado facilmente quantificáveis. Centrifugação através de diferentes camadas de gradiente permite que as partículas sedimentam a ser expostos e reagem com mudança de condições, de forma controlada. No protocolo apresentado, IAV derivados a partir de fluido alantóico clarificado ou partículas virais purificadas são sedimentadas numa glicerol de duas camadasgradiente em que a camada inferior contém o detergente não-iónico NP-40 (Figura 1). Tal como o vírus entra na segunda camada, contendo detergente, o envelope lipídico e glicoproteínas do envelope viral são suavemente solubilizada e deixado para trás. O núcleo, composto pelo feixe vRNP e oito rodeado por uma camada de matriz, sedimentos como uma estrutura estável na fracção de sedimento. proteínas de núcleo virai, tais como M1 e nucleoproteína vRNP-associado (NP), pode ser identificado no sedimento por SDS-PAGE e coloração com Coomassie. Em particular, tomando vantagem de géis de gradiente disponíveis comercialmente e a coloração com Coomassie coloidal altamente sensível 25, permite alta precisão e a detecção de mesmo pequenas quantidades de proteínas associadas ao núcleo virai. Isso define a base para testar se condições diferentes, como pH, concentração de sal, e os fatores não revestidos putativos têm efeitos sobre o comportamento de sedimentação dos componentes do núcleo e stabil núcleo<html> dade. Para este objectivo, apenas a camada inferior, contendo o detergente em o gradiente de glicerol é modificado através da introdução do factor ou condição de interesse. A técnica tem sido particularmente útil em investigar o efeito de diferentes valores de pH e concentrações de sal sobre a integridade do núcleo 16 IAV. Etapas intermediárias de IAV desencapsulamento poderia ser monitorada incluindo dissociação da camada de matriz a um pH ligeiramente ácido (&lt;6,5), seguido de vRNP de dissociação a pH 5,5 e inferior 16,17 (Figura 1). O último passo foi adicionalmente reforçada pela presença de alta concentração de K + na camada de glicerol, reflectindo um ambiente endocítica final 16. Assim, como o vírus e o núcleo sedimentado através do gradiente que experimentaram uma mudança de meio, imitando as condições em endossomas. O resultado foi uma desmontagem gradual do núcleo virai in vitro, completando os resultados derivados a partir de ensaios de biologia celular. t &quot;&gt; O método aqui apresentado, permitiu rápido e altamente reprodutível análise de IAV (X31 e A / WSN / 33) e IBV (B / Lee / 40) desencapsulamento desencadeada pelo pH ácido e aumentando +16,17 K, bem como desmontagem de núcleos paramixovírus após exposição pH alcalino 17. é concebível que a abordagem pode ser adaptada para outros vírus com envelope para obter insights sobre as propriedades bioquímicas da estrutura da cápside virai e desmontagem da cápside durante a entrada na célula.

<table><tbody><tr><td>cOmplete&trade;, comprimidos inibidores de protease sem EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11873580001</td><td>A solução estoque pode ser armazenada a 2 a 8 graus; C por 1 a 2 semanas</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Merck Millipore</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol anidro BioChemica</td><td>AppliChem</td><td>A1123</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Merck Millipore</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de injeção longa (21&nbsp; G, 9 cm, chanfrado ou sem corte)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidrato MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td>Agora disponível comercialmente como IGEPAL&reg; CA-630</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini géis, 10&nbsp; poços, 1,0 mm</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS tampão de amostra (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS tampão de corrida (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>tiras indicadoras de pH, pH 4,0-7,0</td><td>Merck Millipore</td><td>109542</td><td></td></tr><tr><td>QC Colloidal Coomassie Stain</td><td>BIO RAD</td><td>1610803</td><td></td></tr><tr><td>Sodium cloreto</td><td>Merck Millipore</td><td>106406</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Merck Millipore</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de filtro Steritop</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Ti, conjunto de rotores de ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>Thinwall, Tubos de centrífuga ultra-claros, 13.2&nbsp; ml, 14 mm x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Tris&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td></td></tr><tr><td>X31 Vírus Influenza A (H3N2), cultivado em ovo, fluido alantóide clarificado</td><td>Virapur</td><td></td><td>Recém-descongelado em 4 &deg; O</td></tr></tbody></table>

in vitro a desmontagem do vírus influenza a capsï¿½eos por centrifugação em gradiente

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Os processos moleculares desencadeados por ácido controlam de perto a entrada celular de muitos vírus que entram pelo sistema endocítico. No caso do vírus influenza A (IAV), a fusão do vírus com a membrana endossômica, bem como a subsequente desmontagem do capsídeo viral, chamada de desrevestimento, é governada pelas condições iônicas dentro das vesículas endocíticas. As etapas iniciais do ciclo de vida do vírus são difíceis de estudar porque os endossomos não podem ser acessados diretamente experimentalmente, criando a necessidade de uma abordagem in vitro. Aqui, descrevemos um método baseado na centrifugação com gradiente de velocidade de vírions purificados através de um gradiente de glicerol de duas camadas, que permite a análise do núcleo IAV e sua estabilidade. O gradiente contém um detergente não iônico (NP-40) em sua camada inferior para remover a membrana viral por solubilização à medida que o vírus sedimenta em direção ao fundo. Em pH neutro, os núcleos virais são peletizados como estruturas estáveis. Os principais componentes do núcleo, proteína da matriz (M1) e ribonucleoproteínas virais (vRNPs), podem ser claramente identificados na fração do pellet por SDS-PAGE. Diminuir o pH para 6,0 ou menos na camada inferior remove seletivamente M1 do pellet, seguido pela liberação de vRNPs em condições mais ácidas. As bandas de proteínas virais em géis corados com Coomassie podem ser submetidas à quantificação densitométrica para monitorar os estados intermediários de desmontagem do IAV. Além do pH, outros fatores que influenciam a estabilidade do núcleo viral podem ser avaliados, como concentração de sal e fatores de desrevestimento viral putativos, simplesmente modificando a camada de glicerol contendo detergente de acordo. Em conjunto, a técnica apresentada permite uma análise altamente reprodutível e quantitativa do desrevestimento viral in vitro. Pode ser aplicado a outros vírus envelopados que passam por processos complexos de desrevestimento.

Como já foi discutido, priming em endossomos é necessária para tornar o núcleo IAV perda do revestimento competente. A protonação do núcleo enfraquece interacção de M1 e vRNPs (composto do RNA viral, NP, e o complexo de polimerase PB1 / PB2 / PA). Este processo inicia-se quando o vírus de entrada está exposta a um pH de 6.5 (ou inferior) em endossomas precoces (EES) e continua até que os fusíveis de vírus em torno de pH 5,0 em les. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page...

A desmontagem dos núcleos do vírus influenza A durante a entrada do vírus nas células hospedeiras é um processo de várias etapas. Descrevemos um método in vitro para analisar os estágios iniciais do desrevestimento viral. Nesta abordagem, a centrifugação por gradiente de velocidade é usada para dissecar bioquimicamente as etapas que iniciam o desrevestimento sob condições definidas.

In Vitro A desmontagem do vírus influenza A capsï¿½eos por centrifugação em gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

O objetivo geral desta centrifugação em gradiente de velocidade é analisar os capsídeos do vírus da influenza A em condições que simulam o ambiente endocítico ao qual os vírus em entrada estão expostos durante a entrada celular. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre como os capsídeos do vírus da influenza A se desmontam durante a entrada celular, como, por exemplo, o efeito específico de um pH levemente ácido na estabilidade do capsídeo. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a análise quantitativa do processo de desnudamento do vírus da influenza A sob condições experimentais definidas.Além de fornecer informações sobre como é iniciado o desencapsidamento do vírus da influenza A, este método também pode ser aplicado ao estudo de outros vírus envelopados com mecanismos de desencapsidamento relacionados. Demonstrando o procedimento, estará Firat Nebloglu, um ex-aluno do meu laboratório. Após preparar os buffers e reagentes estoque de acordo com o protocolo descrito, para cada condição de pH a ser testada, prepare uma mistura mestra de buffer com detergente misturando nove mililitros de cloreto de sódio um molar, seis mililitros de NP40 a 10%, 2,4 mililitros do estoque de inibidor de protease 25X e nove mililitros de água duplamente destilada.Em seguida, para cada condição de pH, pipete 4,4 mililitros da mistura mestra em um tubo cônico de 50 mililitros. Para valores de pH acima de 5,8, adicione 0,6 mililitro da respectiva solução estoque de Tris 500 miliMolar ajustada ao pH no tubo. Para valores de pH 5,8 e inferiores, adicione 0,6 mililitro da respectiva solução estoque de MES 500 miliMolar ajustada ao pH.Prepare cinco mililitros de solução tampão, contendo cloreto de sódio 300 miliMolar, inibidor de protease 2X, Tris 60 miliMolar, ajustado a pH 7,4 e água bidestilada. Esta solução servirá como tampão de gradiente livre de detergente. Em seguida, adicione cinco mililitros do estoque de glicerol 50% a cinco mililitros das misturas de tampão com e sem detergente, resultando em seis soluções diferentes de glicerol 25%.Utilize tiras de pH para verificar os valores de pH. Prepare uma solução de glicerol a 15% misturando uma proporção de três para sete de estoque de glicerol a 50% com água destilada. Usando uma seringa de cinco mililitros e uma agulha, adicione três mililitros da solução de glicerol a 15% a seis tubos de ultracentrifugação ultralimpos.Lave a agulha com água bidestilada após cada etapa. Use uma seringa de cinco mililitros e uma agulha longa para injetar cuidadosamente 3,4 mililitros de solução de glicerol a 25% sob a camada de glicerol a 15%, tomando cuidado para não misturar as duas camadas. Uma interface entre ambas as camadas é claramente visível.Repita isso para todas as seis condições a serem testadas com as respectivas soluções de glicerol ajustadas ao pH. Em seguida, em uma cabine de segurança biológica Classe II, utilize um mililitro de fluido alantoico clarificado e diluído, contendo o vírus da influenza A, para recobrir suavemente os gradientes de glicerol. Transfira os tubos para as cubas do rotor, equilibre os tubos opostos e coloque-os cuidadosamente em um rotor de ultracentrifugação SW-41 previamente resfriado.Centrifugue a 2100 rpm e 12 graus Celsius por 150 minutos. Após a centrifugação, utilize uma pipeta Pasteur limpa e um aspirador para remover cuidadosamente ambas as camadas de glicerol. Em seguida, com 40 mililitros de tampão amostral LDS 1X não redutor, reconstitua completamente o precipitado pipetando para cima e para baixo antes de transferir a amostra para um tubo de microcentrifugação de 1,5 mililitro.Para realizar a eletroforese SDS-PAGE, aqueça todas as amostras a 95 graus Celsius por 10 minutos. Carregue 20 microlitros dos pellets dissolvidos em um gel miniatura Bis-Tris em gradiente pré-moldado e execute a 200 Volts por uma hora em tampão de corrida MOPS SDS 1X. Incube o gel em solução fixadora por uma hora.Lave uma a duas vezes com água e cora durante a noite em uma placa de cultura celular de 15 centímetros com um volume suficiente de solução de Coomassie coloidal, sob agitação suave e à temperatura ambiente. Dessature o gel em água bidestilada, substituindo o líquido a cada 15 a 20 minutos até que o fundo do gel fique transparente. Armazene o gel em água bidestilada a quatro graus Celsius até que seja escaneado para quantificação das bandas.Por fim, escaneie o gel em alta resolução e utilize um software sob medida comercialmente disponível para a quantificação das intensidades das bandas proteicas. Subtraia o sinal de fundo de uma região próxima às bandas respectivas e normalize os valores em relação aos valores do controle sem detergente. Neste experimento, o X31 derivado de fluido alantoico clarificado foi submetido à centrifugação em gradiente de velocidade em níveis de pH entre 7,4 e 5,0 e analisado por SDS-PAGE.Sem detergente presente no gradiente, vírions intactos são pelotizados, conforme indicado pelo padrão característico de bandas, representando HA, NP e M1 no gel corado com Comassie. Após a adição de NP40 à camada inferior de glicerol, o envelope viral, incluindo HA, NA e M2, foi solubilizado e apenas o núcleo viral sedimentou no pellet durante a ultracentrifugação. A partir de um pH inferior a 6,5, a proteína M1 é progressivamente perdida da fração do pellet, atingindo um mínimo entre pH 5,8 e pH 5,4.Abaixo de pH 5,8, os vRNP foram dissociados e, portanto, perdidos no pellet. A partir das bandas proteicas analisadas, foram revelados dois limiares de pH distintos para a desmontagem da camada de M1 e para a dissociação dos agregados de vRNP, sendo eles pH 6,5 e pH 5,8, respectivamente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que, dependendo da linhagem ou mutante específica do vírus da influenza A, podem ser observadas propriedades diferentes de desmontagem.Após este procedimento, outros métodos como microscopia eletrônica podem ser realizados para obter informações adicionais, como a estrutura dos capsídeos do vírus da influenza isolados.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O genoma do vírus influenza A é composto por oito complexos separada de RNA e proteínas, denominadas complexos de ribonucleoproteínas viral (vRNPs). Este artigo descreve a purificação gradiente glicerol e transmissão de visualização microscopia eletrônica de influenza A vRNPs.

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Descrevemos o processo de isolamento de DNA de alta pureza herpesvirus nucleocapsídeo das células infectadas. O DNA final capturada a partir de solução é de alta concentração e pureza, tornando-a ideal para high-throughput seqüenciamento de alta fidelidade reações PCR e transfections para produzir novos recombinantes viral.

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Os vírus da gripe replicar seu genoma de RNA em associação com a célula hospedeira da cromatina. Aqui, apresentamos um método para purificar intactos os complexos de ribonucleoproteínas virais da cromatina das células infectadas. Purificou complexos virais podem ser analisados ​​por Western blot e tanto de extensão do primer de proteína e do conteúdo de ARN, respectivamente.

Purificação por afinidade de Complexos de Influenza Virus ribonucleoproteína da cromatina de células infectadas

Source: Stauffer, S. et al. In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the pH-dependent disassembly of influenza A virus (IAV) cores using gradient ultracentrifugation. It outlines glycerol gradient preparation, ultracentrifugation, and how different pH conditions affect IAV core disassembly.

In Vitro Disassembly of the Influenza A Virus Core Using pH-Controlled Gradient Centrifugation

Source: Stauffer, S. et al., In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the effect of pH on the solubilization of influenza A viral cores. Gel electrophoresis and protein staining reveal the progressive disassembly of the core structure under acidic conditions.

Visualizing the Effect of pH on Solubilization of the Influenza A Viral Core

Métodos de deteção de rotina utilizando a amplificação do genoma viral são limitados pela sua incapacidade de discriminar infecciosas de partículas não-infecciosas. O objetivo deste artigo é fornecer protocolos detalhados para métodos alternativos ajudar na discriminação de partículas infecciosas norovírus usando vinculação aptamer, espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão.

Métodos de alternativas In Vitro para a determinação da integridade estrutural do capsídeo Viral

Integrase retroviral recombinante e oligómeros de DNA imitando extremidades de DNA virais podem formar um complexo enzimaticamente ativo conhecido como um intasome. Intasomes pode ser utilizado para estudos bioquímicos, estruturais e cinéticos. Este protocolo fornece detalhes sobre como montar e purificar o protótipo vírus espumoso intasomes.

Montagem e purificação do protótipo vírus espumoso Intasomes

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Produção e purificação de vírus adenoassociados em cultura de suspensão por centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol para aplicações in vivo

À medida que o campo da terapia gênica continua a evoluir, há uma necessidade crescente de métodos inovadores que possam enfrentar esses desafios. Aqui, é apresentado um método único, que agiliza o processo de geração de vetores AAV de alto rendimento e alta pureza usando uma plataforma de fábrica de células, atendendo aos padrões de qualidade para estudos in vivo .

Um procedimento simplificado e padronizado para gerar vetores de vírus adeno-associados de alto título e alta qualidade utilizando uma plataforma de fábrica de células

Aprenda a analisar a desmontagem de capsídeos do vírus influenza A por centrifugação em gradiente de velocidade. Este método permite estudar os efeitos do pH ácido na estabilidade capsidal e compreender os mecanismos de entrada viral.

In Vitro A desmontagem do vírus influenza A capsï¿½eos por centrifugação em gradiente

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