Aplicações da sonda Individual: Imagem Espectrometria de Massa e Análise única célula sob condições ambientais

O objetivo geral deste método é criar um dispositivo de amostragem em microescala, a sonda única, para analisar células únicas vivas usando espectrometria de massa em condições ambientais. E realizar imagens de espectrometria de massa ambiente de tecidos biológicos com alta resolução espacial. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave em estudos biológicos e farmacêuticos.

Por exemplo, quais são as moléculas presentes em células individuais vivas e como elas são distribuídas nos tecidos. A principal vantagem dessa técnica é que a sonda única é um dispositivo multifuncional que pode ser usado tanto para análise de célula única viva quanto para experimentos de imagem de espectrometria de massa ambiente de alta resolução. Embora esse método possa analisar células e tecidos individuais, ele também pode ser aplicado a outros sistemas onde a amostragem em microescala é desejável, como análise de longarina de produtos químicos e microcolônias e biofilmes vivos.

Demonstrando o procedimento comigo estará Wei Rao, um pós-doutorado do meu laboratório. Coloque um órgão de rato inteiro de interesse no centro de um pequeno poço de plástico. Mergulhe o órgão no composto de incorporação de tecido até uma altura de cerca de 10 mm.

Coloque imediatamente os lenços de papel em nitrogênio líquido para congelamento instantâneo. Para preparar a seção de tecido do camundongo, pegue o órgão congelado do camundongo e descongele a 15 graus Celsius em um criomicrótomo com temperatura controlada. Prenda o tecido em uma base de aço com aproximadamente 500 microlitros de composto de incorporação de tecido e coloque em um suporte de corte crio-micrótomo para que a orientação de corte desejada seja apresentada à faca.

Corte o tecido com uma espessura de 12 mícrons. Em seguida, coloque as fatias de tecido seccionadas em lâminas de microscópio de policarbonato e deixe-as secar por 30 minutos em temperatura ambiente. Obtenha uma amostra de células, como 1 mililitro de HeLa Cell Suspension, e adicione-a a 9mL de meio de cultura celular completo em uma placa de cultura de células padrão de 10 cm.

Mantenha as células em cultura a 37 graus Celsius, com 5% de CO2 por dois a três dias, até que a superfície de crescimento esteja coberta a 70-80% na placa de cultura de células. Execute a passagem celular na placa de cultura de células. Para isso, aspire o meio de crescimento e enxágue as células com 5mL de solução salina tamponada com fosfato 1x.

Remova o PBS usando uma ponta de aspiração estéril e incube as células com 2,5 mL de tripsina por aproximadamente 5 minutos a 37 graus Celsius para separar as células da placa de cultura. Pare a atividade da tripsina adicionando 7,5 mL de meio de cultura celular completo e, em seguida, ressuspenda uniformemente as células. Para preparar as amostras de células para uma espectrometria de massa de célula única, ou experimento SCMS, primeiro coloque lâminas de microcobertura individuais nos poços de uma placa de 12 poços.

Em seguida, adicione 1,8 mL de meio de cultura celular e 0,2 mL de suspensão celular no poço. Misture suavemente as células com leve agitação da placa antes de incubar em um ambiente de 5% de CO2 a 37 graus Celsius, por aproximadamente 24 horas. Para realizar o tratamento medicamentoso das células cultivadas, adicione uma solução composta de medicamento na placa de cultura de células de 12 poços.

Coloque o tubo de quartzo de furo duplo em um extrator de micropipeta a laser e puxe uma agulha de quartzo de furo duplo. Como pontos de partida, defina o calor para 400, o filamento para três, a velocidade para 80, o atraso para 150 e a tração para 250. Corte a ponta de tração de modo que haja aproximadamente 5 mm de capilar de quartzo de furo duplo não puxado na outra extremidade.

Corte uma seção de 80 mm de capilar de sílica fundida como um capilar de fornecimento de solvente. Em seguida, insira o capilar em um furo na extremidade plana da agulha de quartzo de furo duplo. Usando a chama para puxar um capilar de sílica fundida como emissor nanoESI, corte de 7 a 10 mm de comprimento e insira-o no outro orifício na extremidade plana da agulha de quartzo de furo duplo.

Aplique uma quantidade mínima de resina de cura UV na extremidade plana da agulha de quartzo de furo duplo. Solidifique a resina usando uma lâmpada LED UV por aproximadamente 20 segundos, para proteger o capilar fornecedor de solvente e o emissor nanoESI. Em seguida, corte uma lâmina de vidro de microscópio padrão ao meio no sentido do comprimento.

Em seguida, coloque a sonda única em uma extremidade da lâmina de vidro, de modo que o emissor nanoESI fique apontado para fora. Aplique o epóxi regular no corpo da sonda única para que fique preso na lâmina de vidro antes de deixar endurecer durante a noite. Este sistema inclui um flange de interface de fonte de íons personalizado do espectrômetro de massa e uma placa óptica de alumínio que é conectada ao microscópio digital USB, estágio de tradução XYZ manual em miniatura e o sistema de estágio de tradução XYZ motorizado.

Modificar a flange de interface da fonte iónica do espectrómetro de massas e fabricar o suporte do estereomicroscópio digital conforme descrito no protocolo de texto. Conecte o estereomicroscópio digital modificado, um microscópio digital USB, um estágio de tradução XYZ manual em miniatura com um suporte de grampo flexível e o sistema de estágio de tradução XYZ motorizado à placa óptica de alumínio. Use o suporte de grampo flexível para fixar a corrediça de vidro presa com uma sonda única.

Em seguida, conecte a configuração de sonda única ao espectrômetro de massa. Ajuste o suporte de grampo flexível e o estágio XYZ em miniatura para colocar o emissor da sonda única na frente da entrada do espectrômetro de massa. Descongele a seção de amostra à temperatura ambiente e coloque-a no sistema de estágio de translação XYZ motorizado embaixo da sonda única.

Ajuste a posição da amostra alterando as coordenadas no software de controle. Utilizar uma seringa para bombear o solvente de recolha a uma velocidade adequada. E então, aplique a tensão de ionização.

Ajustar a altura da sonda única de modo a que fique ligeiramente acima da superfície da amostra e capaz de efectuar a extracção superficial dos metabolitos. Levante cuidadosamente o estágio Z e, em seguida, use o microscópio digital USB para monitorar a mudança de distância entre a ponta da sonda única e a superfície do tecido. Defina os parâmetros para rastejamento na seção de interesse dentro da amostra.

Para as seções de rim de camundongo apresentadas aqui, use uma velocidade de rastering de 10 micrômetros por segundo e uma distância de 20 micrômetros entre as linhas. Defina os parâmetros para rastejamento na seção de interesse dentro da amostra. Para as seções de rim de camundongo apresentadas aqui, use uma velocidade de rastering de 10,0 micrômetros por segundo e uma distância de 20 micrômetros entre as linhas.

Configurar um método para a aquisição automatizada de espectros de MS do espectrômetro de massa. Para MSI de alta resolução de massa em uma amostra de rim de camundongo, use uma resolução de massa de 60.000, um modo positivo de 5kV, 1 microscan, tempo máximo de injeção de 150 milissegundos e controle automático de ganho ativado. Inicie a aquisição de dados MSI e, em seguida, construa imagens MS a partir de arquivos MS brutos, conforme descrito no protocolo de texto.

Configure o sistema de sonda única de acordo com as instruções do MSI e ajuste a taxa de fluxo do solvente. Lave as células cultivadas presas nas lâminas de vidro da microcapa com PBS para remover meios culturais e componentes extracelulares de drogas. Em seguida, coloque a lâmina de vidro contendo células no sistema de estágio de tradução XYZ motorizado para o experimento.

Focalizar o estereomicroscópio digital por cima da amostra, na ponta da sonda única para monitorizar a penetração das células durante a análise. Use o microscópio digital USB na lateral da sonda única para monitorar as condições de trabalho do emissor nanoESI na sonda única. Use o programa de controle de platina XYZ motorizado e o estereomicroscópio digital para localizar uma célula de interesse e posicionar com precisão a ponta de sonda única acima da amostra.

Inicie a aquisição de dados MS antes que a ponta de sonda única seja inserida na célula. Abaixe a placa que contém a célula para puxar a ponta da sonda única para fora da célula. Finalmente, deixe o solvente fluir por aproximadamente três minutos, para lavar completamente a sonda única.

A imagem de espectrometria de massa ambiente de cortes de rim de camundongo foi realizada e um grande número de moléculas presentes na superfície do tecido pode ser detectado. A distribuição espacial e a abundância relativa de múltiplas moléculas na superfície do tecido foram plotadas. Uma resolução espacial de 8,5 mícrons foi alcançada através da observação de transições nítidas de características presentes nos dados de espectrometria de massa.

A fabricação da sonda única com uma ponta afiada e canais abertos é fundamental para a análise de célula única. Microscópios são necessários para localizar as células-alvo e monitorar o processo de penetração celular. A mudança de sinal dos espectros de massa também fornece informações adicionais para confirmar a penetração celular.

Um grande número de moléculas foi detectado a partir de células individuais vivas. Quando usados para estudos de drogas anticâncer, experimentos com células de controle são usados para mostrar a diferença do tratamento com drogas anticâncer. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como a sonda única é fabricada e como esse dispositivo é usado para análise de espectrometria de massa de célula única e imagem de espectrometria de massa ambiente de tecidos biológicos.

Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque instruções detalhadas são necessárias para fabricar o dispositivo de sonda única, configurar todo o sistema e operar os instrumentos. Uma vez dominada, a análise de célula única pode ser realizada continuamente para muitas células. E cada análise leva menos de três minutos.

A conclusão de um experimento de imagem de MS ambiente pode levar algumas horas, dependendo do tamanho da amostra, da resolução espacial e do espectrômetro de massa usado. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que fabricar uma sonda única de alta qualidade é a etapa principal. Além disso, a afinação e a operação do instrumento são essenciais para conduzir um experimento com sucesso.

Outros métodos podem ser desenvolvidos seguindo procedimentos semelhantes aos aqui apresentados. Por exemplo, reagentes podem ser adicionados ao solvente da amostra e a análise reativa de célula única e MSI ambiente podem ser realizadas para melhorar a detecção de moléculas de amostras. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores em análise de célula única e estudos de imagem por espectrometria de massa em condições ambientais.

Essa técnica pode ser potencialmente usada para pesquisas em biologia celular, estudos farmacológicos e testes clínicos. Não se esqueça de que trabalhar com capilares de quartzo afiados e epóxi de cura UV pode ser perigoso, e precauções como usar luvas e óculos de segurança UV devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.