Medição das flutuações cálcio dentro do Sarcoplasmic retículo de células musculares lisas cultivadas utilizando FRET baseado em imagem confocal

O objetivo geral dessa técnica de imagem é monitorar as flutuações nos níveis de cálcio no lúmen do retículo sarcoplasmático em resposta a agentes mobilizadores de cálcio, especificamente em células musculares lisas vasculares. Este método pode ser útil para elucidar o ciclo celular de cálcio de maneira mais direta. Por exemplo, é muito importante conhecer a relação entre o transporte de cálcio no retículo sarcoplasmático e o estresse do retículo endoplasmático.

A vantagem dessa técnica é que podemos medir diretamente o cálcio dentro da luz do retículo sarcoplasmático, em vez de termos que extrapolar a partir de medições indiretas de alterações no citoplasma. Demonstrará esta técnica Gabriela Ziomek, que é aluna de pós-graduação no meu laboratório. Para iniciar este procedimento, prepare uma diluição de 1 para 25 da mistura de proteína em DMEM.

Em seguida, transfira 200 microlitros da mistura proteica DMEM para cada placa de fundo de vidro de 35 milímetros, cobrindo completamente o círculo interno de vidro do fundo. Deixe as placas à temperatura ambiente dentro da câmara de segurança por pelo menos 30 minutos. Enquanto isso, aqueça o DMEM com 10 por cento de NCS a 37 graus Celsius em banho-maria.

Posteriormente, remova o DMEM do frasco de cultura utilizando uma pipeta de vidro. Em seguida, lave o fundo do frasco com PBS estéril e morno para remover os resíduos remanescentes de DMEM. Para destacar as células musculares lisas cultivadas do fundo do frasco, lave o frasco rapidamente com um mililitro de tripsina e remova-o.

Em seguida, adicione mais um mililitro de tripsina. Agite o frasco por cerca de 30 a 60 segundos para garantir que a enzima entre em contato com toda a superfície inferior do frasco antes de removê-lo. Assim que as células forem destacadas pela tripsina, adicione ao frasco DMEM fresco com 10 por cento de SNC para interromper a reação da tripsina.

Transfira a solução celular resultante do frasco para um tubo cônico de 50 mililitros limpo e devidamente rotulado. Em seguida, adicione um mililitro de DMEM fresco contendo 10 por cento de NCS a cada placa que estiver sendo preparada. Depois disso, inverta suavemente o tubo contendo a solução celular várias vezes para desagregar qualquer pellet que possa ter se formado.

Pipete o volume desejado da solução celular suavemente misturada em cada placa. Em seguida, agite bem cada placa no sentido horário ou anti-horário para garantir uma distribuição uniforme das células sobre o vidro na base. É necessário adicionar um número suficiente de células à placa para assegurar que atinjam uma confluência adequada nas próximas 48 horas, permitindo uma imagem eficaz.

Após a adição do meio e da solução celular a cada placa, incubar as placas a 37 graus Celsius com cinco por cento de dióxido de carbono por pelo menos uma hora para permitir que as células adiram corretamente ao fundo de vidro. Verificar as placas ao microscópio em intervalos de quinze minutos até que as células estejam claramente aderidas. Em seguida, retirar a alíquota de Adenavírus D um SR do armazenamento a menos 80 graus Celsius e transportá-la para a cabine de segurança biológica em um banho de gelo móvel. Depois disso.

Pipete a dose desejada de D one SR gelado para cada placa e incube as células infectadas a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, reponha o meio com um mililitro de DMEM fresco contendo dez por cento de SNC. Em seguida, incube as placas em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com cinco por cento de dióxido de carbono durante a noite.

Após incubação durante a noite, remova o meio de cultura da placa. Lave a placa de cultura com um mililitro de tampão HEPES-PSS fisiológico morno três vezes. Em seguida, adicione um mililitro de tampão HEPES-PSS fresco e morno imediatamente antes do registro.

Realize a imagem inicial utilizando o aplicativo FRET SE abrindo o software associado ao microscópio confocal. Após abrir o aplicativo, clique na guia de configuração para ajustar as configurações experimentais desejadas. Altere manualmente as configurações dos canais para que as células sejam excitadas sequencialmente em 440 nanômetros para o doador e FRET e em 513 nanômetros para o aceptor.

Em seguida, defina os comprimentos de onda de emissão em 488 nanômetros para o doador e 535 nanômetros para a FRET e o aceptor. Posteriormente, ajuste a intensidade da luz em 15 por cento de transmissão, com tempo de exposição de excitação de 150 milissegundos para as células e intervalos de 10 segundos entre as exposições. Em seguida, estabilize a placa na platina do microscópio.

Use o botão ao vivo para verificar a resolução da imagem. Ajuste as configurações conforme necessário para obter a resolução desejada. Na guia configuração, tire uma imagem da amostra usando o botão capturar imagem.

Agora, ao passar para a aba de avaliação, escolha o método apropriado para calcular as eficiências de FRET para os experimentos que estão sendo realizados. O método três, que utiliza o cálculo ratiométrico, é recomendado para experimentos envolvendo Cameleons, como o indicador D um SR. Depois disso, mude para a aba de gráfico para observar os valores de intensidade registrados em um gráfico.

Se desejar, desenhe uma ROI no visualizador de imagens para observar a intensidade média correspondente dessa região de interesse no gráfico. Inicie o registro para coletar os dados por pelo menos três minutos, garantindo um sinal de linha de base estável antes de introduzir o agente de interesse. Em seguida, introduza um agente mobilizador de cálcio como ferramenta para esgotar o cálcio do retículo sarcoplasmático, aplicando-o diretamente na placa próxima à região de interesse que está sendo registrada.

Continue o registro por um tempo desejado após o tratamento. Em seguida, capture as imagens seriadas ratiométricas de FRET com um microscópio confocal invertido utilizando o aplicativo FRET SE. Nesta etapa, para preparar as placas de cultura de células musculares lisas aórticas de rato, lave a placa de cultura três vezes com um mililitro de tampão HEPES-PSS fisiológico aquecido.

Em seguida, misture o indicador com um mililitro de HEPES-PSS morno e adicione-o às placas de cultura. Incube as células de músculo liso com o indicador por uma hora à temperatura ambiente. Após uma hora, remova o indicador da placa de cultura e lave com um mililitro de tampão fisiológico de HEPES-PSS morno três vezes.

Em seguida, adicione um mililitro de tampão HEPES-PSS fresco e aquecido imediatamente antes da gravação. Capture imagens em série com o microscópio confocal invertido. Posteriormente, introduza o agente movimentador de cálcio como uma ferramenta para esgotar o cálcio do retículo sarcoplasmático e continue a gravação pelo tempo desejado após o tratamento.

Mostradas aqui estão as imagens representativas de uma célula muscular lisa transfectada com o indicador D um SR utilizando filtros passa-banda CFP, FRET e YFP. Esta figura mostra imagens em pseudocores em tempo real de células musculares lisas aórticas de rato em cultura, transfectadas com D um SR. O tratamento com dois micromolares de tapsigargina mostrou uma diminuição na intensidade do sinal, indicando uma queda significativa no conteúdo de cálcio do retículo sarcoplasmático devido à liberação de cálcio induzida pela tapsigargina. E este gráfico mostra o traçado representativo da razão normalizada de D um SR nas células musculares lisas em cultura tratadas com dois micromolares de tapsigargina, o que confirmou uma queda significativa no cálcio do retículo sarcoplasmático.

Aqui estão imagens representativas de células musculares lisas aórticas de rato em cultura, carregadas com indicador citoplasmático de cálcio e tratadas com dois micromolares de Tapsigargina. Como mostrado, a Tapsigargina causa um aumento significativo na intensidade do sinal no citoplasma devido à liberação de cálcio do retículo sarcoplasmático. E este gráfico mostra um traçado representativo da razão normalizada de Fluo quatro AM nas células musculares lisas em cultura tratadas com dois micromolares de Tapsigargina. O aumento no sinal de cálcio representado é considerado proporcional à quantidade de cálcio liberada do retículo sarcoplasmático. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente 48 horas do início ao fim, se for feita corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante manter as células nas condições descritas para garantir sua viabilidade antes da transfeção com o indicador de cálcio. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender claramente como preparar células cultivadas para permitir a medição dos níveis de cálcio no retículo sarcoplasmático utilizando o indicador D one SR.