Name: Extracelular Gravação de Neuronal Atividade Combinado com Microiontophoretic aplicação de substâncias neuroativos em Ratos Awake (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprenda a gravar atividade neuronal extracelular combinada com aplicação microiontoforética de substâncias neuroativas em ratos acordados. Este método permite manipular entradas sinápticas locais e estudar sistemas moduladores sem anestesia.

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Este projecto foi financiado pela MINECO concede BFU201343608-P e PSI2013-49348-EXP, eo SA343U14 concessão JCYL ao financiamento HSH e MRC núcleo para ARP. YAA realizou uma CONACyT (216.106) e uma bolsa de setembro

Todos os procedimentos experimentais foram realizados na Universidade de Salamanca com a aprovação, e usando métodos em conformidade com as normas de uma Universidade do Comitê Animal Care Salamanca, bem como as normas da União Europeia (Directiva 2010/63 / UE) para o uso de animais em pesquisas de neurociência. 1. eléctrodos de tungsténio Nota: O fabrico de eléctrodos de tungsténio baseia-se na técnica original descrita na Merrill e Ainsworth 27 e Ainsworth et al 28 e realizada usando a configuração de estação de trabalho descrita no Bullock et al, 17... <ol><li> Para gravar a atividade extracelular unidade única de neurônios IC, usar eletrodos com uma impedância ponta 1,5-2,5 mohms. Aqui, os passos envolvidos no fabrico do eléctrodo de tungsténio são descritas apenas por pouco tempo, uma vez que uma descrição detalhada é encontrada nas referências acima mencionadas. </li><li> Coloque fios de tungstênio num alinhamento custom-builtferramenta (Figura 1A) para auxiliar cortando-os para o comprimento desejado. A ferramenta de alinhamento é constituído por 30 agulhas (25 g) coladas em paralelo em intervalos de 2 mm, com uma paragem numa extremidade de limitar o comprimento dos cabos a ~ 40 mm. Cuidadosamente anexar as pontas soltas dos fios com fita adesiva, e cortar o resto do fio com uma tesoura forte. </li><li> Puxar suavemente a partir da fita, a fim de remover os fios de tungsténio a partir de a ferramenta de alinhamento, certificando-se de que todos os fios permanecem ligados à fita. Rolar a fita em um eixo de latão polido (Figura 1B, C), segurando os fios firmemente contra o eixo para que haja uma boa conexão elétrica. </li><li> Ligue o eixo de um motor 5 rpm na estação de trabalho, e mergulhar as pontas de fio salientes em uma solução de ataque químico (KNO 2, 90 g por 80 ml). Ângulo do eixo do fuso de 45 ° em relação à superfície da solução de gravação. Mergulhar as pontas do fio de modo que ~ 1/3 dos fios de contacto a solução. </li><li> immerse um eléctrodo de vareta de carbono para o banho de decapagem para fechar o circuito. Utilize uma mola escova trança de cobre para aplicar o fornecimento de gravação para o eixo do fuso, enquanto o veio está a rodar. Ajustar a corrente que passa através dos eléctrodos e a solução de ataque químico a 250 mA. Pare o condicionamento ponta quando a corrente cai para 200 mA. As pontas de arame será gravado em pontos muito finos. </li><li> Passe um fio afiada através de uma chama para remover qualquer resíduo de graxa e adesivo. Coloque o fio (extremidade embotada em primeiro lugar) para um capilar de vidro de borossilicato (1,5 mm de diâmetro externo, 0,86 mm de DI) com a sua extremidade inferior bloqueada com massa de modelar. Fixe a pipeta verticalmente na parte superior e inferior. Puxar a pipeta usando uma serpentina de aquecimento (5 mm de diâmetro, 5 mm de profundidade) e um êmbolo suspenso. À medida que o fio é puxado para baixo pelo peso do êmbolo, o vidro fundido forma uma camada muito fina em torno dele. </li><li> Remover o vidro que cobre a ponta afiada na extremidade do eléctrodo com a ajuda de um cordão de fundido de sódiotetraborate. Para formar o grânulo, misturar o tetraborato de sódio (~ 0,25 g) com uma pequena quantidade de água (~ 0,5 ml) e, lentamente, colocá-lo sobre um elemento de aquecimento, até que se funde com um talão de ~ 2 mm de diâmetro. A temperatura do elemento de aquecimento é controlado por um potenciómetro. Coloque o cordão e elemento de aquecimento em um braço manipulador fixado à mesa, e movê-lo até que o cordão está focada sob o microscópio em baixa ampliação. </li><li> Prenda o fio com cobertura de vidro para um slide e colocá-lo sob o microscópio. Mova o controle deslizante com os botões de palco até que a ponta e talão tetraborate estão em foco. Aqueça o talão até que derreta um pouco, e insira a ponta do fio ~ 10 - 15 mm. Girar o potenciômetro aquecimento desligado. Como o rebordo arrefece, ela contrai-se e irá remover o vidro a partir da ponta do eléctrodo, expondo o tungsténio subjacente. O eletrodo de tungstênio está pronto para usar. </li></ol> 2. Multibarrel vidro Pipeta Manufacturing <ol><li> Proteger as extremidades do multicapilares barril de vidro (cinco barris em H-configuration) com tubos de calor encolhe, para permitir uma melhor aderência aos grampos extrator e evitar a ruptura, e coloque um no puxador vertical. </li><li> Para obter comprimentos de ponta de ~ 15 mm, definir o extrator com os seguintes parâmetros: Calor: 84, Sub força de ímã: 49, força magneto principal: Fine-tune 38. esses parâmetros de acordo com a configuração específica, bem como depois de mudar o elemento de aquecimento. </li><li> Puxe o capilar para obter duas pipetas com as pontas ocluído. Montar uma pipeta sobre uma lâmina utilizando argila de modelagem e quebrar a ponta da pipeta sob o microscópio até que o diâmetro externo é de ~ 20 - 30 um, utilizando uma tesoura fina ou fórceps, ou o lado liso de um bisturi. Se a borda quebrada é muito áspero, refiná-lo usando a técnica tetraborate talão descrito na etapa 1.7. </li><li> Coloque um eléctrodo de tungsténio (de secção 1) num suporte feito com uma agulha G 20, no final de um microposicionador miniatura de 3 eixos montado no microscópio veadoe. Usando fórceps, dobrar a extremidade do eléctrodo de 5 - 10 °, ~ 30 mm da ponta. </li><li> Sob o microscópio, alinhe cuidadosamente o eletrodo de tungstênio sobre a ponta multibarrel. Uma vez alinhados, abaixe o eletrodo até que ele contata o multibarrel, encaixando no sulco entre os dois barris superiores. Deslize a ponta do eléctrodo, até que se projecta ~ 15 - 20 pM de distância a partir da ponta da multibarrel. Adicione o ângulo entre o eléctrodo e o multibarrel tão pequena quanto possível para se obter uma melhor ligação e um conjunto mais fino. </li><li> Aplique uma pequena gota de luz curável adesiva ~ 5 mm de distância das pontas. Tenha cuidado para que a cola não alcança a ponta para evitar o bloqueio dos canais multibarrel. </li><li> Curar a cola usando uma lâmpada de luz LED azul. Repita a cola application / cura, se necessário, para melhor aderência. </li><li> Mover a platina do microscópio suavemente até que a extremidade do eléctrodo de tungsténio é libertado do seu suporte. Retirar o conjunto piggy-back do slide. </li><li> enrole the secção intermédia do eléctrodo piggy-back em um curto período de calor encolher tubo e aplicar rápida apropriada de cura epóxi para o vidro para proteger ainda mais o eletrodo de tungstênio ao multibarrel. </li></ol> 3. Medicamentos para Microiontophoresis Nota: As drogas utilizadas para microiontophoresis deve ter uma carga eléctrica, quando dissolvido em água. Verifique a literatura para ver se o fármaco de interesse é adequada para este procedimento. Aqui, o processo para gabazine, um antagonista do receptor de GABA A, é descrita. <ol><li> Filtrar a água destilada utilizando um filtro de seringa de 0,2 mm para esterilizar a água e garantir que não contém solutos. Prepare ~ 1.000 ul de 20 mM gabazine usando essa água destilada. </li><li> Ajustar o pH da diluição a 4 com 0,2 fim de NaOH filtrada utilizando um eléctrodo de pH de ponta fina. </li><li> Armazenar 100 - 200 mL alíquotas a -20 ºC. Descongelar no dia da gravação. Naquele dia, antes de o animal é contêEd, preencher os tambores (3-5 ul) de o eléctrodo multibarrel com as drogas, utilizando uma micro-seringa de 100 ul ajustada com uma agulha de plástico flexível. </li></ol> 4. Cirurgia e Headpost Implantação <ol><li> Realizar experimentos em dois ratinhos CBA / J machos (Mus musculus), com pesos de 27 e 30 g. Siga os procedimentos cirúrgicos e de gravação de Bryant e seus colegas 29, Portfors e colaboradores 30-32, e Duque e Malmierca 26. </li><li> Nos dias antes da cirurgia, os animais manusear e habituar-las para a câmara de gravação, permitindo-lhes a explorar livremente. Faça 3 sessões por dia, cada uma com duração de pelo menos 30 min. Desta forma, os animais vão ser mais calmo e confortável durante as gravações. </li><li> Anestesiar o rato utilizando uma mistura de cetamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) injectada por via intramuscular. Com esta dose, o animal é anestesiado profundamente por cerca de 1 h. Dê doses suplementares de um third da dose inicial, conforme necessário. </li><li> Colocar o animal em um cobertor de aquecimento ajustado para manter uma temperatura de 38 ± 1 ºC e estabilizar a cabeça do animal em um quadro estereotáxico, usando duas barras de ouvido e um bar mordida. Tenha cuidado para não perfurar a membrana timpânica com as barras de ouvido. </li><li> Proteger os olhos por aplicação de uma gota de gel oftálmico. </li><li> Raspar o couro cabeludo com uma tesoura e aplicar iodopovidona para desinfectar a pele. </li><li> Usando um bisturi, fazer uma incisão ao longo da linha média para expor o crânio e retrair o periósteo cobrindo o parietal e a parte mais rostral dos ossos occipitais. </li><li> Cole um headpost leve duralumínio (peso ~ 0,65 g, 30 mm de comprimento, Figura 2A) com uma base plana e redondo (5 mm de diâmetro) no crânio. Cole um fio de prata para o meio da headpost deixando suas extremidades livres. O fio de prata será utilizado como o eléctrodo de referência para o registo electrofisiológico. </li><li> Aplicar uma fina camada de ligHT-adesiva curável no crânio e a base do headpost. Esperar 10 seg e colocar o headpost sobre a área rostral dos ossos parietais, ao longo da linha média. </li><li> Para uma força de ligação eficaz, luz curar o adesivo usando uma fonte de luz azul por 20 s. </li><li> Perfurar três buracos ao redor e atrás da base do headpost usando uma furadeira elétrica e uma pequena broca. </li><li> Coloque dois parafusos relógio (~ comprimento 2 mm) nos orifícios perfurados para servir como pontos de contacto adicionais entre o crânio e o headstage. Os parafusos requerem 1½ volta-se para obter um ajuste confortável. Testar os parafusos com uma pinça para se certificar que não estão soltos. </li><li> Insira a ponta do fio terra de prata no terceiro buraco certificando-se que os contactos da dura-máter. Aplique uma pequena gota de água cianoacrilato resistentes cola para ligar o fio ao crânio. </li><li> Aplique composto de cura de luz para reforçar o vínculo da headpost com o crânio. Cobrir a base do headpost, a parte baixa do fio de prata,e os parafusos, tomando cuidado para não estender por trás lambda, para permitir o acesso durante a gravação. Curar usando uma fonte de luz azul. </li><li> Retrair o músculo na parte de trás do pescoço próximo a sua inserção no crânio. Usando um pequeno trephine (2,35 mm de diâmetro), fure uma janela redonda logo abaixo sutura lambda e lateral à linha média, para expor o colículo inferior (CI). Quando as fronteiras estão soltos, puxe o osso cobrindo com uma pinça fina. Se ocorrer sangramento, lavar com solução salina estéril frio para pará-lo. </li><li> Adicione uma parede pequena (~ 1 mm de largura e ~ 1 mm de altura) em torno da janela com composto e de luz que cura. </li><li> Cobrir o crânio exposto e muscular com pomada antibiótica. Em seguida, molhar a superfície exposta do IC com solução salina estéril e cobri-lo com geleia de petróleo, o enchimento do poço gerado depois de fazer a parede em torno da janela de gravação. </li><li> Injectar subcutaneamente buprenorfina (0,03 mg / kg, diluída 1:10 em solução salina estéril) como um analgésico. </li><li> Manter o animal em tele aquecimento cobertor até que ele acorda e devolvê-lo à sua gaiola de habitação para recuperar da cirurgia durante três dias antes das sessões de gravação. Casa animais na gaiola de habitação rat&#39;s indivíduo para evitar companheiros de gaiola limpando a geléia eo headpost toque na tampa de metal da grade. Colocar um pouco de enriquecimento na gaiola quando o animal é único alojados. Além disso, mudar diariamente a serragem para prevenir a infecção e verifique cuidadosamente que o animal recupera adequadamente e não mostra quaisquer sinais de desconforto. Além disso, verifique se vaselina é sobre a proteger o cérebro exposto janela de gravação. </li></ol> 5. eletrofisiológica Gravação e Microiontophoresis <ol><li> Após a recuperação, dar tempo ao animal para se aclimatar ao ambiente de gravação e com a cabeça contido. Aclimatar o animal através da fixação da headpost ao titular enquanto o mouse está sentado em um limitador de espuma almofadado feito por encomenda esculpida ao seu tamanho corporal (Figura 2B). Este lim vontadeque os movimentos do mouse, irá contribuir para a sua calma. </li><li> Comece com 10 mínimo de sessões e aumentar progressivamente a duração de até 120 min. Durante a sessão, premiar os animais com líquidos doces (leite condensado, diluída 30:70 em água) em determinados intervalos de 33. Mais tarde, durante a sessão de gravação, dar a mesma recompensa no início e no fim da sessão ou quando não é isolado neurónio. </li><li> Se o animal está muito animado antes da gravação, injetar o acepromazina leve sedativo (2 mg / kg, intraperitoneal). De acordo com o sistema neural de interesse, o sedativo pode afetar seus resultados. </li><li> Deixe o animal explorar livremente a câmara de gravação para 5 - 10 min. </li><li> Coloque o corpo do animal para o limitador almofadada de espuma feitos sob medida (Figura 2B). </li><li> Fixar o headpost a um suporte fixado à armação estereotáxica (Figura 2C). Este é um bom momento para dar ao animal uma recompensa líquido. </li><li> coVer o corpo do animal com uma manta de algodão e frouxamente fixá-la utilizando um meio-cilindro de plástico e fita adesiva. </li><li> Remova a geléia de petróleo a partir da janela de gravação e enxaguar com soro fisiológico morno estéril. </li><li> atividade neural registro e aplicação iontoforética de gabazine. <ol><li> Colocar o eléctrodo multibarrel ao seu titular, controlado por um Microdrive e ligada a um micromanipulador. </li><li> Ligue os fios para a gravação, usando pequenos clipes de crocodilo. Ligar o terminal positivo para o fim do eléctrodo de tungsténio, e o terminal de terra ao fio de prata que contacta com a dura-máter. </li><li> Coloque um fio de prata não revestidos no interior de cada barril, para que se contactos finais da solução e a outra extremidade está acessível. Conectar essas extremidades para o dispositivo microiontophoresis, seguindo as instruções do fabricante. </li><li> Mova o eletrodo multibarrel até que os contatos ponta da superfície do cérebro. Aplicar soro fisiológico estéril quente para impedir a dessecação de the tecido cerebral. Nesse ponto aplicar uma corrente de retenção (-10 nA para gabazine, vá literatura para a droga particular) para evitar a fuga do fármaco a partir da ponta do tambor, enquanto procura actividade de unidade única. </li><li> Utilize as técnicas padrão para isolar a atividade extracelular único neurônio. Obter a área de resposta de frequência (FRA) do neurónio, ou seja, a combinação de frequências e intensidades capaz de evocar uma resposta, porque o neurónio é sensível a estes sons 34-36. </li><li> Escolha duas frequências (F1 e F2) que evocam uma taxa de disparo semelhante e padrão. Apresentar cada uma dessas freqüências de estímulo tão raro e repetitivo sob o paradigma oddball. Nota: Resumidamente, no paradigma excêntrico, uma frequência (F1) é apresentado como o estímulo repetitivo com uma alta probabilidade de ocorrência, enquanto que a segunda (F2) é o estímulo desviante ocorrendo raramente, intercalado aleatoriamente entre os repetitivos. Em uma segunda sequência de aves raras, o parenteprobabilidades de os dois estímulos são invertidos. Detalhes do paradigma de estimulação foram descritos anteriormente 22,37. </li><li> Solte o gabazine deslocando a corrente para valores positivos (10-20 NA). Obter novamente a FRA e repita o paradigma oddball sob a aplicação gabazine. Manter a ejecção até que um efeito visível na taxa de disparo é observado; que normalmente leva 5-20 minutos, dependendo da droga em particular, a sua concentração, e a magnitude da corrente de ejecção. Repetir o protocolo de gravação para obter os valores sob o efeito da droga. </li><li> Pare a injecção, retornando a corrente para os valores de retenção. Espere até que o efeito da droga para lavar através da monitorização que o FRA ou resposta ao paradigma excêntrico retorna aos valores de controlo. Nota: As sessões de gravação pode durar 2-3 horas por dia, e deve ser encerrado mais cedo, se o animal apresentar qualquer sinal de desconforto ou lutando. Dê líquido recompensa e cobrir o ch gravaçãoâmbar com vaselina. </li></ol></li></ol> Análise 6. Os dados <ol><li> Medir a FRA antes e durante a injecção gabazine, bem como o nível de SSA. </li><li> Quantificar a força da resposta SSA pelo índice common-SSA (CSI) eo índice de SSA específicas de frequência (SI), como descrito anteriormente 19,22,23,38,39. A CSI e SI refletir a diferença normalizada entre a resposta neuronal ao estímulo raro e a resposta ao repetitivo. Positivos valores CSI e SI indicar a resposta neural (espigas por estímulo) foi maior para raros do que a tons repetitivas. </li><li> Comparar os dados da condição de controle e de ejeção de drogas. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O microiontophoresis de substâncias neuroativos em animais acordados é uma técnica poderosa para sondar e dissecar o papel de entradas sinápticas específicas sobre a atividade de neurônios individuais 40,41. Mais importante ainda, este procedimento permite a determinação do impacto dos neurotransmissores e neuromoduladores nos circuitos neurais sem o potencial de interferência de anestésicos. Aqui, demonstramos que a aplicação de gabazine no IC de ratos acordados robustamente mudou a sintonia de frequência <s...

A interacção da excitação neural e inibição é fundamental para o processamento da informação sensorial 1. Sabe-se também que a anestesia tem um forte impacto sobre a dinâmica de activação cortical e do padrão temporal de entradas sinápticas 2,3. Por exemplo, tem-se observado que os anestésicos alterar a duração das respostas visuais evocados nos neurónios corticais 3,4. Além disso, a relação entre as entradas excitatórios e inibidores sinápticas é diferente em animais anestesiados e desperto 4,5, alterando ambos evocados e as taxas de actividade espontânea 6,7. Ao medir as condutâncias sinápticas, Haider e colegas 4 descobriu que a inibição de excitação combinado em amplitude sob anestesia que, durante a vigília, a inibição foi mais forte do que a excitação. Estas descobertas solicitar o desenvolvimento de procedimentos experimentais para estudar o impacto de entradas sinápticas específicas no processamento sensorial em animais acordados. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; A ejeção controlada de substâncias neuroativos cobradas pela aplicação de pequenas injeções atuais (da ordem de nA) tem sido amplamente utilizada para estudar a contribuição de entradas sinápticas eo papel dos receptores celulares putativos no processamento sensorial 8-13 . Esta técnica, conhecida como microiontophoresis, permite a aplicação de medicamentos na vizinhança do neurónio gravada, a qual contribui para um efeito rápido e confinado. Este procedimento é mais apropriado para estudar os efeitos locais de substâncias neuroactivos, em comparação com o efeito generalizado provocado por outras manipulações experimentais, tais como injecções sistémicas, microdiálise ou a utilização de técnicas de optogenetic. Normalmente, uma configuração de eletrodo piggy-back 14,15 é usado para gravar simultaneamente o neurônio alvo e entregar as substâncias neuroativos de interesse. É constituída por um eléctrodo de registo ligada a uma pipeta multibarrel que transporta as substâncias neuroactivos. Modificações do oprocedimento riginal descrito por Havey e Caspary 14 foram implementadas. Por exemplo, um eléctrodo de tungsténio, em vez de um vidro, pode ser utilizado para registar a actividade neuronal 16. Métodos publicados anteriormente para o fabrico de eléctrodos de tungsténio 17,18 envolve três etapas gerais: ataque eletrolítico de pontas de fio de tungstênio, isolamento de vidro, e o ajuste da exposição ponta para satisfazer as necessidades de gravação. Um campo interessante e emergentes em neurociência auditiva é o estudo de adaptação específicas de estímulo (SSA 19). SSA é uma diminuição específica na resposta neural para sons repetitivos que não generaliza para outros sons, raramente apresentados. A importância da SSA reside no seu papel potencial como um mecanismo de detecção de desvio neural subjacente no cérebro auditivo, bem como uma possível correlação neuronal para o componente incompatibilidade negatividade tardia do potencial evocado auditivo 20,21. SSA occurs do IC, até o córtex auditivo 19,22-24. A inibição mediada por GABA tem sido demonstrada para actuar como um mecanismo de controlo de ganho no SSA 7,16,25, que também tem sido mostrado a ser afectado por anestesia 26. Aqui apresenta-se um protocolo que combina métodos anteriormente descritos para gravação a actividade de uma única unidade do neurónios IC antes e durante a aplicação de um antagonista selectivo dos receptores de GABAA em ratos despertos. Em primeiro lugar, descrevemos a fabricação de eletrodos piggy-back e no próximo, os métodos cirúrgicos e de gravação. Para testar a eficácia da libertação do fármaco, foi comparado o campo receptivo, bem como o nível de SSA de neurónios IC antes e durante a ejecção de microiontophoretic gabazine.

<table><tbody><tr><td>Fio de tungstênio</td><td>Harvard Apparatus LTD</td><td>33-0099</td><td>0.005 polegadas x 3 polegadas</td></tr><tr><td>Capilar de vidro borosilicato&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus LTD</td><td>30-0053</td><td>Parede padrão de borosilicato sem filamento, 1,5 mm OD, 0,86 mm ID, 100 mm de comprimento</td></tr><tr><td>Capilares de vidro multibarril&nbsp;</td><td>Instrumentos de Precisão Mundial</td><td>5B120F-4&nbsp;</td><td>Capilar de 5 cilindros, 4 polegadas de comprimento, 1,2 mm OD, com filamento</td></tr><tr><td>Diaplus</td><td>DiaDent</td><td>2001-2101</td><td>Adesivo fotopolimerizável, usado para prender o eletrodo de tungstênio à pipeta multibarril de vidro</td></tr><tr><td>G-Bond</td><td>GC Corporation</td><td>2277</td><td>Adesivo fotopolimerizável, usado para prender o espigão ao crânio do animal</td></tr><tr><td>Carisma</td><td>Heraeus Kulzer</td><td>66000087</td><td>Compósito fotopolimerizável, usado para reforçar a ligação do espigão com o crânio</td></tr><tr><td>Araldit Cristal</td> Expoxy de 2 componentes <td>Ceys</td><td>, usado para fixar ainda mais a fixação do eletrodo de tungstênio à pipeta multibarril de vidro</td>Manta de aquecimento Cibertec RTC1 Quadro estereotáxico Narishige SR-6N Modificado para camundongos <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Dispositivo microiontoforético Harvard Apparatus LTD Neurophore BH-2 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Incluindo bombas de iontoforese IP-2 (uma para cada canal de administração de medicamentos) e um módulo de equilíbrio</td></tr><tr><td>Extrator de pipetas de vidro multibarril</td><td>Lâmpada LED Narishige</td><td>Modelo PE-21</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Technoflux</td><td>CV-215</td><td>5 W, 430-485 nm</td></tr><tr><td>MicroFil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>Agulha plástica flexível, 34 AWG</td></tr><tr><td>Imalgene</td><td>Merial</td><td></td><td>Cetamina, 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer</td><td></td><td>Xylazine, 20 mg/mL</td></tr><tr><td>Gabazine / SR-95531</td><td>Sigma</td><td>S106</td><td>Prepare ~ 1000&micro; l de 20 mM de gabazina em água destilada e ajustar o pH para 4</td></tr></tbody></table>

extracelular gravação de neuronal atividade combinado com microiontophoretic aplicação de substâncias neuroativos em ratos awake

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Diferenças na atividade de neurotransmissores e neuromoduladores e, consequentemente, diferentes respostas neurais, podem ser encontrados entre os animais anestesiados e acordado. Assim, os métodos que permitem a manipulação de sistemas sinápticas em animais acordados são necessários a fim de determinar a contribuição de entradas sinápticas neuronais de processamento afectada pelos anestésicos. Aqui, nós apresentamos metodologia para a construção de eléctrodos para gravar, simultaneamente, actividade neuronal extracelular e libertar várias substâncias neuroactivos na vizinhança dos locais de gravação em ratos despertos. Ao combinar estes procedimentos, foram realizadas injeções microiontophoretic de gabazine para bloquear seletivamente receptores GABA A em neurônios do colículo inferior de ratos conteve-cabeça. Gabazine modificado com sucesso as propriedades da resposta neural, tais como a área de resposta a frequência e adaptação específica do estímulo. Assim, demonstra-se que os nossos métodos são adequados para recording atividade de unidade única e para dissecar o papel dos receptores de neurotransmissores específicos no processamento auditivo. A principal limitação do processo descrito é o tempo de gravação relativamente curto (~ 3 h), o qual é determinado pelo nível de habituação do animal para as sessões de gravação. Por outro lado, várias sessões de gravação pode ser realizada no mesmo animal. A vantagem desta técnica em relação a outros procedimentos experimentais utilizados para manipular o nível da neurotransmissão ou neuromodulação (tais como injecções sistémicas ou a utilização de modelos optogenetic), é que o efeito do fármaco está confinada às entradas sinápticas locais para o neurónio alvo. Além disso, o costume-fabricação de eléctrodos permite o ajuste dos parâmetros específicos de acordo com a estrutura neural e tipo de neurónio de interesse (tais como a resistência de ponta para melhorar a relação sinal-ruído dos registos).

Registramos a atividade-única unidade de 4 neurônios bem isoladas do IC. As relações típicas de sinal-para-ruído obtidos durante gravações extracelulares em ratos despertos são mostrados na Figura 3B. A Figura 4A mostra a área da resposta de frequência (FRA) de cada neurónio, antes e durante o bloqueio do receptor GABA A receptores com gabazine. Observou-se um aumento na força da resposta (picos / estímulo), bem como um alargamento ...

Apresentamos métodos para a construção de eletrodos para registrar simultaneamente a atividade neural extracelular e liberar múltiplas substâncias neuroativas nas proximidades dos locais de registro em camundongos acordados. Esta técnica permite a análise detalhada de entradas sinápticas locais putativas para o neurônio de interesse.

Extracelular Gravação de Neuronal Atividade Combinado com Microiontophoretic aplicação de substâncias neuroativos em Ratos Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

O objetivo geral deste procedimento é manipular o impacto das entradas sinápticas no processamento neuronal por meio de injeções microiontoforéticas de substâncias neuroativas em animais acordados. Este método pode ajudar a desvendar funcionalidades-chave utilizando sistemas sensoriais, como o papel dos neurotransmissores e sua interação com estímulos sensoriais e codificação. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a manipulação de entradas sinápticas locais na célula e o estudo de sistemas modulatórios neuronais sem ser afetado pela anestesia.Embora este procedimento tenha sido realizado aqui com camundongos restritos, ele também pode ser usado em outros mamíferos, como morcegos, ratos ou porquinhos-da-índia. Para iniciar este procedimento, coloque os fios de tungstênio em uma ferramenta de alinhamento personalizada para corte. Fixe cuidadosamente as extremidades soltas dos fios com fita adesiva e corte-os no comprimento desejado.Em seguida, puxe suavemente a fita para remover os fios de tungstênio da ferramenta de alinhamento, certificando-se de que todos os fios permaneçam presos à fita. Depois, enrole a fita em um eixo de latão polido e segure os fios firmemente contra o eixo para garantir uma boa conexão elétrica.Em seguida, conecte o eixo a um motor de 5 RPM na estação de trabalho. O acesso ao eixo está inclinado em 45 graus em relação à superfície da solução de ataque. Posteriormente, imerja um terço dos fios na solução.Em seguida, imergir um eletrodo de bastão de carbono na solução de ataque para fechar o circuito. Ligar a estação de trabalho para que o eixo comece a girar, então ajustar a corrente que passa pelos eletrodos e pela solução de ataque para 250 miliampères. Interromper o ataque da ponta quando a corrente cair para 200 miliampères, a fim de esmerilhar as pontas dos fios em pontos muito finos.Agora, coloque um fio dentro de uma capilar de vidro borossilicato com sua extremidade inferior bloqueada com massa de modelar. Segure a pipeta usando uma bobina aquecedora e um êmbolo suspenso. Fixe o fio revestido de vidro a uma lâmina antes de colocá-lo sob o microscópio.Posicione a ponta e toque seu grânulo de ácido bórico para colocá-lo em foco. Em seguida, aqueça o grânulo até que ele derreta levemente. Depois disso, insira cerca de 10 a 15 mícrons da ponta do fio e desligue os potenciômetros de aquecimento.À medida que a esfera esfria, remova o vidro da ponta do eletrodo para expor o tungstênio. Para obter uma ponta com cerca de 15 milímetros, ajuste o polar aos parâmetros apropriados. Puxe a capilar para obter duas pipetas com a ponta isolada.Monte uma pipeta de pólo em uma lâmina usando massa de modelar e quebre sua ponta usando tesoura fina, pinça ou o lado plano de um bisturi. Ajuste ligeiramente o ângulo entre o eletrodo e o multi-bloco para obter uma melhor adesão e um conjunto mais fino. Sob o microscópio, alinhe cuidadosamente o eletrodo de tungstênio sobre a ponta do multi-bloco.Uma vez alinhado, abaixe o eletrodo até que entre em contato com o multi-bico. Encaixe-o no sulco entre os dois bicos superiores e, em seguida, deslize a ponta do eletrodo até que ela se projete de 15 a 20 micrômetros além da ponta do multi-bico. Agora, aplique uma pequena gota de adesivo curável por luz sobre o tungstênio e o conjunto do multi-bico, a cerca de 5 milímetros das suas pontas.Evite que a cola atinja as pontas para não obstruir os canais de múltiplos bicos e cure a cola usando uma lâmpada de LED de luz azul. Agora, coloque o animal anestesiado sobre uma manta aquecida para manter sua temperatura a 38 graus Celsius e estabilize a cabeça do animal em um estereotáxico com duas hastes auriculares e uma barra de mordida. Em seguida, aplique gel oftálmico para proteger os olhos. Depois, rape o couro cabeludo e aplique iodopovidona para desinfetar a pele. Com um bisturi, faça uma incisão ao longo da linha média para expor o crânio e retrair o periósteo que recobre os ossos parietais e a parte mais rostral dos ossos occipitais.Em seguida, aplique uma camada fina de adesivo curável por luz sobre o crânio e a base do pino craniano. Aguarde 10 segundos e posicione o pino sobre a região rostral dos ossos parietais ao longo da linha média. Utilize uma fonte de luz azul para curar o adesivo por 20 segundos, garantindo uma resistência eficaz da ligação.Posteriormente, faça dois furos ao redor e atrás da base do suporte craniano utilizando uma broca pequena. Coloque um parafuso de relógio em um furo feito para servir como ponto de contato adicional entre o crânio e o estágio craniano. Dê uma volta e meia para ajustar firmemente os parafusos e teste com uma pinça para garantir que não estejam soltos.Em seguida, insira a ponta do fio de prata do terra no terceiro orifício e certifique-se de que ele entre em contato com a dura-máter. Aplique uma pequena gota de cola resistente à água à base de cianoacrilato para fixar o fio ao crânio. Depois, aplique um compósito fotoativável para reforçar a ligação do pino craniano com o crânio, cobrindo a base do pino, a parte inferior do fio de prata e os parafusos.Tenha cuidado para não ultrapassar o lambda, a fim de permitir o acesso durante a gravação, e cure o compósito usando uma fonte de luz azul. Em seguida, retrai o músculo na parte posterior do pescoço próximo à sua inserção no crânio. Usando um trépano pequeno, faça uma janela redonda logo abaixo da sutura lambda e lateral à linha média para expor o colículo inferior.Neste procedimento, coloque o corpo do animal em um suporte acolchoado com espuma feito sob medida. Fixe o poste da cabeça em um suporte acoplado ao estereotáxico. Este é um bom momento para dar ao animal uma recompensa líquida.Em seguida, cubra o corpo do animal com um cobertor de algodão e prenda-o frouxamente usando um hemi-cilindro plástico e fita adesiva. Use uma seringa com ponta flexível para encher os barris com as drogas escolhidas. Com o micromanipulador, posicione o eletrodo multibarril em seu suporte.Em seguida, coloque um fio de prata não codificado dentro de cada cânula de modo que uma extremidade entre em contato com a solução e a outra extremidade fique acessível. Depois, conecte essas extremidades ao dispositivo de microiontoforese. Após isso, conecte o terminal positivo à extremidade do eletrodo de tungstênio e o terminal de terra ao fio de prata que entra em contato com a dura-máter.Posteriormente, mova o eletrodo de múltiplos canais até que a ponta entre em contato com a superfície do cérebro. Aplique solução salina estéril morna para prevenir a dessecação do tecido cerebral. Nesse momento, aplique uma corrente de retenção para evitar o vazamento de fármaco pela ponta do canal enquanto procura atividade de unidade única.Registre a atividade neural e a aplicação iontoforética de gabazina. É mostrada aqui a área de resposta em frequência de quatro neurônios registrados no colículo inferior antes e durante a injeção microiontoforética de gabazina. Os cruzes pretos indicam as frequências escolhidas para serem apresentadas como sons raros e repetitivos.Aqui estão os histogramas acumulados de tempo peri-estímulo da resposta neural a todas as frequências e intensidades apresentadas para construir a área de resposta antes e durante a injeção de gabazina. As barras pretas indicam a duração do som. Aqui estão os mapas pontilhados da resposta de disparos a um par de frequências apresentadas como estímulo raro em vermelho e estímulo repetitivo em azul antes e durante a aplicação de gabazina.O fundo sombreado indica a duração do estímulo. Esses mapas de pontos mostram as respostas quando as probabilidades relativas das parafrequências foram invertidas. Este gráfico mostra as respostas de um único neurônio a sete pares de frequências apresentadas como som raro e som repetitivo antes e durante a aplicação de gabazina.E este gráfico mostra os índices SSA da resposta neural a sons raros e repetitivos medidos antes e durante a aplicação de gabazina. Uma vez dominado, o procedimento descrito permite o ajuste dos parâmetros específicos de acordo com a estrutura neural e o tipo de neurônio de interesse. Ao tentar gravações com restrição da cabeça do animal, é fundamental lembrar que o tempo de gravação é determinado e limitado pelo nível de habituação do animal, mas uma vantagem importante é que múltiplas incisões de gravação podem ser realizadas no mesmo animal em vários dias, minimizando o número de animais utilizados.Ao realizar microiontoforese utilizando eletrodos tipo "piggy back", outros procedimentos, como injeções de transistores neurais, podem ser combinados para responder perguntas adicionais, como a origem das entradas e o alvo de projeção dos neurônios dentro do local de registro. Uma questão crítica ao trabalhar com animais acordados é o seu bem-estar; portanto, nunca exceda o tempo de recordação aprovado no seu protocolo e monitore constantemente a presença de qualquer sinal de desconforto. Caso isso ocorra, você deve interromper imediatamente o registro.

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Neuroscience

Neurociência

Caracterização eletrofisiológica das respostas neuronais é importante para compreender o funcionamento do cérebro e para orientar a colocação de corantes para caminho traçado. No entanto, muitos estudos são realizados em animais anestesiados. Para entender o funcionamento do cérebro sem anestesia, foi desenvolvido um método para registrar propriedades resposta neuronal e injetar corantes no rato acordado.

Preparação de um mouse Awake para gravar as respostas neurais e injetando Tracers

Este vídeo demonstra o estudo da atividade neuronal em uma região específica do cérebro do camundongo que processa estímulos auditivos. A técnica envolve a aplicação de um bloqueador de neurotransmissão inibitória e a comparação das respostas neuronais aos estímulos auditivos antes e depois da aplicação da droga na região cerebral localizada.

Investigando as respostas neuronais auditivas em um camundongo acordado na presença de um bloqueador de neurotransmissores inibitórios

Fonte: Moore, J. D., et al. Monitoramento justacelular e localização de neurônios únicos dentro de estruturas cerebrais subcorticais de ratos alertas e com a cabeça restrita. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o método de gravação e coloração justacelular em um rato contido e acordado. O procedimento envolve o registro de sinais de neurônios e a injeção de corante para localizar com precisão o local de gravação. Essa técnica permite o mapeamento preciso da atividade neural para a estrutura...

Gravação e coloração justacelular para mapeamento preciso da atividade neural em um rato acordado 

Fonte: Lai, J., et al. Registro eletrofisiológico simultâneo e microinjeções de agentes inibitórios no cérebro de roedores. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra uma técnica baseada em microinjeção para registro e inibição neuronal simultânea no colículo superior de ratos. O procedimento envolve direcionamento estereotáxico, perfuração do crânio e a inserção de um injetor, que fornece um neurotransmissor inibitório enquanto registra a atividade neuronal. A estimulação da luz evoca potenciais...

Inibição da atividade neuronal e sua detecção usando eletrofisiologia em um rato

Este protocolo descreve o projeto e a implantação cirúrgica de um mecanismo de restrição da cabeça para monitorar a atividade neuronal em estruturas cerebrais subcorticais em ratos alertas.  Ele delineia procedimentos para isolar neurônios individuais na configuração justacelular e identificar com eficiência suas localizações anatômicas.

Monitoramento Juxtacellular e Localização de solteiro Neurônios dentro Estruturas Cerebrais Sub-corticais de alerta, conteve-Cabeça Rats

Este método cria um ambiente tangível, familiar para o mouse para navegar e explorar durante o exame ou unicelulares microscópicos registros eletrofisiológicos, que exigem a fixação firme da cabeça do animal.

Plataforma Ar levantou Flat-pavimentado: Um Novo Método para Combinando Comportamento com Microscopia ou Eletrofisiologia em Awake Roedores movendo-se livremente

Neste estudo, a metodologia é apresentada sobre como realizar gravações eletrofisiológicas in vivo multi-site a partir da via hiperdiretiva sob anestesia com uretano.

Agudo<em&gt; In Vivo</em&gt; Gravações eletrofisiológicas de Potenciais de campo locais e atividade de múltiplas unidades a partir do caminho hiperdiretivo em ratos anestesiados

Este trabalho apresenta um método para executar uma optogenetic unidade única gravação confiável de um rato acordado usando um optrode de vidro sob medida.

Identificação de Optogenetics de um tipo Neuronal com um Optrode de vidro em ratos acordados

Aqui, descrevemos um protocolo combinando injeção de vírus adenoassociado com implante de janela craniana para obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

O protocolo descreve a metodologia de registro extracelular no córtex motor (CM) para revelar propriedades eletrofisiológicas extracelulares em camundongos conscientes em movimento livre, bem como a análise de dados de potenciais de campo local (LFPs) e picos, o que é útil para avaliar a atividade neural da rede subjacente aos comportamentos de interesse.

Gravação Extracelular Multicanal em Ratos em Movimento Livre

Um sistema de registro eletrencefalográfico de baixo custo combinado com uma bobina de tamanho milimétrico é proposto para conduzir a estimulação magnética transcraniana do cérebro de camundongos in vivo. Usando eletrodos de parafuso convencionais com um substrato multieletrodo personalizado, flexível e com arranjo de eletrodos, o registro multi-site pode ser realizado a partir do cérebro de camundongos em resposta à estimulação magnética transcraniana.

Sistema de Gravação Eletroencefalográfica de Baixo Custo Combinado com uma Bobina de Tamanho Milimétrico para Estimular Transcranialmente o Cérebro de Camundongos In Vivo

Aprenda a gravar atividade neuronal extracelular combinada com aplicação microiontoforética de substâncias neuroativas em ratos acordados. Este método permite manipular entradas sinápticas locais e estudar sistemas moduladores sem anestesia.

Extracelular Gravação de Neuronal Atividade Combinado com Microiontophoretic aplicação de substâncias neuroativos em Ratos Awake (Vídeo) | JoVE Journal

Extracelular Gravação de Neuronal Atividade Combinado com Microiontophoretic aplicação de substâncias neuroativos em Ratos Awake

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