Extracelular Gravação de Neuronal Atividade Combinado com Microiontophoretic aplicação de substâncias neuroativos em Ratos Awake

O objetivo geral deste procedimento é manipular o impacto das entradas sinápticas do processamento neuronal usando injeções microiontoforéticas de substâncias neuroativas em animais acordados. Este método pode ajudar a desvendar as principais funcionalidades usando sistemas sensoriais, como o papel dos neurotransmissores e sua interação em estímulos sensoriais e codificação. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a manipulação de entradas sináticas locais para a guia e o estudo de sistemas moduladores neuronais sem ser afetado pela anestesia.

Embora este filho pródigo estivesse aqui em camundongos contidos, ele também pode ser usado em outros mamíferos, como morcegos, ratos ou porquinhos-da-índia. Para iniciar este procedimento, coloque os fios de tungstênio em uma ferramenta de alinhamento personalizada para cortar. Prenda cuidadosamente as pontas soltas dos fios com fita adesiva e corte-as no comprimento desejado.

Em seguida, puxe a fita suavemente para remover os fios de tungstênio da ferramenta de alinhamento. Certifique-se de que todos os fios permaneçam presos à fita. Em seguida, enrole a fita em um fuso de latão polido e segure os fios firmemente contra o fuso para que haja uma boa conexão elétrica.

Depois disso, conecte o fuso a um motor de 5 RPM na estação de trabalho. O acesso do fuso é inclinado 45 graus em relação à superfície da solução de gravação. Em seguida, mergulhe um terço dos fios na solução.

Em seguida, mergulhe um eletrodo de haste de carbono no banho de gravação para fechar o circuito. Ligue a estação de trabalho para que o fuso comece a girar e, em seguida, ajuste a corrente que passa pelos eletrodos e pela solução de condicionamento físico para 250 miliamperes. Pare a gravação da ponta quando a corrente cair para 200 miliamperes para gravar as pontas dos fios em pontos muito finos.

Agora, coloque um fio em um capilar de vidro borossilicato com sua extremidade inferior bloqueada com massa de modelar. Segure a pipeta usando uma serpentina de aquecimento e um êmbolo suspenso. Prenda o fio coberto de vidro a uma lâmina antes de colocá-lo sob o microscópio.

Defina a ponta e toque o cordão bórico em foco. Em seguida, aqueça a conta até derreter ligeiramente. Depois disso, insira cerca de 10 a 15 mícrons da ponta do fio e desligue os potenciômetros de aquecimento.

À medida que o cordão esfria, remova o vidro da ponta do eletrodo para expor o tungstênio. Para obter uma ponta de cerca de 15 milímetros, defina o polar para os parâmetros apropriados. Puxe o capilar para obter duas pipetas com a ponta isolada.

Monte uma pipeta de vara em uma lâmina usando massa de modelar e quebre sua ponta usando uma tesoura fina, fórceps ou o lado plano de um bisturi. Ajuste ligeiramente o ângulo entre o eletrodo e o multi-barril para obter uma melhor ligação e um conjunto mais fino. Sob o microscópio, alinhe cuidadosamente o eletrodo de tungstênio sobre a ponta do barril múltiplo.

Uma vez alinhado, abaixe o eletrodo até que ele entre em contato com o multi-barril. Encaixando a ranhura entre os dois barris superiores, deslize a ponta do eletrodo até que ele se projete de 15 a 20 micrômetros da ponta do barril múltiplo. Agora aplique uma pequena gota de adesivo fotopolimerizável no tungstênio e no conjunto de vários cilindros a cerca de 5 milímetros de distância de suas pontas.

Evite que a cola atinja as pontas para evitar o bloqueio dos canais de vários barris e cure a cola usando uma lâmpada LED de luz azul Agora, coloque o animal anestesiado em um cobertor de aquecimento para manter sua temperatura em 38 graus Celsius e estabilize a cabeça do animal em uma estrutura estereotáxica com duas barras de ouvido e uma barra de mordida Em seguida, aplique gel oftálmico para proteger os olhos. Em seguida, raspe o couro cabeludo e aplique iodopovidona para desinfetar a pele. Usando um bisturi, faça uma incisão ao longo da linha média para expor o crânio e retrair o perastium que cobre a parte peridal e a parte mais rostral dos ossos occipitais.

Em seguida, aplique uma fina camada de adesivo fotopolimerizável no crânio e na base do poste da cabeça. Aguarde 10 segundos e coloque o poste da cabeça sobre a área rostral dos ossos parietais ao longo da linha média. Use uma fonte de luz azul para curar o adesivo por 20 segundos para uma força de ligação eficaz.

Em seguida, faça dois furos ao redor e atrás da base do poste da cabeça usando uma pequena broca. Coloque um parafuso de relógio em um orifício perfurado para servir como um ponto de contato adicional entre o crânio e o estágio da cabeça. Faça uma volta e meia para encaixar os parafusos e teste com uma pinça para garantir que não estejam soltos.

Em seguida, insira a ponta do fio terra prateado no terceiro orifício e certifique-se de que ele entre em contato com a dura-máter. Aplique uma pequena gota de cola de cianoacrilato resistente à água para prender o fio ao crânio. Em seguida, aplique compósito fotopolimerizável para reforçar a ligação do poste da cabeça com o crânio, cobrindo a base do poste da cabeça, a parte inferior do fio de prata e os parafusos.

Tenha cuidado para não se estender além do lambda para permitir o acesso durante a gravação e curar o composto usando uma fonte de luz azul. Em seguida, retraia o músculo na parte de trás do pescoço perto de sua inserção no crânio. Usando uma pequena trefina, perfure uma janela redonda logo abaixo da sutura lambda e lateral à linha média para expor o colículo inferior.

Neste procedimento, coloque o corpo do animal em um sistema de contenção almofadado de espuma feito sob medida. Prenda o espigão de cabeça a um suporte preso à estrutura estereotáxica. Este é um bom momento para dar ao animal uma recompensa líquida.

Em seguida, cubra o corpo do animal com um cobertor de algodão e prenda-o frouxamente com um hemicilindro de plástico e fita adesiva. Use uma seringa com ponta flexível para encher os barris com os medicamentos escolhidos. Usando o micromanipulador, coloque o eletrodo multi-barril em seu suporte.

Em seguida, coloque um fio de prata não codificado dentro de cada barril para que uma extremidade entre em contato com a solução e a outra extremidade fique acessível. Em seguida, conecte essas extremidades ao dispositivo de microiontoforese. Depois disso, conecte o terminal positivo à extremidade do eletrodo de tungstênio e o terminal de aterramento ao fio prateado que entra em contato com a dura-máter.

Em seguida, mova o eletrodo multi-barril até que a ponta entre em contato com a superfície do cérebro. Aplique solução salina estéril quente para evitar a dessecação do tecido cerebral. Nesse ponto, aplique corrente de retenção para evitar vazamento de drogas da ponta do cano enquanto procura por atividade de unidade única.

Registre a atividade neural e a aplicação iontoforética de gabazina. Aqui é mostrada a área de resposta de frequência de quatro neurônios registrados no colículo inferior antes e durante a injeção microiontoforética de gabazina. As cruzes pretas indicam que as frequências escolhidas para serem apresentadas como sons raros e repetitivos.

Aqui estão os histogramas de tempo peristimular acumulados da resposta neural a todas as frequências e intensidades apresentadas para construir a área de resposta antes e durante a injeção de gabazina. As barras pretas indicam a duração do som. Aqui estão os rasters de pontos da resposta de pico a um par de frequências apresentadas como raras em vermelho e estímulos repetitivos em azul antes e durante a aplicação de gabazina.

O fundo sombreado indica a duração do estímulo. Esses rasters de pontos mostram as respostas quando as probabilidades relativas das parafrequências foram trocadas. Este gráfico mostra as respostas de um único neurônio a sete pares de frequências apresentadas como o som raro e repetitivo antes e durante a aplicação da gabazina.

E este gráfico mostra os índices SSA da resposta neural a sons raros e repetitivos medidos antes e durante a aplicação da gabazina. Uma vez dominado, o procedimento descrito permite o ajuste dos parâmetros específicos de acordo com a estrutura neural e o tipo de neurônio de interesse. Ao tentar gravações de animais com contenção de cabeça, é fundamental lembrar que os tempos de gravação são determinados e limitados pelo nível de habituação do animal, mas uma vantagem importante é que várias incisões de registro podem ser realizadas no mesmo animal por vários dias, minimizando o número de animais usados.

Ao realizar microiontoforéticos usando eletrodos piggy back, outros procedimentos, como injeções de transistores neurais, podem ser combinados para responder a perguntas adicionais, como a fonte de entradas e o alvo de projeção dos neurônios no local de gravação. Uma questão crítica ao trabalhar com os animais acordados é o seu bem-estar, portanto, nunca exceda a quantidade de tempo de recordação aprovado em seu protocolo e monitore constantemente para verificar qualquer sinal de desconforto. Nesse caso, você deve interromper a gravação imediatamente.