Name: Um método para alvejar e Isolar Airway-inervação neurônios sensoriais em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Aprenda a rotular e isolar neurônios nodosos que inervam as vias aéreas em ratos usando Fast Blue e dissociação de gânglios. Este método robusto permite análise de expressão gênica em neurobiologia periférica.

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Financiado pelo NIH conceder R01HL105635 a SEJ. Os autores gostariam de agradecer a Diego V. Bohórquez para aconselhamento técnico. Agradecemos também R. Ian Cumming para a assistência técnica e realização da citometria de fluxo no Centro de Duke vacina humana Instituto de Pesquisa Citometria de Fluxo de recursos partilhados (Durham, NC). A citometria de fluxo foi realizada no Laboratório de biocontenção Regional na Duke que recebeu o apoio parcial para a construção dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (UC6-AI058607).

Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Duke. 1. Administração Intranasal de Fast Blue Para Fast Blue, administrar o corante, pelo menos, 2 dias antes da eutanásia o mouse. O corante vai persistir por até oito semanas. <ol><li> Anestesiar o rato com anestesia inalatória leve (2,5% sevoflurano) até que começa a respiração lenta. </li><li> Usar uma pipeta de 200 uL com pontas filtrados para instilar-se lentamente 40 ml de solução de corante (0,4 mM Fast Blue, 1% de sulfóxido de dimetilo, solução salina de DMSO, em tampão fosfato, PBS) na narina, parando periodicamente para assegurar o rato é aspiração da solução (Figura 1A). </li><li> Segure o mouse vertical, cabeça para cima e massageie suavemente no peito para garantir o corante se espalha por todo o pulmão. </li></ol> 2. Preparações sobre Dissecção e Dia Análise <ol><li> Preparar 10 ml0; Ganglia dissociação Solução (GADs) por combinação dos ingredientes tal como especificado no Quadro 1. </li><li> Realizar a extracção de ARN em uma área de laboratório dedicado. Antes de começar a experiência, limpar as superfícies com 70% de etanol, 10% de água sanitária, e reagente de descontaminação RNase. Isto inclui a centrifugação de ARN, quaisquer suportes de tubos, e as pipetas. Garantir que não dedicados ponta caixas de filtro para uso apenas RNA. Não utilize este equipamento e área para preparação de ADN, como isso vai contaminar as amostras. </li><li> Mistura fresca de 70% e 80% de etanol com água livre de RNase. Prepare 1 ml para cada amostra a ser usado na extracção de ARN. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> Avançada DMEM / F12 </td><td> 9,5 ml </td></tr><tr><td> glutamina </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> HEPES (10 mM) </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> suplemento N2 </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> B27 (sem vitamina A) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> NGF (50 ug / ml) </td><td> 10 ul </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Mistura Reagente para Ganglia dissociação Solution (gads). 3. Dissecção Procedimento <ol><li> Encher tubos de 1,5 ml com 500 ul GADs, uma para cada amostra experimental, um como contraprova positiva de triagem, e uma para um controlo negativo de triagem. tubos de loja no gelo durante todo dissecção. </li><li> Dissecar o gânglio nodoso e fazer dois cortes parciais para facilitar a dissociação, em seguida, colocá-lo no tubo de ensaio experimental. Por favor, consulte o seguinte protocolo JoVE para dissecção dos gânglios nodosos 16 e DRG 17. </li><li> Dissecar e parcialmente em corte gânglios não marcado, tais como gânglio da raiz dorsal (DRG), para os controlos de triagem. Use dois gânglios para o controlo positivo e dois Ganglium para o controlo negativo. </li><li> Para obter neurónios nodosos suficientes para classificar bem sucedida, combinar gânglios a partir de 5 ratos em um tubo de amostra experimental contendo GADs. </li></ol> 4. Sensorial Ganglia dissociação <ol><li> Pipeta 500 GADs ul, deixando gânglios no tubo. Lave gânglios uma vez, adicionando 1 ml PBS, aguarde gânglios para assentar no fundo do tubo, então pipeta PBS. </li><li> Adicionar 1 ml GADs e 22 ul da enzima de digestão de colagenase (I / II e mistura de protease, 2,5 mg / ml em H2O) a cada tubo. </li><li> Adicionar 20 ul azuis Rápido (5,26 mm) para o tubo de controlo positivo. </li><li> Colocar os tubos num banho de água ou bloco de aquecimento já fixada em 37 ° C. Nota: O tempo de digestão gânglios depende da idade da enzima de digestão. No espaço de 1 mês de dissolução do enzima de digestão, digestão durante 30 min, a 2 - 6 meses digerir durante 45 min. Se a enzima é mais de 6 meses de idade, digerir gânglios fou 60 min. </li><li> A cada 15 minutos tubos de agitar brevemente e agite-los para assegurar gânglios são cobertos pela solução. </li><li> Enquanto estão a ser digerido gânglios, preparar gradientes de densidade, utilizando uma solução de partículas (partículas de sílica coloidal revestida com polivinilpirrolidona). <ol><li> Misturar a solução de partículas% 12 em GADs, 500 ul por amostra. </li><li> Misturar a solução de partículas% 28 em GADs, 500 ul por amostra. </li><li> Lentamente e cuidadosamente adicionar solução densidade de 400 ul de 12% na parte superior da solução densidade de 400 ul de 28% em um tubo de 1,5 ml fresco para cada amostra. Não permita que as duas camadas para misturar. Duas camadas distintas deve ser visível no tubo; uma mais escura que a outra. </li></ol></li><li> Enquanto gânglios estão sendo digerida, rotular novos tubos de 1,5 ml de coleta para ordenar (um tubo rápido Azul positivo e um rápido Azul negativo por amostra de classificação). Dependendo dos requisitos da instalação de triagem, estes tubos devem ter tampas amovíveis de modo a não interferirE com o classificador de células. </li><li> Após o tempo de digestão adequada, remova GADs com enzima de digestão e lavar gânglios duas vezes com 1 ml PBS. Adicionar 200 ul de GADs fresco a cada tubo. </li><li> Usar uma pipeta de 200 mL, definido como volume de 100 mL, e gânglios pipeta cima e para baixo várias vezes para separar as células. Repita até que nenhum pedaço intacto do tecido é visto. Evitar a criação de bolhas na solução. </li><li> Passa células dissociadas através de um filtro celular de 70 uM. </li><li> Adicionar mais 100 GADs ul ao tubo de dissociação original para pegar todas as células perdidas restantes esquerda e passar a solução adicional através do filtro de células. Utilizando uma nova ponta de pipeta, recolher qualquer líquido contendo células remanescente que passou através do filtro e agarrou-se à malha. O volume final de células suspensas em GADs é 300 ul. </li><li> camada cuidadosamente os 300 ul de células no topo do gradiente de densidade previamente feita. Evitar bolhas e mistura de cells com as camadas de densidade. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 2900 xg à temperatura ambiente. </li><li> Enquanto as células são na centrífuga, mistura de tampão de lise (1 ml por amostra experimental) como se segue: 10 ul de 2-mercaptoetanol em 1 ml de tampão de RLT (estojo de extracção de ARN). <ol><li> Adicionar 300 mL de tampão de lise de tubo de coleta positiva Azul Rápido e 600 mL ao tubo rápido Azul negativo de coleta (tubos rotulados a partir do passo 4.7). Esse volume depende do número de células que se espera serem recolhidos. Para &lt;2000 células, adicionar 300 ul, durante&gt; 7.000 células adicionar 600 ul. Isto irá assegurar que o fluido de revestimento de classificação não dilui significativamente o tampão de lise. </li></ol></li><li> Uma vez que a centrifugação estiver concluída, remova cuidadosamente e elimine a camada ul top 700. Esta camada contém a maioria dos resíduos celulares que de outra forma interfira com a separação de células. </li><li> Adicionar 700 ul GADs frescos para a célula restante contendo solução e pipetate para cima e para baixo várias vezes para misturar. </li><li> Centrifugar durante 15 minutos a 2900 xg para sedimentar as células. </li><li> Enquanto as células são na centrífuga, misturar triagem GADs (500 ul por amostra) pela adição de 5 ul de ADNase (10 mg / ml) até 1 ml GADs. </li><li> Depois de centrifugação é feito, cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante, deixando o sedimento celular. </li><li> Re-suspender pellet celular em 200 - 300 ml de classificação GADs pipetando cima e para baixo com uma pipeta de 1000 mL ajustado para 200 mL várias vezes. Coloque as amostras em gelo. As células são agora pronto para ser classificado. </li></ol> 5. fluorescência celular ativado (FAC) Classificando Nota: Esta seção requer conhecimento operacional de um classificador FACS ou a assistência de pessoal qualificado. <ol><li> Adicionar uma solução de estoque ul iodeto de propídio (PI) (50 ug / ml) para cada amostra a testar para a viabilidade celular. Divisão de controle negativo em 2 tubos, um com PI e um sem. PI se liga ao ADN apenas em células mortas. E seapós os primeiros tipos não há células mortas, para rotular, não é necessário o uso de PI. </li><li> Células de transporte para citometria de fluxo instrumento, por exemplo., BD FACS AriaII executando o software Diva 8, em gelo. </li><li> Uma vez que o tamanho da célula é variável nesta população, usar um grande bocal (100 uM) para a classificação. Para diminuir a quantidade de tensão da experiência as células e aumentar a viabilidade celular utilizar baixa pressão (20 psi). </li><li> Use o software classificador FACS para configurar as parcelas de análise, de dispersão para a frente, dispersão lateral (SSC), Blue rápido e PI, se necessário. </li><li> Para as células re-suspender, gentilmente vortex brevemente a amostra antes de o colocar na classificador. </li><li> Comece com o controlo negativo, nenhum Fast Blue ou IP, para definir o limite de portão (Figura 2A). Isto vai determinar a quantidade de autofluorescência na população de células. Opcional: Executar a amostra negativa com PI para identificar se existe uma população de células mortas. </li><li> Classificar a amostra de controlo positivo (incubated com Fast Blue), para definir os parâmetros de compensação. </li><li> Uma vez que os portões e parâmetros são definidos, começam a triagem das amostras experimentais. As amostras são classificadas dentro dos tubos de coleta de preparados contendo tampão RNA lise. </li><li> Manter as amostras classificadas em gelo até que a separação de células é completa. </li><li> Comece a etapa de extração de RNA imediatamente após as células são classificadas. </li></ol> 6. Extracção de ARN <ol><li> Vortex células classificadas em tampão de lise durante 1 min para homogeneizar. </li><li> Adicionar 1 volume de etanol a 70% e misture pipetando cima e para baixo várias vezes. </li><li> Transferir para 700 ul da amostra a uma coluna de centrifugação. Centrifugar durante 15 segundos a 8000 x g. Descartar o fluxo de passagem. <ol><li> Repetir até que o volume total da amostra é passada através da coluna de centrifugação. </li></ol></li><li> Adicionar 350 ul de tampão de RW1 e continuar o processo de purificação de ARN, incluindo o passo de tratamento com ADNase, de acordo com Protoco do fabricantel para as células. </li><li> Uma vez que o RNA foi extraído, testar a qualidade de ARN utilizando um sistema de electroforese de microfluidos de acordo com as especificações do fabricante. </li></ol>

<ol><li>Manteniotis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+RNA-Seq+Expression+Analysis+of+Sensory+Ganglia+with+a+Focus+on+Ion+Channels+and+GPCRs+in+Trigeminal+Ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia.</a> PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).</li>
<li>Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+mRNA+expression+analysis+of+TRP+channel+genes+at+the+single+trigeminal+and+dorsal+root+ganglion+level+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse.</a> BMC Neurosci. 14 (1), 21(2013).</li>
<li>Paintal, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagal+sensory+receptors+and+their+reflex+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Vagal sensory receptors and their reflex effects.</a> Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).</li>
<li>Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+tracing+shows+that+CGRP-immunoreactive+nerves+of+rat+trachea+and+lung+originate+from+vagal+and+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Auton+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia.</a> J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).</li>
<li>Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interganglionic+segregation+of+distinct+vagal+afferent+fibre+phenotypes+in+guinea-pig+airways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways.</a> J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).</li>
<li>Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+transient+receptor+potential+channels+and+two-pore+potassium+channels+in+subtypes+of+vagal+afferent+neurons+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).</li>
<li>Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurochemistry+of+the+nodose+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neurochemistry of the nodose ganglion.</a> Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).</li>
<li>Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagal+Sensory+Neuron+Subtypes+that+Differentially+Control+Breathing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing.</a> Cell. 161, 1-12 (2015).</li>
<li>Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodose+ganglia-modulatory+effects+on+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Res%22%5BJournal%5D)">Nodose ganglia-modulatory effects on respiration.</a> Physiol Res. 62, 227-235 (2013).</li>
<li>Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+pulmonary+oxidative+stress+by+lung+vagal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents.</a> Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).</li>
<li>Bautista, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA1+mediates+the+inflammatory+actions+of+environmental+irritants+and+proalgesic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents.</a> Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).</li>
<li>Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+survival+of+vagal+and+glossopharyngeal+sensory+neurons+is+dependent+upon+dystonin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin.</a> Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).</li>
<li>Hondoh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+expression+of+cold+receptors+%28TRPM8+and+TRPA1%29+in+the+rat+nodose-petrosal+ganglion+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex.</a> Brain Res. 1319, 60-69 (2010).</li>
<li>Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensory+and+sympathetic+innervation+of+guinea-pig+lung+and+trachea+as+studied+by+retrograde+neuronal+tracing+and+double-labelling+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry.</a> Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).</li>
<li>Choi, D., Li, D., Raisman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+retrograde+neuronal+tracers+that+label+the+rat+facial+nucleus%3A+A+comparison+of+Fast+Blue%2C+Fluoro-ruby%2C+Fluoro-emerald%2C+Fluoro-Gold+and+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI.</a> J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).</li>
<li>Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+of+Nodose+Ganglia+Injection+in+Sprague-Dawley+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat.</a> J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).</li>
<li>Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+specific+sensory+neuron+populations+for+study+of+expressed+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels.</a> J Vis Exp. (82), e50782(2013).</li>
<li>Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM8+function+and+expression+in+vagal+sensory+neurons+and+afferent+nerves+innervating+guinea+pig+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+-+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus.</a> Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).</li>
<li>Kwong, K., Lee, L. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGE%282%29+sensitizes+cultured+pulmonary+vagal+sensory+neurons+to+chemical+and+electrical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli.</a> J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).</li>
<li>Joachim, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+induces+substance+P+in+vagal+sensory+neurons+innervating+the+mouse+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Allergy%22%5BJournal%5D)">Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways.</a> Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).</li>
<li>Kaan, T. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+blockade+of+P2X3+and+P2X2%2F3+receptors+attenuates+bone+cancer+pain+behaviour+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats.</a> Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).</li>
<li>Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helt+determines+GABAergic+over+glutamatergic+neuronal+fate+by+repressing+Ngn+genes+in+the+developing+mesencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon.</a> Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).</li>
<li>Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-array+profiling+of+striatal+projection+neuron+subtypes+in+juvenile+and+adult+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains.</a> Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).</li>
<li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve um método para alvejar neurónios das vias aéreas-inervação nos gânglios nodosos do nervo vago. Uma vez marcado, os gânglios são suavemente dissociados para otimizar a preservar o número de células e viabilidade. Estes neurónios são, então, classificados FAC directamente em tampão de lise e o ARN é extraído. A importância deste protocolo é a capacidade de segmentar, isolar e preservar a qualidade de uma população de células sensorial específica. A expressão de genes é descrito nesta pequena popula...

nervos Somatosensoriais transduzir estímulos nocivos causados ​​por ambos os agentes endógenos e ambientais térmica, mecânica, química, e. Os corpos celulares destes nervos aferentes estão localizados em gânglios sensoriais, tais como a raiz dorsal, trigeminal, ou gânglios nodosos. Cada gânglio sensorial inerva regiões específicas do corpo e contém células que inervam órgãos e tecidos separadas dentro dessa região. Por exemplo, os gânglios da raiz dorsal (DRG) são localizados na coluna vertebral e extensão dos processos ao longo do corpo e membros, enquanto que o gânglio trigeminal estão localizados no crânio, contendo neurónios que inervam a face, olhos, meninges ou das vias aéreas superiores 1, 2. A gânglios nodosos do nervo vago está localizado no gargalo abaixo do crânio e contém corpos celulares que se estendem fibras nervosas ao longo do tracto gastrointestinal, no coração e pulmões e vias aéreas inferiores 3. Nos seres humanos o gânglio nodoso está sozinho, no entanto, no ratinho é fundidacom o gânglio jugular, que também inerva os pulmões 4. Este gânglio fundido é muitas vezes chamado a jugular / nodose complexa, gânglio vagal, ou simplesmente nodose gânglio 5. Aqui, é referido como o gânglio nodoso. fibras aferentes do nodosos passar informações de vísceras para o núcleo do tracto solitário (NTS) no tronco cerebral. Entrada sensorial para esta gânglio único controla um conjunto diversificado de funções, tais como a motilidade intestinal 6, 7 da frequência cardíaca, a respiração 8,9, e as respostas respiratórias activado-irritantes 10,11. Com esta diversidade de funções e órgãos inervados, é crítico para alvejar e isolar subpopulações específicas de órgãos do gânglio nodoso, a fim de estudar vias neuronais individuais. No entanto, dado o pequeno tamanho do nodosos e ao limitado número de neurónios que contém esta não é uma tarefa trivial. Cada rato nodose gânglio contém cerca de 5.000 neurônios 12em adição a uma grande população de células de suporte satélite. Dos 5.000 neurónios nodosos, apenas 3 - 5% inervam as vias aéreas. Portanto, quaisquer alterações funcionais, morfológicos ou moleculares dentro dos neurônios das vias aéreas-inervação, devido a estimulação respiratória ou patologias, serão perdidos no gânglio nodoso densamente. Para resolver este problema, foi desenvolvido um método para identificar e isolar neurónios que inervam as vias aéreas. As vias aéreas foram expostos a um corante marcador fluorescente para identificar os neurónios nodosos inervação subsequentes. Azul rápida foi apanhada por neurônios e viaja rapidamente para seus corpos celulares, onde é retido por até oito semanas 13 - 15. Uma vez identificados, um protocolo de dissociação suave, mas eficiente foi usado para preservar rotulagem corante e viabilidade celular para celular ativado fluorescente (FAC) de classificação. As células seleccionadas são usadas para extrair o ácido ribonucleico de alta qualidade (ARN) para determinar a expressão do gene ou fou outra análise molecular a jusante. Este protocolo proporciona uma técnica útil e robusto para isolar neurónios sensoriais que inervam um tecido de interesse.

<table><tbody><tr><td>Policiências Azul Rápida</td><td>, Inc.</td><td>17740-2</td><td>estoque 2 mg/ml em água</td></tr><tr><td>NeuroTrace 530/615 mancha vermelha de Nissle</td><td>Life Technologies</td><td>N21482</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca e Mg livre</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>glutamina ( Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 (sem vitamina A)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Nervoso (NGF)</td><td>Sigma</td><td>N6009</td><td>estoque 50 &micro; g/ml em enzima de digestão PBS/10% FBS</td></tr><tr><td>, Liberase DH Grau de Pesquisa</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td>estoque 2,5 mg/ml em</td></tr><tr><td>solução de partícula de água (Percoll)</td><td>Sigma</td><td>P1644-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de aquecimento</td><td>LabNet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; filtro de células m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>RNase free water</td> Reagente de descontaminação <td>Fisher Scientific</td><td>BP2484-100</td><td></td></tr><tr><td>RNase, RNase AWAY</td><td>invitrogen</td><td>10328-011</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>VWR</td><td>EM-6010</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de RNA, RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>Kit DNase, Conjunto DNase Livre de RNase</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td>estoque 10 mg/ml em 0.15 M NaCl</td></tr><tr><td>Propidium Iodide Iodide</td><td>Sigma</td><td>P4170-10MG</td><td>estoque 10 &micro; g/ml no</td></tr><tr><td>sistema de eletroforese microfluídica PBS (TapeStation 2200)</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um método para alvejar e isolar airway-inervação neurônios sensoriais em ratos

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

nervos Somatosensoriais transduzir estímulos nocivos causados ​​por ambos os agentes endógenos e ambientais térmica, mecânica, química, e. Os corpos celulares destes neurónios aferentes estão localizados dentro do gânglio sensorial. gânglios sensoriais que inervam um órgão específico ou porção do corpo. Por exemplo, o gânglio da raiz dorsal (DRG) são localizados na coluna vertebral e extensão dos processos ao longo do corpo e membros. O gânglio trigeminal estão localizados no crânio e inervam a face, e das vias aéreas superiores. aferentes vagais dos gânglios nodosos se estender por todo o intestino, coração e pulmões. Os neurónios nodosos controlar um conjunto diversificado de funções, tais como: freqüência respiratória, irritação das vias aéreas, e reflexo de tosse. Assim, entender e manipular a sua função, é crítica para identificar e isolar sub-populações neuronais específicas das vias aéreas. No rato, as vias aéreas estão expostas a um corante marcador fluorescente, azul rápido, para rastreamento retrógrado de neurônio nodose específica das vias aéreass. Os gânglios nodosos são dissociados e de células activadas por fluorescência (FAC) de classificação é usado para coletar células positivas de corante. Em seguida, o ácido ribonucleico, de alta qualidade (ARN) é extraído a partir de células positivas de corante para a próxima geração de sequenciação. Usando este método de expressão do gene de vias aéreas neuronal específica é determinada.

Usando este método, os neurónios da via aérea-inervação são rotulados por via intranasal incutir Fast Blue (Figura 1A). Após dois dias, as células marcadas azul depressa aparecem nos gânglios nodosos (Figura 1C). Essas células formam 3-5% da população neuronal total do gânglios nodosos. Outros corantes retrógrada, que têm sido utilizados para este fim incluem DiI (1,1&#39;-dioctadecil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-perclorato tetramethylindocarbocyanine) e Fluorogo...

Neurônios sensoriais específicos de órgãos são difíceis de identificar. O rastreamento Fast Blue é usado para identificar neurônios nodose que inervam as vias aéreas para classificação celular. Os neurônios nodose classificados são usados para extrair ácido ribonucleico (RNA) de alta qualidade para sequenciamento. Usando este protocolo, a expressão gênica de neurônios específicos das vias aéreas é determinada.

Um método para alvejar e Isolar Airway-inervação neurônios sensoriais em Ratos

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

O objetivo geral deste experimento é rotular e isolar os neurônios nodosos do nervo vago que inervam as vias aéreas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de Neurobiologia Periférica. Por exemplo, quais propriedades identificadoras possuem os neurônios que inervam as vias aéreas?A principal vantagem desta técnica é que ela fornece um método robusto e de alto rendimento para direcionar e isolar populações neuronais específicas. Após coletar os gânglios sensoriais, aspire 500 microlitros da solução de dissociação de gânglios de cada tubo, sem perturbar os gânglios. Em seguida, adicione um mililitro de PBS a cada amostra e aguarde os gânglios sedimentarem no fundo dos tubos.Em seguida, remova o PBS e adicione um mililitro de solução de dissociação de gânglios suplementada com enzima de digestão aos neurônios, seguido pela adição de 20 microlitros de Azul Rápido ao tubo controle positivo. Incube os tubos a 37 graus Celsius pelo tempo apropriado conforme a idade da enzima de digestão. Agite e bata levemente nos tubos brevemente a cada 15 minutos, para garantir que os gânglios estejam cobertos pela solução de digestão.Enquanto as células nervosas estão sendo

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Medidas repetidas de fisiologia respiratória dos roedores e amostragem de células inflamatórias nas vias aéreas são desejáveis, mas geralmente não é viável. Aqui nós descrevemos um método repetitivo para entubar camundongos por via oral, que permite medições repetidas de hiper-reatividade das vias aéreas e amostragem de células inflamatória das vias aéreas.

A reversível, método não-invasivo para medições de Resistência das Vias Aéreas e Amostragem Líquido da Lavagem Broncoalveolar em Ratos

Descrevemos os procedimentos para a administração repetida de inibidores da sinalização muscarínicos ao longus levantador auris (LAL) muscular de ratos adultos jovens e para a imunocoloração subseqüente de sua junções neuromusculares (NMJs) em wholemounts. O músculo LAL tem vantagens exclusivas para...

A administração subcutânea de antagonistas muscarínicos e Triple-A imunocoloração do músculo Longus Levator Auris em Ratos

Este vídeo demonstra o isolamento de células dos gânglios sensoriais de camundongos. Os gânglios são submetidos à digestão enzimática para dissolver a matriz extracelular. As células individuais são então coletadas por meio de filtragem através de um filtro de células, seguido de centrifugação com gradiente de densidade para remoção de detritos. Por fim, são feitas lavagens e centrifugações para coletar as células isoladas para análise futura.

Isolamento de células de gânglios sensoriais

Este vídeo demonstra o registro eletrofisiológico de neurônios sensoriais olfativos (OSNs) em camundongos usando uma técnica de patch-clamp perfurada. O epitélio olfatório, contendo OSNs com receptores de odor marcados com fluoróforo, é isolado de um camundongo e preso em uma câmara de registro. Uma pipeta de registro é presa ao botão dendrítico de um OSN, e a nistatina dentro da pipeta perfura a membrana para formar conectividade elétrica com a célula. Finalmente, outra pipeta é usada para...

Registro perfurado de neurônios sensoriais olfativos em camundongos

Nós desenvolvemos um método simples, confiável e relativamente barata para a intubação traqueal em ratos através de laringoscopia direta utilizando um otoscópio com um espéculo 2,0 mm. Esta técnica é não traumático e pode ser usado para as medições repetidas em experiências crónicas. Achamos superior à traqueostomia ou relatado anteriormente técnicas não cirúrgicas.

Entubação endotraqueal em Ratos<em&gt; Via</em&gt; Laringoscopia direta Usando um otoscópio

Apresentamos um protocolo cirúrgico detalhando como realizar uma axotomia de corte ou esmagamento no nervo facial do camundongo. A axotomia do nervo facial pode ser empregada para estudar a resposta fisiológica à lesão nervosa e testar técnicas terapêuticas.

Axotomia do nervo facial em ratos: um modelo para estudo de resposta motoneuron para Injury

A análise das propriedades fisiológicas dos neurônios sensoriais olfativos ainda enfrenta limitações técnicas. Aqui, nós os registramos por meio de patch-clamp perfurado em uma preparação intacta do epitélio olfatório em camundongos direcionados ao gene. Esta técnica permite a caracterização das propriedades da membrana e respostas a ligantes específicos de neurônios que expressam receptores olfativos definidos.

Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados

O objetivo deste artigo é descrever um método refinado de intubação do rato de laboratório. O método é não invasivo e, portanto, ideal para estudos que requerem monitoramento serial da função respiratória e/ou instilação de tratamentos no pulmão.

Intubação Orotraqueal Repetida em Camundongos

Este manuscrito apresenta um protocolo para remoção cirúrgica dos neurônios simpáticos lombares pós-ganglionares de um camundongo. Este procedimento facilitará uma infinidade de estudos destinados a investigar o papel da inervação simpática em alvos de tecido distais.

Simpatectomia Lombar Cirúrgica em Camundongos

Este estudo apresenta uma manipulação cirúrgica para expor o T-DRG em camundongos anestesiados para imagens de cálcio in vivo , juntamente com registros de ECG síncronos. Este método representa uma ferramenta de ponta para estudar a estimulação elétrica nervosa periférica e as entradas de órgãos viscerais torácicos, bem como suas interações no nível sensorial primário.

Imagem de cálcio dos gânglios da raiz dorsal torácica (DRG) in vivo e registro de ECG para estudar a estimulação de nervos periféricos

Este estudo estabeleceu modelos de tosse e espirro em camundongos aplicando estímulos específicos à traqueia e à cavidade nasal e desenvolveu um método baseado em áudio para distinguir entre tosses e espirros de camundongos, analisando diferenças em seus sinais acústicos.<br...

Indução de precisão e distinção dos reflexos de tosse e espirro em camundongos

Aprenda a rotular e isolar neurônios nodosos que inervam as vias aéreas em ratos usando Fast Blue e dissociação de gânglios. Este método robusto permite análise de expressão gênica em neurobiologia periférica.

Um método para alvejar e Isolar Airway-inervação neurônios sensoriais em Ratos

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