Um método para alvejar e Isolar Airway-inervação neurônios sensoriais em Ratos
19 de abril de 2016
Neurônios sensoriais específicos de órgãos são difíceis de identificar. O rastreamento Fast Blue é usado para identificar neurônios nodose que inervam as vias aéreas para classificação celular. Os neurônios nodose classificados são usados para extrair ácido ribonucleico (RNA) de alta qualidade para sequenciamento. Usando este protocolo, a expressão gênica de neurônios específicos das vias aéreas é determinada.
O objetivo geral deste experimento é rotular e isolar os neurônios nodosos do nervo vago que inervam as vias aéreas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de Neurobiologia Periférica. Por exemplo, quais propriedades identificadoras possuem os neurônios que inervam as vias aéreas?
A principal vantagem desta técnica é que ela fornece um método robusto e de alto rendimento para direcionar e isolar populações neuronais específicas. Após coletar os gânglios sensoriais, aspire 500 microlitros da solução de dissociação de gânglios de cada tubo, sem perturbar os gânglios. Em seguida, adicione um mililitro de PBS a cada amostra e aguarde os gânglios sedimentarem no fundo dos tubos.
Em seguida, remova o PBS e adicione um mililitro de solução de dissociação de gânglios suplementada com enzima de digestão aos neurônios, seguido pela adição de 20 microlitros de Azul Rápido ao tubo controle positivo. Incube os tubos a 37 graus Celsius pelo tempo apropriado conforme a idade da enzima de digestão. Agite e bata levemente nos tubos brevemente a cada 15 minutos, para garantir que os gânglios estejam cobertos pela solução de digestão.
Enquanto as células nervosas estão sendo digeridas, adicione lentamente e com cuidado 400 microlitros de solução recém-preparada de densidade 12% sobre 400 microlitros de solução de densidade 28% em um tubo de 1,5 mililitro por amostra. Deve ser possível visualizar duas camadas distintas, uma mais escura que a outra. Em seguida, identifique tubos de coleta de 1,5 mililitro para separação, incluindo um tubo positivo para Fast Blue e um tubo negativo para Fast Blue por amostra de separação.
No final do período de digestão, descarte a enzima de digestão e lave os gânglios duas vezes com um mililitro de PBS, conforme acabou de ser demonstrado. Após a segunda lavagem, adicione 200 microlitros de solução fresca de dissociação de gânglios a cada tubo. Em seguida, usando uma pipeta de 200 microlitros ajustada para um volume de 100 microlitros, pipete os gânglios para cima e para baixo várias vezes para dissociar as células em uma suspensão unicelular, tomando cuidado para evitar bolhas.
Quando não forem visíveis fragmentos de tecido intactos, segurando firmemente um filtro celular de 70 micrômetros com uma das mãos, pipete a solução de células dissociadas no centro do filtro. Em seguida, lave o tubo de dissociação com 100 microlitros de solução fresca de dissociação de gânglios para recolher quaisquer células adicionais. Filtre a lavagem através do filtro e use uma nova ponteira de pipeta para aspirar qualquer solução remanescente contendo células na parte inferior do filtro, adicionando-a à suspensão celular.
Agora, sobreponha cuidadosamente os 300 microlitros de células sobre a camada da gradiente de densidade previamente preparada. Em seguida, recolha as células dos gânglios por centrifugação. Enquanto as células estão em rotação, adicione 300 microlitros de tampão de lise recém-preparado ao tubo de coleta positivo Fast Blue e 600 microlitros de tampão de lise ao tubo de coleta negativo, para garantir que o fluido da câmara de ordenação não dilua significativamente o tampão de lise.
No final da centrifugação, remova cuidadosamente os 700 microlitros superiores da solução contendo a maior parte dos detritos celulares. Em seguida, misture 700 microlitros de solução fresca de dissociação de gânglios com as células restantes. Peline as células por centrifugação e descarte cuidadosamente o sobrenadante.
Em seguida, re-suspenda as células em 200 a 300 microlitros de solução de dissociação para triagem de gânglios usando uma pipeta de 1.000 microlitros ajustada para 200 microlitros. Coloque as células no gelo até que estejam prontas para triagem. Após purificar as células dos gânglios por FACS, homogenize os neurônios em tampão de lise durante um minuto com vortex.
Em seguida, misture as células várias vezes com um volume de etanol a 70% e transfira até 700 microlitros da amostra para uma coluna de centrifugação. Centrifugue a coluna por 15 segundos a 8.000 × g em uma microcentrífuga e descarte o fluxo passante. Quando toda a amostra tiver passado pela coluna de centrifugação, extraia o RNA de acordo com protocolos-padrão de purificação de RNA.
Em seguida, utilize um sistema de eletroforese microfluídico para testar a qualidade do RNA de acordo com as especificações do fabricante. Nestes gráficos, são mostrados os controles negativo e positivo com Fast Blue utilizados para definir as portas de classificação. As células do gânglio nodoso dissociadas e marcadas com Fast Blue podem então ser classificadas em populações positivas e negativas para Fast Blue.
A eficiência de separação para este método é de 73 a 85%, com aproximadamente 1.500 ou menos células positivas para Fast Blue e quase 60.000 células negativas para Fast Blue coletadas em média. Como observado nesta amostra representativa, os picos de 18S e 28S obtidos por eletroforese microfluídica podem ser utilizados para calcular o número de integridade de RNA a fim de determinar a qualidade do RNA extraído. Após dominada, esta técnica pode ser concluída em quatro horas e meia se for realizada corretamente.
Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de avançar rapidamente pelas etapas e utilizar soluções recém-preparadas para a extração de RNA. Após este procedimento, outros métodos, como o cultivo de neurônios, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como quais propriedades funcionais são exclusivas dos neurônios que inervam as vias aéreas? Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de Neurobiologia Periférica explorarem as propriedades únicas de uma população específica de neurônios que inervam as vias aéreas nos gânglios nodosos do nervo vago.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como rotular e dissociar neurônios específicos dos gânglios nodosos, os quais podem então ser utilizados para sequenciamento de RNA ou semeados para estudos funcionais. Não se esqueça de que o trabalho com 2-mercaptoetanol pode ser extremamente perigoso e que precauções, como o uso de luvas e a manipulação em capela química, devem sempre ser tomadas ao utilizar este composto.
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Visão Geral
Este estudo concentra-se na marcação e isolamento de neurônios nodosos que inervam as vias aéreas do nervo vago. O método tem como objetivo aprimorar a compreensão das propriedades desses neurônios sensoriais específicos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurobiologia Periférica
- Neurociência
- Técnicas de Classificação Celular
Contexto
- A identificação de neurônios sensoriais específicos de órgãos é desafiadora.
- O rastreamento com Azul Rápido é utilizado para a identificação de neurônios nodosos.
- A extração de RNA de alta qualidade é essencial para a análise de expressão gênica.
- Esta pesquisa contribui para a compreensão das propriedades neuronais.
Objetivo do Estudo
- Rotular e isolar neurônios nodosos que inervam as vias aéreas.
- Investigar as propriedades identificadoras desses neurônios.
- Fornecer um método robusto para direcionar populações neuronais específicas.
Métodos Utilizados
- Coleta de gânglios sensoriais do nervo vago.
- Uso de solução de dissociação de gânglios para classificação celular.
- Aplicação de PBS para facilitar a sedimentação dos gânglios.
- Extração de RNA para análise subsequente de sequenciamento.
Resultados Principais
- Identificação bem-sucedida de neurônios nodosos que inervam as vias aéreas.
- RNA de alta qualidade extraído para sequenciamento.
- Perfis de expressão gênica de neurônios específicos determinados.
- O método demonstrou capacidades de alto rendimento.
Conclusões
- A técnica isola efetivamente populações neuronais específicas.
- Fornece informações sobre as propriedades dos neurônios que inervam as vias aéreas.
- Contribui para a compreensão mais ampla da neurobiologia periférica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A direcionamento preciso e o isolamento de neurônios sensoriais que inervam as vias aéreas permitem a investigação com alta confiança de subpopulações neuronais relevantes para a biologia respiratória. Este método apoia a desvinculação mecanicista de riscos e a validação de alvos para descobertas em estágios iniciais em vias neuro-respiratórias. A abordagem aumenta a confiança preditiva para estudos de expressão gênica e funcionais em sistemas relevantes para doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a interrogatória seletiva de neurônios nodosos que inervam as vias aéreas, para esclarecimento de vias.
- Apoia a desmistificação biológica ao isolar populações neuronais funcionalmente distintas.
- Facilita a confiança preditiva na validação de alvos por meio de ordenação celular de alta pureza.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara populações neuronais validadas para ensaios transcriptômicos e funcionais subsequentes.
- Fornece resultados reprodutíveis e quantitativos por meio de triagem de células ativadas por fluorescência (FACS).
- Permite o isolamento escalonável de tipos celulares raros para o desenvolvimento robusto de ensaios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha populações neuronais isoladas com modelos respiratórios relevantes para a doença.
- Oferece continuidade do descobrimento molecular à validação pré-clínica de alvos neuronais.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco, permitindo o perfil funcional e de expressão gênica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta, desde a verificação inicial de hipóteses até a identificação de compostos líderes e a validação pré-clínica de alvos neuro-respiratórios.
- Biologia da Descoberta: Apoia a identificação orientada por hipóteses de assinaturas gênicas neuronais específicas das vias aéreas.
- Triagem: Permite o isolamento reprodutível baseado em FACS para ensaios quantitativos posteriores.
- Análises: Fornece RNA de alta qualidade para análise transcriptômica e perfilamento comparativo.
- Pesquisa Translacional: Possibilita a correlação de subtipos neuronais com modelos de doenças para a exploração de biomarcadores.
- Reutilização em Ambiente Corporativo: Estabelece um fluxo de trabalho reutilizável para o isolamento de neurônios que inervam órgãos em diferentes estudos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos neuronais.
- Valor Operacional: Padroniza o isolamento de neurônios e a extração de RNA para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou não avançar e a eficiência do capital ao permitir dados robustos em estágios iniciais.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos neuro-respiratórios para avanço.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em traçado neuronal, FACS e protocolos de extração de RNA.
- Exige acesso a microscopia de fluorescência, separação celular e sistemas de eletroforese microfluídicos.
- Necessita padronização entre equipes para o manuseio de amostras e qualidade dos dados.
- Adaptável a outras populações neuronais que inervam órgãos mediante otimização do protocolo.
- Depende de processamento rápido e reagentes frescos para manter a integridade do RNA.
