Name: Colheita seletiva de Marginating-hepática Leucócitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Aprenda a colher seletivamente leucócitos hepáticos marginantes de ratos e camundongos por perfusão forçada. Este método isola células imunes dos sinusoides hepáticos sem contaminação, permitindo estudar suas funções imunológicas únicas em doenças hepáticas.

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Os autores e este trabalho foram apoiados pela bolsa NIH/NCI # R01CA172138 (para SBE).

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Tel-Aviv. Protocolo 1. Ratos <ol><li> preparativos <ol><li> Preparar a solução de PBS heparinizado (30 unidades / ml) para ser utilizado à temperatura ambiente (RT) por adição de 30 unidades de heparina livre de conservante por ml de tampão fosfato salino (PBS) 1x solução. Calcular 35 ml por animal. </li><li> Passe heparinizado PBS através das linhas de bomba peristáltica e as agulhas borboleta para eliminar bolhas de ar. </li><li> Esterilizar instrumentos cirúrgicos - 2 pares de tesouras, fórceps embotados-2 gumes, hemostáticos, e uma pinça de dente-de tecido (autoclave a 121 ° C durante pelo menos 30 min no ambiente gravidade (seco)). </li></ol></li><li> Perfusão do Fígado e Recolha de MH-leucócitos <ol><li> Eutanásia do animal por uma overdose de 8% de isoflurano. Como medida de precaução, coloque um tubo de 50 ml contendo um isofluranopad -soaked em torno da cabeça do rato até que a abertura de sua caixa torácica. </li><li> Abrir as cavidades peritoneais e tórax para expor o fígado e o complexo cardiopulmonar imediatamente após a cessação da respiração. Evitar o sangramento através deste processo. <ol><li> Especificamente, iniciar a incisão no ponto da linha média abdominal inferior, sem órgãos internos prejudiciais, e progresso para ambos os lados na diagonal em direção as costelas, cortando-os a níveis peito-cavidade superior. </li></ol></li><li> Dentro de aproximadamente um minuto, recolher o máximo de sangue possível (~ 6 ml de um 250 g de animais) do ventrículo direito para uma seringa. </li><li> Prender a veia cava caudal com uma pinça hemostática tão próximo quanto possível do coração, para permitir a recolha do perfundido. </li><li> Retire os intestinos e lugar fora do animal para a direita do experimentador, para expor a veia portal. </li><li> Inserir um cateter IV 25 L, ligado a uma bomba peristáltica, na veia porta, como caudal quanto possível,mas rostral à veia do baço. </li><li> Inserir uma agulha G 25 borboleta, ligado a uma seringa de 5 ml, para a veia cava inferior, caudal para a pinça hemostática. </li><li> Ligar a bomba peristáltica a uma velocidade de aproximadamente 3 ml / min e recolhem suavemente os primeiros ml de perfusato que está contaminada com sangue para a seringa. Continue até que a cor do perfusato é ficar vermelho pálido (aproximadamente 3-5 ml). Note-se que a cor do fígado está mudando no sentido castanho claro. </li><li> Sem parar a bomba peristáltica, substituir a seringa de 5 mL com uma seringa de colheita de 20 ml de colheita e recolha de pelo menos 20 ml de perfusato fígado empregando uma velocidade mais elevada de perfusão (até 4 ml / min). monitorar continuamente o fluxo de perfusato para a seringa de coleta, e evitar vácuo que é muito forte (que podem entupir a agulha através colapso das paredes da veia cava). </li><li> Terminar a perfusão, quando a cor do fígado vira-se para castanho claro. </li></ol></li><li> leucócitos Extração <ol&gt; <li> Centrifuga-se o perfusato durante 10 minutos a 400 xg, 24 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante </li><li> Adicionar 10 ml de PBS, centrifugação a 400 xg durante 10 min, e o sobrenadante aspirado. Com base em metas de estudo, utilize preparação como está, ou realizar purificações adicionais (por exemplo, separação, em gradiente de densidade). <ol><li> Especificamente, a camada de 4 ml de perfusato mais de 4 ml de massa separação em gradiente de densidade num tubo de centrifugação de polipropileno de 50 cc. Gire os tubos a 754 xg, RT, durante 30 minutos com a quebra de fora. </li><li> Obter as camadas mononucleares na interface de separação por gradiente de densidade de sobrenadante por pipetagem manual de, lavar em PBS, e inserir um tubo de 5 ml. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Rato Protocolo <ol><li> preparativos <ol><li> Preparar a solução de PBS heparinizado (30 unidades / ml) para ser utilizado à temperatura ambiente (RT) por adição de 30 unidades de heparina livre de conservante por ml de fosfato salino (PBS) tamponada 1x solution. Calcular 20 ml por animal. </li><li> Passe heparinizado PBS através das linhas de bomba peristáltica e as agulhas borboleta para eliminar bolhas de ar. </li><li> Esterilizar instrumentos cirúrgicos - 2 pares de tesouras, fórceps embotados-2 gumes, hemostáticos, e uma pinça de dente-de tecido (autoclave a 121 ° C durante pelo menos 30 min no ambiente gravidade (seco)). </li></ol></li><li> Perfusão do Fígado e Recolha de MH-Leucócitos <ol><li> Eutanásia do animal por uma overdose de 8% de isoflurano. Como medida de precaução, coloque um tubo de 15 ml contendo uma almofada encharcada de isoflurano em torno da cabeça do rato até a abertura de sua caixa torácica. </li><li> Corrigir os membros do mouse para uma cama. </li><li> Abrir as cavidades peritoneais e tórax para expor o fígado e o complexo cardiopulmonar imediatamente após a cessação da respiração, mantendo o aspecto inferior do diafragma intacto (para criar uma cavidade torácica piscina drenagem). Evitar o sangramento através deste processo. <ol><li> Especificamente, iniciar a incisão na parte inferiorponto abdominal na linha média, sem órgãos internos prejudiciais, e progresso para ambos os lados na diagonal em direção as costelas, cortando-os a níveis peito-cavidade superior. </li></ol></li><li> Arrancamento dos intestinos e lugar fora do animal para a direita do experimentador, para expor a veia portal. </li><li> Inserir uma agulha 30 g, ligada a uma bomba peristáltica para a veia porta rostral à veia esplénica. </li><li> Cortar a veia cava inferior acima do diafragma para permitir a drenagem e recolha do perfundido da cavidade torácica. </li><li> Ligar a bomba peristáltica a uma velocidade de aproximadamente 3 ml / min e suavemente recolher os primeiros 3 ml de perfusato que está contaminada com sangue a partir da piscina cavidade torácica. </li><li> Descarte este perfusato. Repita essa lavar novamente, se necessário, usando solução salina, e só então começar a recolher perfusato fígado. </li><li> Re-iniciar a perfusão a uma velocidade de até 4 ml / min, e recolher 10 ml de perfusato da cavidade torácica usandouma borboleta ligado a uma seringa. </li><li> Terminar a perfusão, quando a cor do fígado vira-se para castanho claro. </li></ol></li><li> leucócitos Extração <ol><li> Centrifugar o perfusado durante 10 min a 400 x g. </li><li> Aspirar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 10 ml PBS, centrifugação a 400 xg durante 10 min, e aspirar o sobrenadante com base em metas de estudo, utilize preparação como é, ou realizar purificações adicionais (por exemplo, separação, em gradiente de densidade). <ol><li> Especificamente, a cada camada de 4 ml de perfusato mais de 4 ml de massa separação em gradiente de densidade num tubo de centrifugação de polipropileno de 50 cc. Gire os tubos a 754 xg, RT, durante 30 minutos com a quebra de fora. </li><li> Obter as camadas mononucleares na interface de separação por gradiente de densidade de sobrenadante por pipetagem manual de, lavar em PBS, e inserir um tubo de 5 ml. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+rats%3A+characteristics+of+continuous+inflammation+and+activated+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells.</a> J Immunother. 33, 16-29 (2010).</li>
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<li>Wiltrout, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentation+of+mouse+liver-associated+natural+killer+activity+by+biologic+response+modifiers+occurs+largely+via+rapid+recruitment+of+large+granular+lymphocytes+from+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow.</a> J Immunol. 143, 372-378 (1989).</li>
<li>Schluter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+metastatic+tumor+cell+adhesion+and+extravasation+of+colon+carcinoma+cells+with+different+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential.</a> Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).</li>
<li>Wiltrout, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentation+of+organ-associated+natural+killer+activity+by+biological+response+modifiers.+Isolation+and+characterization+of+large+granular+lymphocytes+from+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver.</a> J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).</li>
<li>Winnock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+liver-associated+lymphocytes+in+patients+with+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis.</a> Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).</li>
<li>Hata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+phenotyping%2C+and+functional+analysis+of+lymphocytes+from+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver.</a> Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).</li>
<li>Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+phenotypically+and+functionally+distinct+subset+of+large+granular+lymphocytes+%28pit+cells%29+in+rat+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids.</a> Hepatology. 12, 70-75 (1990).</li>
<li>Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. PNIRS Annual Scientific meeting, Seattle, , (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

O método de perfusão do fígado aqui apresentada permite uma colheita selectiva e estudo da população única de marginating leucócitos hepáticas. Células hepáticas NK, também chamados de células pit 3, constituem uma população distinta de células NK que residem nos sinusóides hepáticos. Eles são encontrados em ratos, ratos 17 e em humanos 18,19. Em comparação com células NK periféricas isoladas, células pit demonstraram maior citotoxicidade contra YAC-1 e CC531s linhas celulares alvo ...

Os sinusóides do fígado contêm numerosos subtipos de leucócitos de várias actividades imunes críticos para o organismo. Por exemplo, marginating hepática células natural killer (MH) (NK), também conhecidas como células pit, são caracterizados morfologicamente como grandes linfócitos granulares (LGLs) e funcionalmente como leucócitos com capacidade citotóxica espontânea, permitindo hepática resistência contra o estabelecimento de análises ao sangue metástases tumorais Borne. O objectivo do método aqui apresentado é o de permitir a colheita selectiva de leucócitos MH, a fim de estudar esta população de células importante e original (e compartimento imune), e para elucidar o impacto de várias manipulações (por exemplo, activação imune) sobre essas células específicas. Apesar do fracasso da imunidade para eliminar o desenvolvimento de um tumor primário, provas em pacientes com cancro e em modelos animais indicam que o sistema imune pode controlar células tumorais, micrometástases e de doença residual que circula atraimunidade mediada por células GH (CMI). No entanto, existe uma aparente inconsistência entre estes em capacidades in vivo e in vitro em seres humanos e em animais, que demonstram que a maioria das células tumorais autólogas são resistentes a citotoxicidade pela circulação de leucócitos ou esplénicas 1,2. Esta inconsistência pode ser atribuída, pelo menos em parte, à existência in vivo de uma subpopulação de leucócitos distintas, a saber, os sinusóides (leucócitos) marginating-hepático e a sua sub-população de células NK activadas, nomeadamente células pit 3. Com efeito, dados não publicados do nosso laboratório indicaram que em ratos F344 células tumorais singénicas (MADB106), as quais foram consideradas resistentes à circulação e esplénicos leucócitos, foram submetidas a lise por células NK MH-4. Assim, as células tumorais que são &quot;resistente NK-&quot; alegadamente para leucócitos circulantes podem ser controlados por células NK-MH. Notável, em ratos o aumento da atividade de MH-NK é evidente apenas seguir in vivo imunológicoestimulação (por exemplo, através da utilização de poli I: C ou CpG-C) 5. células NK específico do fígado (MH-NK) estão situados dentro do lúmen sinusoidais, aderir às células endoteliais e células de Kupffer. Células MH-NK são caracterizados exclusivamente por grânulos densos esféricas e vesículas com núcleo de haste 6, que contêm fosfatase ácida como enzimas lisossomais e perforina e granzimas como substâncias bioativas 7,8. Em comparação com células NK circulantes, células-NK MH exibem um maior número e tamanho dos grânulos e vesículas 9-11. Sob condições inflamatórias, células-NK foram MH mostrado exibir maior expressão de LFA-1 12, em comparação com células NK circulantes. Esta expressão aumentada pode constituir um mecanismo pelo qual as células NK-MH é mais citotóxico contra certas células tumorais do que as células NK circulantes 13,14. nterestingly, após incubação in vitro com a interleucina (IL) -2, células-NK MH tornou alargada, eo seu número e tamanho de grânulos de aumentar, os quais são consistentes com uma pro fi le de assassinas activadas por linfocina (LAK) células 15. leucócitos MH activas não podem ser obtidos exclusivamente através dos métodos de colheita de leucócitos no fígado padrão, os quais são baseados na moedura e degradação biológica do tecido. A nossa abordagem perfusão aqui descrito possui duas grandes vantagens em comparação com os métodos normais. Em primeiro lugar, a abordagem de perfusão colhe seletivamente leucócitos MH, evitando a contaminação por outros leucócitos de outros compartimentos do fígado. Em segundo lugar, a técnica de perfusão melhor preserva a integridade, a actividade, e o meio fisiológico de leucócitos MH, ao contrário do processamento de tecidos abordagens que danificam as células ou alteram a sua morfologia, e devido ao dano do tecido, induzir a libertação de vários factores que marcadamente modular imune atividade. O fígado é um dos principais alvos de metástase de câncer dend para várias infecções 16. Como as células MH apresentam características únicas que é importante estudar essa população específica sob várias condições no que diz respeito a estas patologias. Por exemplo, é digno de nota que a activação imunitária sistémica por vários BRMs (por exemplo, poli I: C ou CpG-C) têm mostrado activar MH-leucócitos mais do que 5 leucócitos circulantes.

<table><tbody><tr>Bomba <td></td><td></td><td></td><td>peristáltica Autoclud</td></tr><tr><td>Agulha borboleta</td><td>OMG</td><td></td><td>26 G</td></tr><tr><td>Agulha borboleta</td><td>OMG</td><td></td><td>21 G * 3/4 "</td></tr><tr><td>Solução de seringa</td><td>Pic 1</td><td></td><td>ml</td></tr><tr><td>Solução de seringa</td><td>Pic</td><td></td><td>2,5 ml</td></tr><tr><td>Seringa</td><td>Solução de pic 5</td><td></td><td>ml</td></tr><tr><td>Seringa</td><td>Solução Pic</td><td>10 ml</td>Seringa Solução Pic 25 ml Pinça de borda romba Tesoura hemostático Pinça de tecido 22 W Lupa fluorescente Luz do dia Lâmpada <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

colheita seletiva de marginating-hepática leucócitos

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Os leucócitos hepáticos marginais (MH) (leucócitos aderidos aos sinusóides do fígado) demonstraram apresentar composição e características únicas em comparação com os leucócitos de outros compartimentos imunológicos. Especificamente, as evidências sugerem um perfil pró e anti-inflamatório distinto da população de leucócitos MH e maior citotoxicidade de células NK específicas do fígado (ou seja, células fossas) em comparação com imunócitos circulantes ou esplênicos em camundongos e ratos. O método aqui apresentado permite a coleta seletiva de leucócitos HM por perfusão forçada do fígado em camundongos e ratos. Em contraste com outros métodos usados para extrair leucócitos do fígado, incluindo trituração de tecidos e degradação biológica, este método produz exclusivamente leucócitos dos sinusóides do fígado, não contaminados por células de outros compartimentos do fígado. Além disso, a técnica de perfusão preserva melhor a integridade e o meio fisiológico dos leucócitos HM, poupando respostas fisiológicas conhecidas ao processamento tecidual. Como muitas células malignas circulantes e células infectadas são detidas ao passar pelos sinusóides hepáticos, interagindo fisicamente com células endoteliais e leucócitos residentes, a população única de leucócitos HM está estrategicamente localizada para interagir, identificar e reagir em relação às células circulantes aberrantes. Assim, a colheita seletiva de leucócitos MH e seu estudo sob várias condições podem avançar nossa compreensão do significado biológico e clínico dos leucócitos HM, especificamente no que diz respeito às células aberrantes circulantes e doenças relacionadas ao fígado e metástases cancerígenas.

Em ratos F344 comparou-se a citotoxicidade de células NK-MH (recolhida das sinusóides do fígado por perfusão do fígado forçada) para citotoxicidade de toda a população de células de fígado após trituração mecânica do tecido do fígado, e para a citotoxicidade de leucócitos circulantes. Todas as preparações celulares foram lavadas, pelo menos, 3 vezes, como rotina em ensaios imunológicos, e como linhas de células alvo foi utilizado o alogénico de YAC-1 ou as linhas de células alvo singenei...

Os leucócitos hepáticos marginais exibem características únicas e funções imunológicas distintas em comparação com outras populações de leucócitos. Aqui descrevemos um método para colheita seletiva dessa população específica de células hepáticas, por meio de perfusão forçada do fígado de ratos ou camundongos. Os leucócitos hepáticos marginais parecem críticos na determinação da suscetibilidade a doenças e metástases relacionadas à hepatia.

Colheita seletiva de Marginating-hepática Leucócitos

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

O objetivo geral deste procedimento é colher seletivamente leucócitos hepáticos marginais, células imunes que aderem aos sinusoides do fígado, por meio de perfusão forçada a partir de fígados de camundongos ou ratos. Este método permite o estudo dos leucócitos hepáticos, que exibem características únicas e funções imunológicas distintas em comparação com outras populações de leucócitos. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece leucócitos exclusivamente provenientes do sinusóide hepático, sem contaminação por células de outros compartimentos hepáticos, como o parênquima.Realizarão o procedimento Liat Sorski e Lee Shaashua, duas estudantes de pós-graduação excepcionais do meu laboratório. Antes de iniciar o procedimento de perfusão hepática, lave as tubulações da bomba peristáltica e as agulhas tipo borboleta com PBS heparinizado para remover quaisquer bolhas de ar. Em seguida, imediatamente após a cessação da respiração, use tesoura estéril e pinça de tecido dentada para fazer uma incisão abdominal mediana, começando no abdômen inferior da rata eutanasiada até o processo xifoide, tomando cuidado para não danificar os órgãos internos.Em seguida, use a pinça para levantar o esterno e corte cuidadosamente o diafragma e a caixa torácica em ambos os lados. Prenda um hemostato no esterno e dobre a caixa torácica em direção rostral para expor o complexo cardiopulmonar. Em seguida, prepare uma agulha tipo borboleta de 21 gauge conectada a uma seringa de 10 mililitros e insira-a no ventrículo direito do coração.Em seguida, use a seringa de 10 mililitros para coletar o máximo de sangue possível. Quando todo o sangue tiver sido coletado, use um hemostato para pinçar a veia cava caudal o mais próximo possível do coração. Depois, mova os intestinos para fora da cavidade abdominal para o lado esquerdo do animal, a fim de expor a veia porta.Em seguida, prepare uma cânula IV de 25 gauge conectada ao tubo de saída da bomba peristáltica e insira-a na veia porta o mais caudal possível, permanecendo rostral à veia esplênica. Depois, prepare uma agulha tipo borboleta de 21 gauge conectada a uma seringa de cinco mililitros e insira-a na veia cava inferior, caudal ao hemostato. Ligue a bomba peristáltica em uma velocidade de aproximadamente três mililitros por minuto e colete os primeiros mililitros do perfusato contaminado com sangue na seringa.Substitua a seringa de colheita de cinco mililitros pela seringa de colheita de 20 mililitros sem interromper a bomba quando o perfusato adquirir uma coloração vermelho-pálida. Em seguida, colete pelo menos 20 mililitros de perfusato hepático a uma taxa de sete mililitros por minuto. Quando todo o fígado estiver marrom-claro, encerre a perfusão.Em seguida, centrifugue o perfusato e aspire o sobrenadante. Para coletar leucócitos hepáticos marginais de camundongo, imediatamente após a cessação da respiração, use tesoura estéril e pinça de tecido dentada para fazer uma incisão abdominal mediana até o processo xifoide. Em seguida, use a pinça para levantar o esterno e corte cuidadosamente o diafragma e a caixa torácica em ambos os lados.Prenda um hemostato ao esterno e dobre a caixa torácica em direção rostral para expor o complexo cardiopulmonar. Desloque os intestinos para fora da cavidade abdominal, posicionando-os à esquerda do animal, expondo a veia porta. Em seguida, conecte uma agulha de calibre 30 a uma bomba peristáltica e insira-a na veia porta, na região rostral à veia esplênica.Corte a veia cava inferior acima do diafragma para permitir a drenagem e coleta do perfusato da cavidade torácica. Em seguida, ligue a bomba peristáltica em uma velocidade de aproximadamente três mililitros por minuto e colete os primeiros mililitros do perfusato contaminado com sangue proveniente da poça na cavidade torácica. Quando três mililitros tiverem sido coletados, desligue a bomba.Em seguida, após inserir uma agulha tipo borboleta de 21 gauge conectada a uma seringa de 10 mililitros, reinicie a perfusão a uma velocidade de até quatro mililitros por minuto até que 10 mililitros de perfusato sejam coletados da cavidade torácica. Quando o fígado ficar marrom claro, encerre a perfusão. Em seguida, transfira o perfusato para um tubo de 15 mililitros.Centrifugue-o. Em seguida, aspire o sobrenadante. Enquanto as células NK marginais-hepáticas exibem uma citotoxicidade acentuada contra linhagens celulares alogênicas, toda a população celular do fígado e os leucócitos circulantes apresentam níveis significativamente mais baixos de citotoxicidade e quase nenhuma capacidade de lise contra uma linhagem celular alogênica.Os mesmos níveis relativamente mais baixos de citotoxicidade são evidentes quando fígados processados mecanicamente passam por lavagem e separação em gradiente de densidade. A análise de fatores de populações leucocitárias específicas revela profundas diferenças na composição das populações de células imunes dos compartimentos circulantes e hepáticos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em poucos minutos, se realizada corretamente.Após este procedimento, a célula pode ser utilizada para citometria de fluxo, PCR ou quaisquer outros métodos para caracterizar esta importante população de leucócitos. Esta técnica permite a coleta seletiva de leucócitos marginais hepáticos para aprimorar nossa compreensão da significância biológica e clínica. Especificamente, esperamos controlar células aberrantes circulantes e doenças relacionadas ao fígado.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como coletar leucócitos hepáticos marginais.

selective-harvesting-of-marginating-hepatic-leukocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um novo método para obter macrófagos de cultura primária de células de fígado de rato é descrito. Este método utiliza a proliferação de macrófagos na cultura, seguido por agitação de frascos de cultura e purificação pelo apego seletivo para pratos de plástico. Esta técnica proporciona eficiente macrófagos do fígado, sem equipamentos complexos e habilidades.

Um método simples e eficiente para isolar Macrófagos de Mixed culturas primárias de células do fígado Adulto

Este vídeo descreve um método para separação espacial de três subpopulações de células leucêmicas: as células leucêmicas suspensas flutuando livremente no meio, células leucêmicas brilhantes de fase aderidas à superfície da monocamada de células estromais mesenquimais e as células leucêmicas de fase fraca que migraram sob a monocamada de células estromais mesenquimais da co-cultura 2D.

Colheita de subpopulações leucêmicas: um método para separação espacial de subpopulações de células leucêmicas da co-cultura 2D

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de leucócitos hepáticos marginais do fígado de camundongo por perfusão forçada.

Isolamento de leucócitos hepáticos marginais de fígado de camundongo

Este vídeo demonstra o isolamento de linfócitos, incluindo células natural killer ou células NK, do tecido hepático humano para expansão seletiva. A digestão enzimática e mecânica, seguida de separação por gradiente de densidade, promove o isolamento de linfócitos, incluindo células NK. Os linfócitos coletados podem ser usados para a expansão seletiva das células NK.

Isolamento de células assassinas naturais do tecido hepático para expansão seletiva

Uma técnica para isolar hepatócitos humanos e células hepáticas não parenquimatosas do mesmo doador é descrita. Os diferentes tipos de células hepáticas constroem a base para modelos funcionais de fígado e engenharia de tecidos. Este novo método visa isolar células hepáticas com alto rendimento e viabilidade.

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

Os leucócitos pulmonares marginantes exibem características únicas e funções imunológicas distintas em comparação com outras populações de leucócitos. Aqui descrevemos a coleta seletiva dessa subpopulação de leucócitos pulmonares, por perfusão forçada dos pulmões em ratos e camundongos. Os leucócitos pulmonares marginais parecem críticos na determinação da suscetibilidade a doenças transmitidas pelo sangue e relacionadas ao pulmão.

Colheita seletiva de Marginating-pulmonar Leucócitos

lesões no figado são acompanhadas por expansão de células progenitoras que representa uma população celular heterogénea. classificação Novel deste compartimento celular permite a distinção dos vários subgrupos. O método descrito aqui ilustra a análise de citometria de fluxo e de alta pureza isolamento de vários subconjuntos que podem ser utilizadas para ensaios posteriores.

Isolamento e Enriquecimento de fígado progenitoras Subconjuntos identificado por um marcador combinação de superfícies Novel

O objetivo do presente protocolo é identificar populações de células endoteliais linfáticas dentro do fígado usando marcadores descritos. Nós utilizamos colagenase IV e DNase e um suave de picagem de tecido, combinado com citometria de fluxo, para identificar uma população distinta de células endoteliais linfáticas.

Digestão do fígado murino para um fluxo Cytometric análise de células endoteliais linfáticas

Aqui descrevemos e demonstramos um protocolo para o isolamento da célula endotelial do fígado do camundongo primário (LSEC). O protocolo é baseado na perfusão da colagem hepática, purificação celular não parenquimal por centrifugação de baixa velocidade e seleção de contas magnéticas CD146. Também fenótipo e caracterizamos esses LSECs isolados usando citometria de fluxo e microscopia eletrônica de varredura.

Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

Hepatócitos carregados de lipídios são inerentes à regeneração hepática, mas geralmente são perdidos após a centrifugação do gradiente de densidade. Aqui, apresentamos um protocolo de isolamento celular otimizado que retém hepatócitos esteatóticos, produzindo populações representativas de hepatócitos regeneradores após hepatectomia parcial em camundongos.

Isolamento de Hepatócitos Regeneradores após Hepatectomia Parcial em Camundongos

As células endoteliais linfáticas leptomeníngeas (LLECs), um tipo de célula intracraniana recentemente identificado, têm funções pouco compreendidas. Este estudo apresenta um protocolo reprodutível para a colheita de LLECs de camundongos e estabelecimento de culturas primárias in vitro . Este protocolo é projetado para permitir que os pesquisadores se aprofundem nas funções celulares e potenciais implicações clínicas de LLECs.

Colheita e Cultura Primária de Células Endoteliais Linfáticas Leptomeníngeas

Aprenda a colher seletivamente leucócitos hepáticos marginantes de ratos e camundongos por perfusão forçada. Este método isola células imunes dos sinusoides hepáticos sem contaminação, permitindo estudar suas funções imunológicas únicas em doenças hepáticas.

Colheita seletiva de Marginating-hepática Leucócitos

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