Diferenciação de Atrial Cardiomyocytes de células-tronco pluripotentes Usando o BMP Antagonista Grem2

O objetivo geral deste protocolo de diferenciação é gerar populações homogêneas de cardiomiócitos atriais em cultura. Portanto, esse método pode ajudar a responder a questões-chave no estudo do desenvolvimento cardíaco e doenças cardíacas, como arritmia atrial. As principais vantagens dessa técnica são que ela produz culturas homogêneas de cardiomiócitos atriais in vitro e pode ser feita com treinamento mínimo.

Até quatro dias antes de configurar as células-tronco embrionárias de camundongo, ou culturas mESC, codifique placas de tecido de 10 centímetros com 5 mililitros de solução de gelatina a 0,2% cada, em seis placas de poço com 1 mililitro de gelatina por poço em uma capa de cultura de tecidos esterilizada. No dia da cultura, remova a solução extra de gelatina e adicione 10 mililitros de meio a um dos pratos de 10 centímetros revestidos com gelatina. Em seguida, use criotônicos para girar suavemente um frasco de 1 vezes 10 elevado a 6 mESCs em banho-maria de 37 graus Celsius até que apenas um pequeno cristal de gelo permaneça no centro do frasco.

Seque o frasco com um pano descartável e sem fiapos e esterilize-o com etanol a 70%. Em seguida, coloque o frasco na capa de cultura de tecidos e use uma pipeta P1000 para adicionar os ESCs ao prato. Coloque as células em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e mova suavemente a placa da frente para trás e de um lado para o outro para distribuir uniformemente as células.

No final da incubação, use um microscópio de campo claro para confirmar a fixação da célula. Alguns detritos e células mortas serão observados. Substitua o meio por 10 mililitros de meio mESC fresco e retorne as células à incubadora.

Quando a cultura estiver 60 a 70% confluente, enxágue a placa com 5 mililitros de DPBS estéril sem magnésio e cálcio e incube as células em 2 mililitros de tripsina EDTA a 37 graus Celsius por cinco minutos. Enquanto as células estão incubando, aspire o excesso de solução de gelatina de um novo prato de 10 centímetros por cultura passada e adicione 10 mililitros de meio a cada prato. Em seguida, colete as células destacadas por centrifugação em um tubo de 15 mililitros e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio mESC.

Dependendo da proporção de divisão desejada, adicione 0,5 a 1 mililitro de suspensão celular a cada prato de 10 centímetros e retorne as células à incubadora, distribuindo suavemente as células em cada prato, conforme demonstrado. Quando as células passadas estiverem 70% confluentes, separe-as com tripsina EDTA como acabamos de demonstrar e, em seguida, ressuspenda a suspensão unicelular em 5 mililitros de corpo embrióide ou meio EB. Conte os mESCs e dilua-os no volume apropriado de meio EB até uma concentração final de 2,5 vezes 10 elevado à 3ª célula por mililitro.

Em seguida, adicione 2 mililitros de PBS ao fundo de uma placa de Petri bacteriana estéril de 10 centímetros por cultura de gota suspensa e transfira a suspensão EB para uma bacia de solução estéril. Agora, retire a tampa de um dos pratos preparados e use uma pipeta multicanal, equipada com seis pontas, para depositar cuidadosamente 60 gotas de 20 microlitros de suspensão EB na superfície interna. Coloque delicadamente a tampa de volta no prato, tomando cuidado para não desalojar as gotas penduradas e coloque os pratos na incubadora de cultura de células por dois dias.

Para lavar os EBs, remova cuidadosamente a tampa da cultura de gota pendurada e incline-a em um ângulo de 45 graus. Em seguida, usando uma pipeta sorológica de 5 mililitros contendo meio EB em temperatura ambiente, lave suavemente os EBs em uma poça na parte inferior da tampa. Inspecione cuidadosamente a tampa para ver se há EBs presos à superfície e, em seguida, transfira os EBs para uma placa de Petri de 6 centímetros sem revestimento.

Devolva os EBs à incubadora de cultura de tecidos por mais dois dias, verificando as placas diariamente quanto à agregação e fixação de EB. Antes de revestir os EBs, substitua o excesso de solução de revestimento de gelatina em cada poço da placa de seis poços preparada, por 2 mililitros de meio de tratamento Grem2 recém-preparado em temperatura ambiente. Em seguida, use uma pipeta P1000 ajustada para 100 microlitros para transferir 30 EBs para cada poço e, em seguida, retorne a placa para a incubadora durante a noite, dispersando uniformemente as células com movimentos suaves, conforme demonstrado.

Depois que os EBs estiverem presos ao fundo dos poços, substitua o meio Grem2 a cada dois dias até o dia 10. Em seguida, alimente as células com meio EB fresco a cada dois dias para manter uma cultura de células saudável. Antes de sua cultura de gotas suspensas, as células-tronco pluripotentes devem ser compactas e livres de diferenciação espontânea.

Se for observada diferenciação espontânea, as células não devem ser usadas nas culturas de gotas suspensas. O EB de qualidade geralmente é melhor formado em gotas suspensas uniformemente espaçadas e bem arredondadas. No segundo dia de diferenciação, os EBs devem ser visíveis a olho nu, como arranjos esféricos de células-tronco diferenciadoras nas pontas das gotas penduradas.

No quarto dia, EBs bem formados devem flutuar livremente e homogêneos em tamanho e forma. Uma vez plaqueados, os EBs se achatarão à medida que as células migram do EB para a superfície da placa de cultura de tecidos, conforme observado aqui nos dias oito e 10 de diferenciação. Em poços de controle não tratados, pequenas manchas de contração lenta são observadas já no sexto dia e no nono dia.

Enquanto em poços tratados com Grem2, grandes manchas com uma taxa de contração relativamente rápida são comuns. A análise RT-QPCR da expressão gênica nas células diferenciadas normalmente revela altos níveis de genes estruturais e regulatórios cardíacos em culturas tratadas com Grem2. Se a linha celular nuclear alfa-MHC DsRed for usada, o aumento do rendimento de cardiomiócitos é observado como um número maior de núcleos marcados com DsRed nos poços tratados com Grem2.

O tratamento com Grem2 também influencia a diferenciação em direção a um fenótipo semelhante ao atrial, conforme confirmado por medições de RT-QPCR e patch clamp da duração do potencial de ação celular. Uma vez dominadas, as células-tronco diferenciadoras podem ser tratadas com Grem2 em menos de 60 minutos e as células beading geralmente são observadas já no sétimo dia. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de adicionar Grem2 consistentemente no quarto dia após o pico de expressão de marcadores de gastrulação, como braquiúria.

Após este procedimento, outros métodos como eletrofisiologia e QPCR podem ser realizados para entender as características funcionais e moleculares das células que foram geradas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar cardiomiócitos atriais a partir de ESCs de camundongos, usando Grem2.