Name: Diferenciação de Atrial Cardiomyocytes de células-tronco pluripotentes Usando o BMP Antagonista Grem2 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprenda a diferenciar cardiomiocitos atriais a partir de células-tronco pluripotentes usando o antagonista BMP Grem2. Este protocolo produz populações homogêneas para pesquisa em arritmias atriais.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado pelo NIH concede HL083958 e HL100398 (AKH) e 2T32HL007411-33 &quot;Programa em Mecanismos Cardiovasculares: Formação em Investigação&quot; (JB).

<ol><li>Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+differentiation+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hepatic differentiation of pluripotent stem cells.</a> Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).</li>
<li>Narazaki, G., Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+and+systematic+differentiation+of+cardiovascular+cells+from+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells.</a> Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).</li>
<li>Zhang, Y., Pak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
<li>Park, I. H., Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134 (5), 877-886 (2008).</li>
<li>Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+as+models+of+trophoblast+differentiation%3A+progress%2C+opportunities%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations.</a> Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).</li>
<li>Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+Into+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).</li>
<li>Burridge, P. W., Anderson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+embryonic+stem+cell+embryoid+body+homogeneity+and+cardiomyocyte+differentiation+from+a+novel+V-96+plate+aggregation+system+highlights+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability.</a> Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).</li>
<li>Cai, C. L., Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isl1+Identifies+a+cardiac+progenitor+population+that+proliferates+prior+to+differentiation+and+contributes+a+majority+of+cells+to+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart.</a> Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).</li>
<li>Fujiwara, M., Yan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+enhancement+of+cardiac+cell+differentiation+from+mouse+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+Cyclosporin-A%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A.</a> PLoS ONE. 6 (2), e16734(2011).</li>
<li>Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+antagonism+by+Dkk1+counter+activates+canonical+wnt+signaling+and+promotes+cardiomyocyte+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).</li>
<li>Burridge, P. W., Matsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Lian, X., Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li>
<li>Zhang, J., Klos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+the+matrix+sandwich+method%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li>
<li>Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gremlin+2+promotes+differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+atrial+fate+by+activation+of+the+JNK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway.</a> Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).</li>
<li>Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li>
<li>Müller, I. I., Melville, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+modeling+in+zebrafish+demonstrates+that+the+atrial-fibrillation-associated+gene+GREM2+regulates+cardiac+laterality%2C+cardiomyocyte+differentiation+and+atrial+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).</li>
<li>Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+protein+related+to+DAN+and+cerberus+%28PRDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC).</a> Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).</li>
<li>Schulz, H., Kolde, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FunGenES+Database%3A+A+genomics+resource+for+mouse+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation.</a> PLoS ONE. 4 (9), e6804(2009).</li>
<li>Phosphate-buffered saline (PBS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. , (2006).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+Real-Time+quantitative+PCR+and+the+2%E2%88%92%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egr-1+regulates+expression+of+the+glial+scar+component+phosphacan+in+astrocytes+after+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke.</a> American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).</li>
<li>Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+recording+of+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li>
<li>Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li>
<li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).</li>
<li>Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%B6pfl%2C+G+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. , 254-279 (2004).</li>
<li>Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+mouse+embryonic+stem+cell+based+assay+for+quantifying+cardiogenic+Induction+Efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li>
<li>Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAntonchuk%2C+J+%22Basic+Cell+Culture+Protocols%22">Basic Cell Culture Protocols</a>. 946, 523-533 (2013).</li>
<li>Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+culture+of+murine+primordial+germ+cells+and+embryonic+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells.</a> Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).</li>
</ol>

Os autores deste manuscrito não têm interesses financeiros concorrentes.

Este protocolo rotineiramente produz culturas com uma elevada percentagem de CMS que são característicos da linhagem atrial. Como acontece com qualquer protocolo de diferenciação, a qualidade dos mESCs anteriores à diferenciação deve ser dada especial atenção. mESCs devem ser monitorizados por rotina para a morfologia adequada (Figura 1A). Qualquer diferenciação espontânea que ocorre antes da formação da EBS irá limitar severamente a eficiência de CARDIOGENESIS e deve ser removido antes passaging <stron...

As células estaminais pluripotentes são uma ferramenta poderosa para gerar e estudar as células de um hospedeiro de difícil acesso aos tecidos para estudos de investigação básica e pré-clínicos, especialmente em seres humanos 1-5. modulação correcta de vias de sinalização de desenvolvimento podem dirigir a diferenciação de células estaminais pluripotentes para o destino fenotípica desejada. Muitos protocolos têm sido desenvolvidos para gerar cardiomiócitos (CMS) a partir de células estaminais pluripotentes 6-14. Estes protocolos geralmente envolvem a modulação da superfamília TFGβ (Activina, BMP e TGF-p) e percursos através de adição atempada de factores exógenos de crescimento e / ou pequenas moléculas 10,12-15 Wnt. Estes protocolos são geralmente eficazes no aumento da percentagem de células que se tornam CMS, mas carecem de especificidade, produção de uma população mista de células que representam linhagens atrial, ventricular, e sistema nodal / condução. A fim de estudar cardíaca específica subtipos A appro diferenciação mais direcionadoACH é necessária. Gremlin2 (Grem2, também chamada proteína relacionada com Dan e Cerberus ou CRS para o short) é um antagonista secretado BMP que é necessário para a diferenciação cardíaca adequada e formação de câmara atrial durante o desenvolvimento cardíaco em zebrafish 16. Tratar a diferenciação de células estaminais embrionárias com Grem2 diferenciação no dia 4, imediatamente depois do pico de expressão dos marcadores de mesodermal t-brachyury e Cerberus como 1, aumenta o rendimento de CMS e gera um conjunto de células predominantemente da linhagem auricular 14. Grem2 recombinante é utilizado para tratar as células de diferenciação e pode ser feita usando técnicas de produção de proteínas padrão 17 ou podem ser adquiridos comercialmente. É altamente solúvel em soluções aquosas e pode ser adicionado exogenamente para culturas no ponto de tempo desejado. A diferenciação pode ser rastreado usando RT-qPCR para quantificar a expressão de um representante marcadoresde progenitores cardiovasculares, progenitores cardíacos e comprometido CMs. Imunofluorescência também pode ser utilizado para identificar e visualizar a distribuição espacial dos tipos de células cardíacas. As aplicações que requerem populações puras são mais facilmente realizado quando se utiliza um sistema repórter para identificar e isolar CMS. Para esse efeito, nós introduzimos a αMHC-DsRedNuc construir na linha de células de rato CGR8 ES 14. CGR8 células pluripotentes permanecem crescer e sem células alimentadoras, facilitando de expansão e de diferenciação 18 ensaios. A linha de células ES contém uma sequência de codificação de proteína fluorescente DsRed com um sinal de localização nuclear sob a alfa-específico cardíaco Miosina Cadeia Pesada (a Mhc ou Myh6) promotor do gene. Usando essas células, o CMS pode ser facilmente identificado e isolado para a quantificação, separação de células, eletrofisiologia, telas de drogas, e estudando mecanismos de diferenciação atrial.

<table><tbody><tr><td>GMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11710</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td></td> ESG1107-Mercaptoetanol <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Sigma</td><td>I3390</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Cultura de Tecidos de 10 cm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri Bacterianas de 10 cm</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri Bacterianas de 6 cm</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Cultura de Tecidos de 6 poços</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>Gremlin 2 proteína recombinante</td><td>R& AMP; D Systems</td><td>2069-PR-050</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtro estéreis</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-741-02</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina (de pele suína)</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS, Estéril</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>Solução Sigma</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>0,05% de tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>Life Technologies</td><td>14200</td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciação de atrial cardiomyocytes de células-tronco pluripotentes usando o bmp antagonista grem2

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Protocolos para a produção de populações de cardiomiócitos a partir de células estaminais pluripotentes têm sido desenvolvidos, mas estes em geral produzem fenótipos de células misturadas. Os pesquisadores interessados ​​em prosseguir estudos envolvendo subtipos miócitos específicas requerem uma abordagem diferenciação mais direcionado. Por tratamento de células estaminais embrionárias de ratinho (ES) com Grem2, um antagonista de BMP segregada que é necessário para a formação da câmara atrial in vivo, um grande número de células cardíacas com um fenótipo fibrilação pode ser gerado. A utilização da linha de células estaminais pluripotentes engenharia Myh6-DsRED-Nuc permite a identificação, selecção e purificação de cardiomiócitos. Neste protocolo de corpos embrióides são geradas a partir de células-Myh6 DsRED-Nuc, utilizando o método de gota suspensa e mantido em suspensão até ao dia diferenciação 4 (D4). Em células D4 são tratados com Grem2 e plaqueadas em placas revestidas com gelatina. Entre D8-D10 grandes áreas contratantes são observados nas culturas e continuar a expandir e mAture através d14. Molecular, as análises histológicas e electrophysiogical indicam células em células tratadas com Grem2 adquirir características atriais-como fornecendo um modelo in vitro para estudar a biologia dos cardiomiócitos atriais e a sua resposta aos vários agentes farmacológicos.

Antes de diferenciação, as células estaminais pluripotentes deve ser compacta e isenta de diferenciação espontânea. As células mostrados na Figura 1A está pronto para ser singularizados e usado para pendurar gotas, tal como descrito no ponto 5.1 da secção de protocolo. As células mostradas na Figura 1B estão diferenciação espontânea e não deve ser utilizada para a preparação de gotas de suspensão. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

A geração de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes in vitro permite o acesso a grandes quantidades de tecido cardíaco in vitro para ciência básica e aplicações clínicas. Este protocolo utiliza o fator atrializante Grem2 tanto para aumentar o número de cardiomiócitos obtidos quanto para gerar cardiomiócitos com fenótipo atrial.

Diferenciação de Atrial Cardiomyocytes de células-tronco pluripotentes Usando o BMP Antagonista Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

O objetivo geral deste protocolo de diferenciação é gerar populações homogêneas de cardiomiócitos atriais em cultura. Portanto, esse método pode ajudar a responder a questões-chave no estudo do desenvolvimento cardíaco e doenças cardíacas, como arritmia atrial. As principais vantagens dessa técnica são que ela produz culturas homogêneas de cardiomiócitos atriais in vitro e pode ser feita com treinamento mínimo.Até quatro dias antes de configurar as células-tronco embrionárias de camundongo, ou culturas mESC, codifique placas de tecido de 10 centímetros com 5 mililitros de solução de gelatina a 0,2% cada, em seis placas de poço com 1 mililitro de gelatina por poço em uma capa de cultura de tecidos esterilizada. No dia da cultura, remova a solução extra de gelatina e adicione 10 mililitros de meio a um dos pratos de 10 centímetros revestidos com gelatina. Em seguida, use criotônicos para girar suavemente um frasco de 1 vezes 10 elevado a 6 mESCs em banho-maria de 37 graus Celsius até que apenas um pequeno cristal de gelo permaneça no centro do frasco.Seque o frasco com um pano descartável e sem fiapos e esterilize-o com etanol a 70%. Em seguida, coloque o frasco na capa de cultura de tecidos e use uma pipeta P1000 para adicionar os ESCs ao prato. Coloque as células em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e mova suavemente a placa da frente para trás e de um lado para o outro para distribuir uniformemente as células.No final da incubação, use um microscópio de campo claro para confirmar a fixação da célula. Alguns detritos e células mortas serão observados. Substitua o meio por 10 mililitros de meio mESC fresco e retorne as células à incubadora.Quando a cultura estiver 60 a 70% confluente, enxágue a placa com 5 mililitros de DPBS estéril sem magnésio e cálcio e incube as células em 2 mililitros de tripsina EDTA a 37 graus Celsius por cinco minutos. Enquanto as células estão incubando, aspire o excesso de solução de gelatina de um novo prato de 10 centímetros por cultura passada e adicione 10 mililitros de meio a cada prato. Em seguida, colete as células destacadas por centrifugação em um tubo de 15 mililitros e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio mESC.Dependendo da proporção de divisão desejada, adicione 0,5 a 1 mililitro de suspensão celular a cada prato de 10 centímetros e retorne as células à incubadora, distribuindo suavemente as células em cada prato, conforme demonstrado. Quando as células passadas estiverem 70% confluentes, separe-as com tripsina EDTA como acabamos de demonstrar e, em seguida, ressuspenda a suspensão unicelular em 5 mililitros de corpo embrióide ou meio EB. Conte os mESCs e dilua-os no volume apropriado de meio EB até uma concentração final de 2,5 vezes 10 elevado à 3ª célula por mililitro.Em seguida, adicione 2 mililitros de PBS ao fundo de uma placa de Petri bacteriana estéril de 10 centímetros por cultura de gota suspensa e transfira a suspensão EB para uma bacia de solução estéril. Agora, retire a tampa de um dos pratos preparados e use uma pipeta multicanal, equipada com seis pontas, para depositar cuidadosamente 60 gotas de 20 microlitros de suspensão EB na superfície interna. Coloque delicadamente a tampa de volta no prato, tomando cuidado para não desalojar as gotas penduradas e coloque os pratos na incubadora de cultura de células por dois dias.Para lavar os EBs, remova cuidadosamente a tampa da cultura de gota pendurada e incline-a em um ângulo de 45 graus. Em seguida, usando uma pipeta sorológica de 5 mililitros contendo meio EB em temperatura ambiente, lave suavemente os EBs em uma poça na parte inferior da tampa. Inspecione cuidadosamente a tampa para ver se há EBs presos à superfície e, em seguida, transfira os EBs para uma placa de Petri de 6 centímetros sem revestimento.Devolva os EBs à incubadora de cultura de tecidos por mais dois dias, verificando as placas diariamente quanto à agregação e fixação de EB. Antes de revestir os EBs, substitua o excesso de solução de revestimento de gelatina em cada poço da placa de seis poços preparada, por 2 mililitros de meio de tratamento Grem2 recém-preparado em temperatura ambiente. Em seguida, use uma pipeta P1000 ajustada para 100 microlitros para transferir 30 EBs para cada poço e, em seguida, retorne a placa para a incubadora durante a noite, dispersando uniformemente as células com movimentos suaves, conforme demonstrado.Depois que os EBs estiverem presos ao fundo dos poços, substitua o meio Grem2 a cada dois dias até o dia 10. Em seguida, alimente as células com meio EB fresco a cada dois dias para manter uma cultura de células saudável. Antes de sua cultura de gotas suspensas, as células-tronco pluripotentes devem ser compactas e livres de diferenciação espontânea.Se for observada diferenciação espontânea, as células não devem ser usadas nas culturas de gotas suspensas. O EB de qualidade geralmente é melhor formado em gotas suspensas uniformemente espaçadas e bem arredondadas. No segundo dia de diferenciação, os EBs devem ser visíveis a olho nu, como arranjos esféricos de células-tronco diferenciadoras nas pontas das gotas penduradas.No quarto dia, EBs bem formados devem flutuar livremente e homogêneos em tamanho e forma. Uma vez plaqueados, os EBs se achatarão à medida que as células migram do EB para a superfície da placa de cultura de tecidos, conforme observado aqui nos dias oito e 10 de diferenciação. Em poços de controle não tratados, pequenas manchas de contração lenta são observadas já no sexto dia e no nono dia.Enquanto em poços tratados com Grem2, grandes manchas com uma taxa de contração relativamente rápida são comuns. A análise RT-QPCR da expressão gênica nas células diferenciadas normalmente revela altos níveis de genes estruturais e regulatórios cardíacos em culturas tratadas com Grem2. Se a linha celular nuclear alfa-MHC DsRed for usada, o aumento do rendimento de cardiomiócitos é observado como um número maior de núcleos marcados com DsRed nos poços tratados com Grem2.O tratamento com Grem2 também influencia a diferenciação em direção a um fenótipo semelhante ao atrial, conforme confirmado por medições de RT-QPCR e patch clamp da duração do potencial de ação celular. Uma vez dominadas, as células-tronco diferenciadoras podem ser tratadas com Grem2 em menos de 60 minutos e as células beading geralmente são observadas já no sétimo dia. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de adicionar Grem2 consistentemente no quarto dia após o pico de expressão de marcadores de gastrulação, como braquiúria.Após este procedimento, outros métodos como eletrofisiologia e QPCR podem ser realizados para entender as características funcionais e moleculares das células que foram geradas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar cardiomiócitos atriais a partir de ESCs de camundongos, usando Grem2.

differentiation-atrial-cardiomyocytes-from-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Nós estabelecemos um protocolo para indução de cardioblasts direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores cardíaca e funcional cardiovascular cardiomiócitos para reparação.

Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

Células-tronco pluripotentes, tanto as células-tronco embrionárias ou pluripotentes induzidas (iPS), constituem uma valiosa fonte de células diferenciadas humanos, incluindo os cardiomiócitos. Aqui, vamos nos concentrar na indução cardíaco de células iPS, mostrando como usá-los para obter os cardiomiócitos humanos funcionais através de um protocolo de corpos baseada embryoid.

Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

O artigo descreve a metodologia detalhada para diferenciar de forma eficiente as células estaminais pluripotentes em cardiomiócitos de modular selectivamente a via Wnt, seguido por análise de citometria de fluxo de marcadores de referência para avaliar a homogeneidade e a identidade da população.

Diferenciação de alta eficiência de pluripotentes humanas células-tronco para Cardiomyocytes e Caracterização por citometria de fluxo

Neste protocolo, será ilustrada a derivação de células progenitoras cardíacas de células-tronco embrionárias de camundongos e humanos. Uma estratégia importante neste protocolo é enriquecer as células progenitoras cardíacas com citometria de fluxo usando repórteres fluorescentes projetados nas linhagens de células-tronco embrionárias.

Derivação de Cardiac células progenitoras de células estaminais embrionárias

Aqui, apresentamos um protocolo robusto, rápido e escalável de diferenciação de cardiomiócitos para células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Os cardiomiócitos derivados usando este método em larga escala podem fornecer números de células suficientes para seu uso efetivo na modelagem de doenças cardiovasculares humanas, triagem de medicamentos de alto rendimento e aplicações potencialmente clínicas.

Produção em larga escala de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas utilizando um altamente reprodutível pequeno-Based Molecule Protocolo de Diferenciação

Este manuscrito descreve um protocolo passo a passo para a geração e quantificação de diversos subtipos cardíacos reprogramados usando uma entrega mediada por retrovírus de Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5.

Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos

A caracterização eletrofisiológica de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC-CMs) é crucial para a modelagem de doenças cardíacas e para a determinação de respostas de fármacos. Este protocolo fornece as informações necessárias para dissociar e plaquear hPSC-CMs em matrizes de múltiplos eléctrodos, medir o seu potencial de campo e um método para analisar os intervalos QT e RR.

Análise eletrofisiológica de cardiomiócitos humanos derivados de células-tronco pluripotentes (hPSC-CMs) usando matrizes de múltiplos eletrodos (MEAs)

Aqui, apresentamos um método para eficientemente aproveitar o potencial de diferenciação cardíaca da jovens fontes de células-tronco mesenquimais humanas a fim de gerar células funcionais, contratantes, casos, como in vitro.

In Vitro Diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas em células casos funcionais

O objetivo deste método é gerar células progenitoras cardíacas específicas do campo cardíaco in vitro para estudar a especificação de células progenitoras e propriedades funcionais, e para gerar células cardíacas específicas de câmara para modelagem de doenças cardíacas.

In vitro geração de células progenitoras cardíacas específicas do coração do rato

Este método pode ser usado para examinar o encurtamento do sarcomere usando cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco com proteínas de sarcomere marcadas por fluorescentes.

Encurtamento sarcomere de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes usando Proteínas Sarcomere marcadas por fluorescentes.

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar e expandir robustamente os cardiomiócitos humanos a partir de células mononucleares de sangue periféricos do paciente.

Geração e Expansão de Cardiomiócitos Humanos a partir de células mononucleares de sangue periféricos do paciente

Aprenda a diferenciar cardiomiocitos atriais a partir de células-tronco pluripotentes usando o antagonista BMP Grem2. Este protocolo produz populações homogêneas para pesquisa em arritmias atriais.

Diferenciação de Atrial Cardiomyocytes de células-tronco pluripotentes Usando o BMP Antagonista Grem2

Explorar mais vídeos