Usando uma técnica de estratificação para executar microscopia confocal da esclera humana

O objetivo geral desta metodologia é realizar microscopia confocal da esclera humana. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo oftalmológico. Como a distribuição de células imunes e o estado vascular nos saudáveis, e as condições patológicas na esclera.

A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a imagem confocal do tecido conjuntivo denso. Demonstrando o procedimento estará Stefan Kremers, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Para começar, prepare 96% de etanol e PBS em tubos individuais.

Em seguida, prepare 100 microlitros por amostra dos anticorpos primários na diluição recomendada de PBS contendo dois por cento de BSA e mantenha todas as soluções no gelo. Organize instrumentos limpos, incluindo uma a duas pinças Colibri, tesouras de microdissecação retas, tesouras curvas, um bisturi número 10 ou micro pena de bisturi oftálmico, quatro agulhas de calibre 26 e um cotonete. Enrole papel alumínio em torno de uma placa de poliestireno ou prepare uma placa de cortiça para fixar o tecido.

Depois de produzir um bulbo aberto anteriormente de acordo com o protocolo de texto, coloque a esclera em um cotonete com a parte aberta voltada para cima. Em seguida, use uma pinça colibri para remover a retina e as camadas uveais pigmentadas da esclera interna até que a esclera esteja livre dessas camadas. Em seguida, use uma tesoura curva, se necessário, para remover a retina e a úvea da papila.

Em seguida, remova a conjuntiva restante, os músculos extra-ovulares e a cápsula de espigas da esclera superficial. Agora, usando pinças colibri para segurar suavemente o tecido, com tesouras retas cortam amostras esclerais de aproximadamente dois centímetros quadrados de diferentes locais do tecido, evitando agarramentos repetidos com a pinça, o que tornará a área inadequada para microscopia confocal. Coloque as amostras em tubos de 1,5 mililitro, adicione 1,5 mililitros de etanol a 96% e incube por 15 minutos para fixar o tecido.

Em seguida, depois de remover o etanol, use 1,5 mililitros de PBS para lavar as amostras três vezes por cinco minutos cada, agitando. Em seguida, transfira as amostras para 1,5 mililitros de PBS com cinco por cento de BSA e incube em temperatura ambiente por duas horas, o que induzirá o inchaço das amostras, para ajudar na laminação e evitar ligações inespecíficas. Quando as amostras estiverem inchadas, sob um microscópio estereobinocular, use agulhas de calibre 26 que foram dobradas nas bordas para fixar as amostras esclerais posteriores na membrana de poliestireno envolta em folha ou placa de cortiça.

Em seguida, para laminar as amostras de espessura total, use uma pinça colibri para segurar horizontalmente a borda anterior do tecido escleral. Com um bisturi número 10, corte cuidadosamente uma camada o mais fina possível da esclera superficial, da camada subjacente. Para evitar que o tecido seque, pipete 50 microlitros de PBS nas camadas.

Depois que as camadas forem cortadas, coloque-as em 100 microlitros de PBS em uma placa de 96 poços e use um marcador à prova d'água para rotular a orientação e a camada. Continue a isolar as camadas e transfira para a placa de 96 poços até que o tecido esteja totalmente laminado. Para realizar a imuno-histoquímica, remova o meio da placa de 96 poços segurando a pipeta contra a parede de cada poço e aspirando o fluido.

Em seguida, adicione 100 microlitros dos anticorpos primários diluídos de um a 100 em PBS com dois por cento de BSA aos poços apropriados e incube a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, use de 200 a 300 microlitros de PBS para lavar as amostras em um shaker três vezes por cinco minutos cada. Se necessário, use outro anticorpo primário e incube novamente durante a noite a quatro graus Celsius.

Em seguida, adicione 100 microlitros dos anticorpos secundários correspondentes, diluídos de um a 300 em PBS com dois por cento de soro de cabra, e incube no escuro em temperatura ambiente por uma a duas horas. Após a incubação, use 200 a 300 microlitros de PBS para enxaguar as amostras novamente no agitador três vezes por cinco minutos cada. Em seguida, adicione 100 microlitros de uma diluição de um a 2000 DAPI a cada poço e incube no escuro à temperatura ambiente.

Antes de usar 200 a 300 microlitros de PBS para lavar as amostras duas vezes. Transfira as amostras para lâminas de microscópio sob o microscópio estereobinocular para certificar-se de que a amostra está deitada na lâmina e adicione uma a duas gotas de meio de montagem fluorescente. Em seguida, coloque uma lamínula por cima e use esmalte transparente para selar as bordas.

Armazene no escuro a quatro graus Celsius para uso posterior ou examine diretamente por microscopia confocal. Para verificar a espessura das amostras, pegue pilhas z, pois a espessura difere equatorial e posteriormente, dependendo da localização escleral. Essas imagens mostram a rede diversificada do plexo dos vasos sanguíneos na esclera humana laminada derivada da episclera anterior e posterior.

Os vasos sanguíneos são positivos para CD31, conforme mostrado em verde. Nesta figura, são ilustradas as células imunes positivas para LYVE1 da episclera e sua relação com os vasos sanguíneos positivos para CD31. A série z-stack foi feita com ampliação de 10x para examinar as relações tridimensionais dos vasos sanguíneos e das células imunológicas.

Como mostrado aqui, os músculos extra-oculares envolvidos na esclera também podem ser analisados quanto à presença de vasos sanguíneos ou células imunes, usando os marcadores CD31 e LYVE1, respectivamente. Uma vez dominada, a técnica de laminação pode ser feita em menos de uma hora se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar que o tecido seque.

Não se esqueça de que trabalhar com tecido humano pode ser potencialmente infeccioso e precauções como diagnósticos microbiológicos e virológicos devem sempre ser tomadas com antecedência.