Name: Usando uma técnica de estratificação para executar microscopia confocal da esclera humana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Aprenda microscopia confocal da esclera humana usando técnica de estratificação para estudar distribuição de células imunes e status vascular em condições saudáveis e patológicas. Este método avança a pesquisa em oftalmologia.

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German Research Foundation (FOR2240 "Angiogênese (linfática) e imunidade celular em doenças inflamatórias do olho" para CC e LMH; HE 6743/2-1 e HE 7643/3-1 para LMH; CU47/6-1 para CC), German Cancer Aid (para LMH e CC), programa GEROK da Universidade de Colônia (para SLS e LMH) e EU COST BM1302 "Unindo Forças para a Regeneração da Córnea" (para CC).

O uso de tecidos humanos devem ser revistos e aprovados por um conselho de revisão institucional ou equivalente. O trabalho aqui descrito foi aprovado pelo comitê de ética local e teve a aprovação para análise científica. Este trabalho foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinki. Os espécimes esclerais humanos foram obtidos a partir dos olhos de doadores globo (máximo de post-mortem de tempo de 24 horas), no Banco de Olhos do Departamento de Oftalmologia da Universidade de Colônia, Alemanha. 1. Preparação Experimental <ol><li> Preparar 96% de etanol e salino tamponado com fosfato (PBS) em diferentes tubos. Prepare os anticorpos primários na diluição recomendada de PBS contendo 2% de albumina de soro bovino (BSA) e manter todas as soluções em gelo. Preparação de 100 ul por amostra. </li><li> Limpe todos os instrumentos e usar bisturis afiados. Depois de repetido o mesmo corte com bisturi, alterar o bisturi. </li><li> Obter 1-2 forceps Colibri, micro tesouras de dissecação em linha reta, um bisturi # 10ou bisturi oftálmico micro pena, e quatro 26 agulhas G. </li><li> Enrole a folha de alumínio em torno de uma placa de poliestireno ou usar uma placa de cortiça para fixar o tecido. Trabalhar debaixo de um microscópio estéreo binocular. Trabalhar estéril debaixo de um fluxo de ar laminar, se necessário. </li></ol> 2. Prepare a esclera <ol><li> Pressione cuidadosamente a lâmpada e executar uma trepanação perfurante por parte córneo, e gire o trepan. Gire o trepan cuidadosamente e uniformemente sobre a superfície para realizar um corte igualmente rodada. Use um trepan tamanho 15,5 mm. Cortar os acessórios restantes com tesoura curva. Remova a trepanação córneo. Isto irá resultar em uma lâmpada anteriormente aberto. <ol><li> Coloque a esclera em um cotonete com a parte aberta para cima. Remova a retina e úvea, usando uma pinça colibri de retirar as duas camadas (retina e Uvea) da esclera. Não deixe a úvea pigmentada na esclera interior. Use tesoura curva para remover a retina e da úvea papila. Remover o REMaining conjuntiva, músculos extra-oculares, e da cápsula de Tenon da esclera superficial. </li></ol></li><li> Retirar a amostra escleral no tamanho necessário utilizando-tipo reto tesouras e fórceps Colibri. Tome cerca de 2 cm2 amostras esclerais porte de diferentes locais. Por causa do tamanho pequeno, segurar a esclera suavemente e cortar o tamanho exigido, quadrados usando os do tipo reta tesoura. A trepanação córneo define a margem anterior das amostras esclerais. <ol><li> Evitar repetido agarrando com a pinça como a área onde o tecido foi agarrado não é adequado para análise de microscopia confocal. Prepara-se o número necessário de amostras, dependendo do tipo de experiência (por exemplo, vs anteriormente posteriormente, comparar Figura 1) e a quantidade de anticorpos utilizada. </li></ol></li><li> Coloque as amostras em tubos de 1,5 ml para uso posterior. Fixar as amostras em 1,5 ml de etanol a 96% durante 15 minutos, e, em seguida, lavá-los três vezes cada durante 5 minem 1,5 ml de PBS no agitador. Se trabalhar com tecido congelado, execute essa etapa antes pressão congelamento. </li><li> Use tecido fresco. No entanto, se isso não for possível, pressão congelar a esclera em azoto líquido e mantê-lo a -20 ° C para uso posterior. Se trabalhar com tecido congelado, descongelar antes de usar. Evite o descongelamento repetido e ciclos de congelamento. </li><li> Manter cada amostra em PBS contendo 1,5 ml de BSA a 5% à temperatura ambiente durante 2 h. Este passo induz um aumento de volume da amostra, que é útil para a laminação e também previne a ligação inespecífica. </li><li> Depois que as amostras têm aumentado, preparar as praças esclerais para laminação. Trabalhar sob um microscópio, por exemplo, um microscópio estéreo binocular. Apor as amostras esclerais posteriores à membrana de poliestireno embrulhados em papel alumínio ou a placa de cortiça utilizando os 26 g de agulhas. </li><li> Dobrar as extremidades das agulhas, de forma que não interfiram com o campo visual sob o microscópio. </li><li> Laminar o SAMP escleral de espessura totalles. <ol><li> Primeiro, mantenha a borda escleral anterior usando uma pinça Colibri. Em seguida, cuidadosamente cortar uma fina camada superficial da esclera usando o bisturi # 10, o bisturi oftálmica micro pena, ou uma lâmina de uma espátula. Segurar o bisturi horizontalmente e cortar a camada superficial tão fina quanto possível, a partir da camada subjacente. </li><li> Dissecar uma camada fina escleral da praça escleral. Este método é semelhante às técnicas cirúrgicas convencionais para preparar uma aba durante trabeculectomia e deve resultar em camadas de espessura de 30-80 ^ m (comparar com a figura 2). </li></ol></li><li> Evitar a secagem da esclera pela adição de pequenas quantidades de PBS para o tecido, por exemplo, 50 ul de PBS utilizando uma pipeta. </li><li> Coloque as camadas cortadas em 100 ul de PBS na placa de 96 poços e rotular tanto a orientação (no sentido externo e interno) e a camada (superficial e profunda), por exemplo com uma cor à prova de água. </li><li> Repita os passos 2,7-2,9 até que o tecido está completamente laminado. &lt;/ Li&gt; </ol> 3. Execute Imunohistoquímica <ol><li> Adicionar 100 ul de anticorpos primários necessários para a diluição recomendada. Aqui, por exemplo, utilização de CD 31 LYVE1 anticorpo (anti-humano de coelho) (monoclonal de ratinho anti-humano) e, tanto em uma diluição de 1: 100 em PBS (contendo 2% de BSA) e incubar a 4 ° C durante a noite. Para alterar a forma da placa de 96 poços, segurar a pipeta para a parede do poço e remover o fluido. </li><li> No dia seguinte, as amostras de lavar três vezes cada durante 5 min com 200-300 ul de PBS no agitador. Adicionar 100 uL de anticorpos secundários correspondentes; aqui usar de cabra anti-rato fluoresceína isotiocianato (FITC) anti-coelho de cabra e corantes de cianina 3 (Cy3), e incuba-se as amostras à temperatura ambiente durante 1-2 horas. Dilui-se a anticorpos secundários 1: 300 em PBS contendo soro de cabra a 2%. </li><li> Lavar as amostras novamente três vezes cada durante 5 minutos em 200-300 ul de PBS no agitador. </li><li> Realização da coloração núcleo, por exemplo, </em&gt;. 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (diluição 1: 2.000, 100 ul em cada poço e incubar 10 min à temperatura ambiente), depois lavar novamente 2 vezes em 200-300 ul de PBS no agitador. </li><li> Transferir as amostras em lâminas de microscópio, incorporá-los em 1-2 gotas de meio de montagem fluorescente, adicionar uma lamela, selá-lo, cobrindo as bordas com verniz transparente, e armazenar a 4 ° C para uso posterior ou examinar diretamente os slides com a confocal microscópio. </li><li> Usar um microscópio confocal (ou equivalente) para analisar as amostras. Use a ampliação desejada, por exemplo 10-40X ampliação. </li><li> Para verificar a espessura das amostras, medida com microscopia confocal usando Z-pilhas. A quantidade de possíveis secções esclerais depende da localização da esclerótica, tal como a espessura difere equatorial e posterior (comparar introdução). </li></ol>

<ol><li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+lymphatic+vessel+endothelial+hyaluronan+receptor+1+%28LYVE1%29-positive+macrophages+around+blood+vessels+in+the+normal+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).</li>
<li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+lymphatic+vessels+in+the+developing+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera.</a> Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).</li>
<li>Hos, D., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+vessels+in+the+development+of+tissue+and+organ+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Anat+Embryol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).</li>
<li>Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. M., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antilymphangiogenic+therapy+to+promote+transplant+survival+and+to+reduce+cancer+metastasis%3A+what+can+we+learn+from+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Antilymphangiogenic therapy to promote transplant survival and to reduce cancer metastasis: what can we learn from the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. , (2014).</li>
<li>Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+privilege+as+the+result+of+local+tissue+barriers+and+immunosuppressive+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments.</a> Curr Opin Immunol. 5 (3), 428-432 (1993).</li>
<li>Streilein, J. W., Niederkorn, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+anterior+chamber-associated+immune+deviation+requires+an+intact%2C+functional+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of anterior chamber-associated immune deviation requires an intact, functional spleen.</a> J Exp Med. 153 (5), 1058-1067 (1981).</li>
<li>Streilein, J. W., Yamada, J., Dana, M. R., Ksander, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+chamber-associated+immune+deviation%2C+ocular+immune+privilege%2C+and+orthotopic+corneal+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Anterior chamber-associated immune deviation, ocular immune privilege, and orthotopic corneal allografts.</a> Transplant Proc. 31 (3), 1472-1475 (1999).</li>
<li>Keeley, F. W., Morin, J. D., Vesely, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+collagen+from+normal+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of collagen from normal human sclera.</a> Exp Eye Res. 39 (5), 533-542 (1984).</li>
<li>Lee, R. E., Davison, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+composition+and+turnover+in+ocular+tissues+of+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Collagen composition and turnover in ocular tissues of the rabbit.</a> Exp Eye Res. 32 (6), 737-745 (1981).</li>
<li>Moses, R. A., Grodzki, W. J., Starcher, B. C., Galione, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+content+of+the+scleral+spur%2C+trabecular+mesh%2C+and+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Elastin content of the scleral spur, trabecular mesh, and sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 17 (8), 817-818 (1978).</li>
<li>Foster, C. S., Sainz de la Maza, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFoster%2C+CS+%22The+sclera%22">The sclera</a>. , Springer. (2012).</li>
<li>Kiss, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Der+Blutkreislauf+des+Auges%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Der Blutkreislauf des Auges.</a> Ophthalmologica. 106, 225(1943).</li>
<li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+Schlemm%27s+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+Part+I.+Aqueous+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. Part I. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 35 (5), 291-303 (1951).</li>
<li>Ashton, N., Smith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+Schlemm%27s+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+III.+Arterial+relations+of+Schlemm%27s+canal%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. III. Arterial relations of Schlemm's canal.</a> Br J Ophthalmol. 37 (10), 577-586 (1953).</li>
<li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+Schlemm%27s+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts+II.+Aqueous+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts II. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 36 (5), 265-267 (1952).</li>
<li>Hayreh, S. S., Scott, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+iris+angiography.+II.+Disturbances+in+iris+circulation+following+strabismus+operation+on+the+various+recti%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Fluorescein iris angiography. II. Disturbances in iris circulation following strabismus operation on the various recti.</a> Arch Ophthalmol. 96 (8), 1390-1400 (1978).</li>
<li>Virdi, P. S., Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+segment+ischemia+after+recession+of+various+recti.+An+experimental+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Anterior segment ischemia after recession of various recti. An experimental study.</a> Ophthalmology. 94 (10), 1258-1271 (1987).</li>
<li>Bron, A. J., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+angiography+of+the+globe+and+anterior+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Ophthalmol+Soc+U+K%22%5BJournal%5D)">Fluorescein angiography of the globe and anterior segment.</a> Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).</li>
<li>Ikegami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+angiography+of+the+anterior+ocular+segment.+Part+1.+Hemodynamics+in+the+anterior+ciliary+vessels+%28author%27s+transl%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nihon+Ganka+Gakkai+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author's transl).</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).</li>
<li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LYVE-1%2C+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein%2C+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).</li>
<li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries%3A+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver divulgações financeiras. O conteúdo deste artigo é de responsabilidade exclusiva dos autores.

Laminar a esclerótica humana é um método para a realização de microscopia confocal sobre este tecido. Um passo essencial neste processo é a utilização de etanol em vez de formalina para a aposição do tecido. Em nossa experiência, os melhores resultados são obtidos quando se utiliza etanol em vez de formol para fixação. bisturis Blunt agravar o processo e devem ser evitadas. Da mesma forma, a secagem da esclera deve ser evitado, uma vez que complica o processo e reduz a qualidade das imagens. ...

A esclerótica é a camada externa rígida que cobre o olho, o que é feito de tecido conjuntivo denso. Isso ajuda a proteger as estruturas intra-oculares e para manter a pressão intra-ocular. Assim, a esclerótica é essencial para a visão clara. É desprovida de vasos linfáticos 1,2 e, assim, forma uma borda livre-linfática exterior entre ele e o olho interior livre de linfático 3-7. Ele também fornece locais de ligação para os músculos extra-oculares, partilhando assim semelhanças anatômicas com tendões. Porque a esclera consiste principalmente de feixes densos de colágeno tipo I e tem um número menor de colágeno tipo III, IV, V, VI, VIII 8,9 e elastina 10,11, este tecido não é fácil de usar para imuno-histoquímica. Anatomicamente, a esclerótica podem ser separadas em três camadas principais: (1) o episclera vascularizado superficial, localizado por debaixo da conjuntiva e da cápsula de Tenon e para os lados e the parte de trás do olho de frente para a órbita; (2) o estroma escleral, a parte principal da esclera; e (3) o fusca lâmina, que é uma camada fina, pigmentada localizada directamente acima da úvea. Nosso conhecimento anatômico sobre a esclera decorre, principalmente, da primeira metade do século 20. Naquela época, os investigadores estudaram a anatomia da vasculatura principalmente usando Índia injeções de tinta 12 e vascular lançando 13-15. Mais tarde, foi pesquisado em estudos angiográficos 16-19. Desde então, técnicas mais antigas foram melhoradas e novos foram desenvolvidos que nos permitiram completar conhecimento anatômico anterior. Por exemplo, tem sido apenas cerca de uma década desde que nós tivemos tais marcadores linfáticos confiáveis ​​como endotélio vascular linfática hyaluronan específica receptor-1 (LYVE1) 20 ou podoplanina 21. A microscopia confocal oferece novas possibilidades para o estudo das características anatômicas dos diferentes tissues do olho. Ele permite várias manchas a ser utilizada para diferenciar os marcadores de células ou para a localização das células em relação aos vasos sanguíneos e outras estruturas anatómicas. Ele fornece uma visão geral, quando a amostra é de um tamanho maior e permite-nos verificar através de uma amostra, quando em busca de um tipo de célula específico. Com a tecnologia Z-Pilha, microscopia confocal pode ser utilizado para as amostras até 100-200 um. A esclerótica difere de espessura entre 0,3 mm por trás das inserções musculares e 1 mm no pólo posterior 11. Devido tanto a sua espessura e opacidade, a esclera não é adequado para microscopia confocal utilizando métodos tradicionais. Para remediar esta situação, tecidos esclerais foram estratificados para permitir a sua análise com microscopia confocal. Esta tecnologia é útil para obter uma melhor compreensão de ambas as situações fisiológicas e patológicas na esclera humana.

<table><tbody><tr><td>96% etanol</td><td>Merck Chemicals, Darmstadt, Alemanha</td><td>P075.4</td><td></td></tr><tr><td>microscópio estéreo binocular&nbsp;</td><td>Motic, Hong Kong, China</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>26 G agulhas&nbsp;</td><td>Terumo, Leuven, Bélgica</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>15.5 mm trepan</td><td>Geuder, Heidelberg, Alemanha</td><td>n.a no.10</td><td></td></tr><tr><td>bisturi;</td><td>Pena, pfm medical, Osaka, Japão</td><td>2E+08</td><td></td></tr><tr><td>bisturi oftálmico micro pena&nbsp;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japão</td><td>no. 7657BR</td><td></td></tr><tr><td>CD 31 anticorpo (camundongo monoclonal anti humano)</td><td>Dako, EUA</td><td>IR610</td><td></td></tr><tr><td>LYVE1 anticorpo&nbsp; (coelho policlonal anti humano)</td><td>Zytomed, Alemanha</td><td>RBK014-05</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo FITC de cabra anti-rato</td><td>Sigma Aldrich, Steinheim, Alemanha</td><td>F0257</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo Cy3 de cabra anti-coelho</td><td>Dianova, Alemanha</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Dako, Glostrup, Dinamarca</td><td>X090710-8</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha</td><td>6335.1</td><td></td></tr><tr><td>microscópio slides&nbsp;</td><td>Engelbrecht, Ederm&uuml; nde, Alemanha</td><td>WC7695002</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas 24 mm x 24 mm</td><td>Th. Gayer, Lohmar, Alemanha</td><td>7695026</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem fluorescente DAKO&nbsp;</td><td>DAKO, EUA</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>LSM Meta 510 microscopia confocal&nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, Jena, Alemanha</td><td>n.a</td><td></td></tr></tbody></table>

usando uma técnica de estratificação para executar microscopia confocal da esclera humana

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

A esclerótica é um tecido conjuntivo denso que cobre e protege o olho. Ela consiste principalmente de feixes de colágeno densas (tipos I, III, IV, V, VI e VII). Devido à sua autofluorescência, opacidade, e espessura, não foi considerado adequado para a microscopia confocal. Uma abordagem alternativa para o apresentado aqui, que utiliza esclera fixado com formalina embebido em parafina para imuno-histoquímica, tem desafios técnicos, especialmente quando o pré-aquecimento do tecido para a recuperação de antigénio. Desde a esclera é relativamente pobre em ambas as células e vasos, o uso de amostras de tecido maiores foi explorada para ajudar a evitar que as células com vista e para compreender a sua localização em relação aos navios e outros sítios anatômicos. Para permitir a análise de amostras de tecido maiores, sob o microscópio confocal, uma técnica de laminação foi efectuada para criar camadas finas da esclera. Após a análise dos resultados dos vasos sanguíneos CD31 e vasos linfáticos endotelial hyalureceptor Ronan 1 (LYVE1) células positivas, para o qual foi obtido uma autorização para exame científico, as vantagens e limitações deste método são discutidas.

Nas experiências representativas realizadas aqui, há benefícios demonstráveis ​​derivados da utilização desta técnica de laminação em particular. A primeira experiência ilustra a rede diversificada de plexo de vasos sanguíneos episcleral em três imagens representativas (Figura 3). Os vasos são positivas para CD31. O segundo experimento mostra células do sistema imunológico, em particular de células LYVE1 + do ...

O tecido da esclera humana é principalmente colágeno; portanto, não é facilmente utilizável para imuno-histoquímica. Para atingir o objetivo de realizar imuno-histoquímica para microscopia confocal de tecido escleral, foi utilizada a técnica de laminação.

Usando uma técnica de estratificação para executar microscopia confocal da esclera humana


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

O objetivo geral desta metodologia é realizar microscopia confocal da esclera humana. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da oftalmologia, como a distribuição de células imunes e o estado vascular em condições saudáveis e patológicas da esclera.A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a obtenção de imagens confocais de tecido conjuntivo denso. O procedimento será demonstrado por Stefan Kremers, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Para começar, prepare Etanol a 96 por cento e PBS em tubos separados.Em seguida, prepare 100 microlitros por amostra dos anticorpos primários na diluição recomendada em PBS contendo dois por cento de BSA, e mantenha todas as soluções em gelo. Organize instrumentos limpos, incluindo um ou dois fórceps Colibri, tesoura microcirúrgica reta, tesoura curva, uma lâmina número 10 ou lâmina microcirúrgica oftálmica tipo micro feather, quatro agulhas de calibre 26 e um cotonete. Envolva uma placa de poliestireno com papel alumínio ou prepare uma placa de cortiça para fixar o tecido.Após produzir uma esclera com abertura anterior conforme o protocolo descrito no texto, coloque a esclera sobre um cotonete com a parte aberta voltada para cima. Em seguida, utilize pinças de colibri para remover a retina e as camadas uveais pigmentadas da esclera interna até que a esclera esteja livre dessas camadas. A seguir, use tesouras curvas, se necessário, para remover a retina e a úvea da papila.Em seguida, remova a conjuntiva remanescente, os músculos extra-ovulares e a cápsula de Tenon da esclera superficial. Agora, usando pinça colibri para segurar suavemente o tecido, corte com tesoura reta amostras esclerais de aproximadamente dois centímetros quadrados de tamanho em diferentes locais do tecido, evitando segurar repetidamente com a pinça, o que tornará a área inadequada para microscopia confocal. Coloque as amostras em tubos de 1,5 mililitro, adicione 1,5 mililitro de etanol a 96 por cento e incube por 15 minutos para fixar o tecido.Em seguida, após a remoção do etanol, use 1,5 mililitro de PBS para lavar as amostras três vezes, durante cinco minutos cada, sob agitação. A seguir, transfira as amostras para 1,5 mililitro de PBS com 5% de BSA e incube à temperatura ambiente por duas horas, o que induzirá o inchamento das amostras, facilitando a laminação e prevenindo a ligação inespecífica. Quando as amostras tiverem inchado, sob um microscópio estereoscópico binocular, utilize agulhas de calibre 26 cujas pontas foram dobradas para fixar as amostras esclerais posteriores na membrana de poliestireno revestida com folha de alumínio ou em placa de cortiça.Em seguida, para laminar as amostras de espessura total, utilize pin&ccedil;as colibri para segurar horizontalmente a borda anterior do tecido escleral. Com um bisturi n&uacute;mero 10, corte cuidadosamente a camada mais fina poss&iacute;vel da esclera superficial, separando-a da camada subjacente. Para evitar que o tecido seque, pipete 50 microlitros de PBS sobre as camadas.Em seguida, após os cortes das camadas, coloque-as em 100 microlitros de PBS em uma placa de 96 poços e use uma caneta à prova d'água para identificar tanto a orientação quanto a camada. Continue isolando camadas e transferindo-as para a placa de 96 poços até que o tecido seja totalmente laminado. Para realizar a imuno-histoquímica, remova o meio da placa de 96 poços mantendo a pipeta encostada na parede de cada poço e aspirando o fluido.Em seguida, adicione 100 microlitros dos anticorpos primários diluídos na proporção de um para 100 em PBS com dois por cento de BSA nos poços apropriados e incube a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, utilize 200 a 300 microlitros de PBS para lavar as amostras em agitador, três vezes, por cinco minutos cada. Se necessário, utilize outro anticorpo primário e incube novamente durante a noite a quatro graus Celsius.Em seguida, adicione 100 microlitros dos anticorpos secundários correspondentes, diluídos um para 300 em PBS com dois por cento de soro de cabra, e incube no escuro à temperatura ambiente por uma a duas horas. Após a incubação, use 200 a 300 microlitros de PBS para lavar as amostras novamente no agitador, três vezes, por cinco minutos cada. Em seguida, adicione 100 microlitros de uma diluição um para 2000 de DAPI em cada poço e incube no escuro à temperatura ambiente.Antes de usar de 200 a 300 microlitros de PBS para lavar as amostras duas vezes. Transfira as amostras para lâminas de microscopia sob o microscópio estereoscópico binocular para garantir que a amostra esteja plana sobre a lâmina e adicione uma a duas gotas de meio de montagem fluorescente. Em seguida, coloque uma lamínula por cima e use esmalte incolor para selar as bordas.Armazene ao abrigo da luz a quatro graus Celsius para uso posterior ou examine diretamente por microscopia confocal. Para verificar a espessura das amostras, obtenha cortes em z, pois a espessura varia equatorial e posteriormente dependendo da localização escleral. Essas imagens mostram a rede diversificada dos plexos vasculares na esclera humana laminada derivada da epiesclera anterior e posterior.Os vasos sanguíneos são positivos para CD31, conforme mostrado em verde. Nesta figura, são ilustradas as células imunes positivas para LYVE1 da esclera e sua relação com os vasos sanguíneos positivos para CD31. A série de z-stacks foi obtida com aumento de 10x para examinar as relações tridimensionais entre vasos sanguíneos e células imunes.Como mostrado aqui, os músculos extraoculares envoltos pela esclera também podem ser analisados quanto à presença de vasos sanguíneos ou células imunes, utilizando os marcadores CD31 e LYVE1, respectivamente. Uma vez dominada, a técnica de laminagem pode ser realizada em menos de uma hora, se executada corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de evitar que o tecido seque.Não se esqueça de que o trabalho com tecido humano pode ser potencialmente infeccioso e precauções, como diagnósticos microbiológicos e virológicos, devem sempre ser tomadas previamente.

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Research

JoVE Journal

Medicine

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