Name: Identificação de MyoD interactome Usando purificação de afinidade em tandem Acoplado a Espectrometria de Massa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 47 s
Description: Aprenda a caracterizar parceiros proteicos de MyoD usando purificação de afinidade em tandem e espectrometria de massa em células HeLa S3. Este método identifica interações de baixa abundância em compartimentos subnucleares específicos.

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O trabalho no laboratório Ait-Si-Ali foi apoiado pela Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Instituto Nacional do Cancro (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot e o "Quem sou eu?" Laboratório de Excelência #ANR-11-LABX-0071 financiado pelo governo francês por meio de seu programa ''Investimentos para o Futuro'' operado pela ANR sob a concessão #ANR-11-IDEX-0005-01. O EB foi apoiado por uma doação do INCA

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<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+development+and+the+role+of+the+myogenic+regulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors.</a> Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Winter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+differentiation%3A+more+complexity+to+the+network+of+myogenic+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+formation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle formation in vertebrates.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).</li>
<li>Yun, K., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+determination+and+differentiation%3A+story+of+a+core+regulatory+network+and+its+context%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context.</a> Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).</li>
<li>Molkentin, J. D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+regulatory+networks+for+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Defining the regulatory networks for muscle development.</a> Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+inactivation+of+myogenic+factor+genes+reveals+their+role+during+mouse+myogenesis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review.</a> Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).</li>
<li>Puri, P. L., Sartorelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+muscle+regulatory+factors+by+DNA-binding%2C+interacting+proteins%2C+and+post-transcriptional+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications.</a> J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).</li>
<li>Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circuitry+of+a+master+switch%3A+Myod+and+the+regulation+of+skeletal+muscle+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription.</a> Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).</li>
<li>Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+a+DNA+locus+that+mediates+the+conversion+of+10T1%2F2+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 47 (5), 649-656 (1986).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li>
<li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD1%3A+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li>
<li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment%2C+nerve%2C+fat%2C+liver%2C+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).</li>
<li>Mal, A., Harter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+is+functionally+linked+to+the+silencing+of+a+muscle-specific+regulatory+gene+prior+to+skeletal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).</li>
<li>Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+specification+by+myogenin+and+Mef2D+via+the+SWI%2FSNF+ATPase+Brg1%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1.</a> Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).</li>
<li>Ling, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methyltransferase+G9a+methylates+the+transcription+factor+MyoD+and+regulates+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).</li>
<li>Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+class+II+histone+deacetylases+with+heterochromatin+protein+1%3A+potential+role+for+histone+methylation+in+control+of+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation.</a> Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).</li>
<li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI%2FSNF+chromatin-remodelling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).</li>
<li>Nakatani, Y., Ogryzko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+purification+of+mammalian+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes.</a> Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).</li>
<li>Ouararhni, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+variant+mH2A1.1+interferes+with+transcription+by+down-regulating+PARP-1+enzymatic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity.</a> Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).</li>
<li>Fritsch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+the+histone+H3+lysine+9+methyltransferases+Suv39h1%2C+G9a%2C+GLP%2C+and+SETDB1+participate+in+a+multimeric+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex.</a> Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).</li>
<li>Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+histones+H3+and+H4+associated+with+the+histone+methyltransferases+Suv39h1+and+G9a%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a.</a> Genome Biol. 8 (12), R270(2007).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Ohta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+composition+of+mitotic+chromosomes+determined+using+multiclassifier+combinatorial+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics.</a> Cell. 142 (5), 810-821 (2010).</li>
<li>Yahi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cooperation+between+heterochromatin+protein+HP1+isoforms+and+MyoD+in+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
<li>Philipot, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+binding+factor+CBF+negatively+regulates+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 5 (2), (2010).</li>
<li>Joliot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SWI%2FSNF+subunit%2Ftumor+suppressor+BAF47%2FINI1+is+essential+in+cell+cycle+arrest+upon+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 9 (10), e108858(2014).</li>
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<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification and muscle differentiation.</a> Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).</li>
<li>Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+binds+prohibitin+2+and+relieves+its+repression+of+MyoD+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+117%22%5BJournal%5D)">Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation.</a> J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).</li>
<li>Caretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicases+p68%2Fp72+and+the+noncoding+RNA+SRA+are+coregulators+of+MyoD+and+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation.</a> Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).</li>
<li>Knoepfler, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+motif+N-terminal+to+the+DNA-binding+domains+of+myogenic+bHLH+transcription+factors+mediates+cooperative+DNA+binding+with+pbx-Meis1%2FPrep1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1.</a> Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).</li>
<li>Albini, S., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+complexes%2C+chromatin+remodeling+and+skeletal+myogenesis%3A+it%27s+time+to+exchange%21%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange!</a> Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).</li>
<li>Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Cooperation+between+Heterochromatin+Protein+HP1+Isoforms+and+MyoD+in+Myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O método apresentado permite a identificação exaustiva de parceiros de um fator de transcrição, MyoD. Revelou parceiros MyoD num sistema heterólogo resistente a diferenciação induzida por MyoD, nomeadamente células de HeLa-S3. Assim, por definição, MyoD parceiros identificados são expressos ubiquamente. Estes incluem factores gerais e específicos de sequência de transcrição, enzimas modificadoras da cromatina, proteínas de processamento de RNA, quinases (Tabelas 1 e 2). Dado que as célu...

organismos multicelulares eucarióticos são compostas de diferentes órgãos e tecidos. Cada tecido funcional tem um padrão de expressão do gene específico, o qual é determinado em cada passo de diferenciação. Diferenciação celular envolve a activação de genes específicos, manutenção da sua expressão e, geralmente, o silenciamento de um conjunto de genes tais aqueles que estão envolvidos na proliferação celular. diferenciação de músculo esquelético, ou miogénese, é, assim, um processo multi-etapa, que começa com a determinação de células estaminais mesodermal em mioblastos, e, em seguida, leva à diferenciação terminal destes mioblastos em primeiro mono-nucleadas, e, em seguida, multi-nucleadas, miotubos . Assim, mioblastos são &quot;determinado&quot; células, que ainda são capazes de proliferar, mas eles estão comprometidos com a linhagem músculo esquelético, e, portanto, pode diferenciar exclusivamente em células musculares esqueléticas, quer durante o desenvolvimento embrionário ou em regeneração muscular adulta. O processo de terminal de músculo esquelético diferemciação é orquestrado por um programa genético específico que se inicia com a saída permanente do ciclo celular de células precursoras de mioblastos que leva a um silenciamento definitivo da proliferação de genes associados, tais como E2F genes alvo 1. Com efeito, durante o processo de diferenciação terminal, paragem proliferação de mioblastos é um passo crucial que precede a expressão de genes específicos do músculo esquelético e a fusão de mioblastos em miotubos 2. Tal programa permite que as células-tronco musculares adultas, também chamados de células satélites, para diferenciar durante o processo de regeneração após lesão do músculo esquelético. Myogenesis mamíferos é criticamente dependente de uma família de miogênica hélice-volta-hélice (bHLH) fatores de transcrição MyoD, Myf5, MRF4 e miogenina, frequentemente referida como a família de fatores esqueléticos determinação muscular ou MRFs (músculo fatores regulatórios) 3. Cada um deles desempenha um papel essencial na especificação e DIFdiferen- das células musculares esqueléticas e tem um padrão de expressão específico abril 05-07. A ativação de Myf5 e MyoD constitui o passo determinante que compromete as células da linhagem miogênica e subsequente expressão de miogenina desencadeia myogenesis com a ativação de genes específicos do músculo esquelético, como MCK (Muscle Creatina Quinase). Factores de transcrição bHLH Miogênica cooperar com os membros da família MEF2 na activação de genes musculares de loci anteriormente silenciosos 8. Eles também estimulam esquelético transcrição do gene muscular como heterodímeros com proteínas bHLH onipresente, E12 e E47, conhecidas como proteínas E, que se ligam chamados E-caixas em várias regiões do gene-regulação 8. Torção, Id (inibidor de diferenciação) e outros factores regulam negativamente este processo, por competir com MyoD para proteínas E de ligação 8. MyoD é considerado como o jogador mais importante no desencadeamento de terminal muscular diferenciação 9 </s-se&gt; uma vez que tem a capacidade de induzir um programa de determinação miogénica / diferenciação (trans-diferenciação), em muitos sistemas não-musculares completamente diferenciadas 10-13. Na verdade, a expressão forçada de MyoD induz a trans-diferenciação de diferentes tipos celulares, mesmo aqueles derivados de outra origem embriológica 12. Por exemplo, pode converter MyoD hepatócitos, f ibroblastos, melanócitos, neuroblastos e adipocitos em células musculares semelhante. A ação trans-de diferenciação de MyoD envolve uma ativação anormal do programa genético miogênica (nomeadamente os seus genes-alvo) em um ambiente não-muscular, concomitante ao silenciamento do programa genético de origem (nomeadamente, os genes de proliferação). Em proliferando mioblastos, MyoD é expresso, mas não é capaz de ativar seus genes-alvo, mesmo quando ele se liga aos seus promotores 14-16. Por conseguinte, o requisito de MyoD de ser continuamente expresso em mioblastos indiferenciadas permanece bastante Elusive. MyoD pôde reprimir seus genes-alvo devido ao recrutamento de enzimas modificadoras da cromatina repressivas em proliferando mioblastos antes do carregamento de ativar cromatina remodelação enzimas 14,17. Por exemplo, na proliferação mioblastos, MyoD está associada com o co-repressor de transcrição KAP-1, histona desacetilases (HDACs) e metiltransferases lisina repressivas (KMTS), incluindo a histona H3 lisina 9 ou H3K9 e H3K27 KMTS, e suprimir de forma activa a expressão de genes alvo através do estabelecimento de uma estrutura de cromatina 14,17 localmente repressivo. Importante, um relatório recente indicou que MyoD é em si directamente metilado pelo H3K9 KMT G9a resultando na inibição da sua actividade de transactivação 16. Os mecanismos epigenética envolvidas neste trans-diferenciação de células não musculares por MyoD são em grande parte desconhecida. Notavelmente, algumas linhas de células são resistentes a trans-diferenciação induzida por MyoD. Assim, em células HeLa, MyoD é ou inactiva ouainda pode funcionar como repressor, em vez de activador da transcrição devido à falta de expressão da subunidade BAF60C remodelação da cromatina complexo SWI / SNF 18. Este modelo pode, assim, ser de escolha para melhor caracterizar os mecanismos de repressão do gene induzida por MyoD. É igualmente apropriado para ensaiar a capacidade de MyoD para induzir ambiente cromatina repressivo na sua loci alvo com seus parceiros associados e, portanto, desvendar os mecanismos repressivos dependente de MyoD em proliferando mioblastos para afinar a diferenciação terminal. Aqui descrevemos o protocolo para a identificação de parceiros MyoD usando purificação de afinidade em tandem (TAP-tag) acoplada a espectrometria de massa (MS) caracterização. A utilização de células HeLa-S3 que expressam estavelmente Bandeira-HA-MyoD permitida para obter material suficiente para purificar os complexos a partir de extractos nucleares MyoD fraccionados. A identificação de parceiros MyoD no sistema heterólogo foi seguido por validatino em um sistema relevante.

<table><tbody><tr><td><forte>Linhagens celulares</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-S3</td><td>ATCC</td><td>CCL-2.2</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td><forte>Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Homogeneizador 778531</td><td></td><td></td>Corning</tr><tr><td>:&nbsp; Homogeneizador Dounce</td><td>Wheaton</td><td>432-1273 e 432-1271</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de agitação para spinners</td><td>Bellco</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Diagenode</td><td>UCD 200</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Marienfeld Superior&nbsp;</td><td>640610</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de baixa ligação</td><td>Sorenson</td><td>27210</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de rotação vazia</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-polyacrylamide 4-12%&nbsp; gel</td><td>Life technologies</td><td>NP0336BOX</td><td></td></tr><tr><td>4x tampão de carregamento&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Agente redutor 10x</td> Kit de coloração de prata <td>Life technologies</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtro</td> centrífugo <td>Life technologies</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>, 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Protein G contas de agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4691</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G&nbsp; Resina</td><td>Thermo Scientific</td><td>53132</td><td></td></tr><tr><td>Resina de bandeira (gel de afinidade anti-Flag M2-agarose)</td><td>Resina Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>HA (monoclonal Anti-HA agarose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2095</td><td></td></tr><tr><td>MNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>Peptídeo livre de bandeira (DYKDDDDK)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>Síntese personalizada</td><td>Ressuspender até 4 mg/ml em 50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td></tr><tr><td>Peptídeo livre de HA (YPYDVPDYA)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>Síntese personalizada</td><td>Ressuspender até 4 mg/ml em 50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína à base de ácido bicinchonínico : Kit BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Inibidores de protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Substrato HRP de quimioluminescência aprimorada (ECL) à base de luminol</td><td>Tecnologias de vida</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>DNA de esperma de salmão cisalhado (sal de sódio do ácido desoxirribonucléico dos testículos de salmão)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de espermina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1141</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MOPS buffer de corrida</td><td>Life technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (alta glicose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0822</td><td>Pré-aquecido&nbsp; a 37 &deg; C antes</td></tr><tr><td>de usar Tripsina-EDTA (0,05% fenol vermelho Soro</td><td>Life technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>GE</td><td>healthcare life sciences&nbsp;</td><td>PAA A15-102</td><td>Cada lote de soro deve ser testado primeiro para suas células.</td></tr><tr><td>Penicilina e estreptomicina&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solução Azul de Tripano, 0,4%</td><td>Life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Água (filtrada estéril)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HA de rato (12CA5)</td><td>Bandeira 11583816001</td><td></td><td></td>Roche</tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32758</td><td>Para usar para western blotting</td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-760</td><td>Para usar para imunoprecipitação e western blotting</td></tr><tr><td>CBFbeta</td><td>Santa Cruz</td><td>FL-182&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HP1alpha</td><td>Euromedex</td><td>2HP2G9</td><td></td></tr><tr><td>HP1beta</td><td>Euromedex</td><td>1MOD1A9AS</td><td></td></tr><tr><td>HP1gamma</td><td>Euromedex</td><td>2MOD1GC</td><td></td></tr><tr><td>Suv39h1</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>8729</td><td></td></tr><tr><td>BAF47</td><td>BD Biosciences</td><td>612111</td><td></td></tr><tr><td>Myf5</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-302</td><td></td></tr><tr><td>Tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td></td></tr><tr><td>Actin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>IgG Mouse</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2025</td><td></td></tr><tr><td>IgG Coelho</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2027</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-rato -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9037</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-rato -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr></tbody></table>

identificação de myod interactome usando purificação de afinidade em tandem acoplado a espectrometria de massa

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

diferenciação terminal músculo esquelético começa com o compromisso de células precursoras pluripotentes mesodermais de mioblastos. Estas células ainda tem a capacidade de proliferar ou eles podem se diferenciar e se fundem em miotubos multinucleadas, que maturate ainda mais para formar fibras musculares. diferenciação terminal músculo esquelético é orquestrada pela ação coordenada de vários fatores de transcrição, em particular os membros dos fatores ou MRFs reguladoras muscular (MyoD, miogenina, Myf5 e MRF4), também chamado de bHLH miogênica fatores de transcrição da família. Estes factores cooperar com complexos de remodelação da cromatina dentro da rede reguladora da transcrição elaborada para atingir tecido muscular esquelético. Neste, MyoD é considerado o fator de transcrição miogênica mestre no desencadeamento de diferenciação terminal muscular. Esta noção é reforçada pela sua capacidade de converter MyoD células não musculares em células do músculo esquelético. Aqui nós descrevemos uma abordagem utilizada para identificar MyoDparceiros de proteína de forma exaustiva, a fim de elucidar os diferentes fatores envolvidos na diferenciação terminal músculo esquelético. O objectivo a longo prazo é compreender os mecanismos epigenéticos envolvidos na regulação de genes musculares esqueléticas, ie., Metas MyoD. parceiros MyoD são identificados usando purificação de afinidade em tandem (TAP-tag) a partir de um sistema heterólogo acoplada a espectrometria de massa de caracterização (MS), seguido de uma validação do papel de parceiros relevantes durante a diferenciação terminal de músculo esquelético. formas aberrantes de factores miogénicos, ou a sua regulação aberrante, está associada com um número de desordens musculares: miastenia congénita, distrofia miotónica, rabdomiossarcoma e defeitos na regeneração muscular. Como tal, os factores miogï¿½icas fornecer um conjunto de potenciais alvos terapêuticos em doenças musculares, tanto no que diz respeito aos mecanismos que causam doença em si e os mecanismos regenerativos que pode melhorar o tratamento da doença. Assim, o understan detalhadaDing das interacções intermoleculares e os programas genéticos controlados pelos factores miogï¿½icas é essencial para a concepção racional de terapias eficientes.

Para compreender a regulação da actividade MyoD, realizamos a caracterização exaustiva dos complexos MyoD usando purificação bioquímica, com base no imunopurificação de uma forma marcada com o dobro da MyoD seguido por espectrometria de massa (MS). A utilização da linha de células de HeLa-S3 que expressa Flag-MyoD marcada com HA e uma linha de células de controlo que expressam HA-autorizações de bandeira para obter material suficiente para purificar o complexo MyoD efectuando a purificaç...

MyoD é um fator de transcrição miogênico com forte capacidade de induzir a transdiferenciação miogênica de muitas linhagens celulares não musculares totalmente diferenciadas. Os mecanismos epigenéticos envolvidos nessa transdiferenciação são amplamente desconhecidos. Aqui descrevemos um método de purificação de dupla afinidade seguido de espectrometria de massa para caracterizar exaustivamente os parceiros MyoD.

Identificação de MyoD interactome Usando purificação de afinidade em tandem Acoplado a Espectrometria de Massa

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

O objetivo geral deste experimento é caracterizar exaustivamente os parceiros da proteína MyoD. Este método pode responder a questões-chave no campo da biologia do músculo esquelético, como a regulação molecular da deformação tonal do músculo esquelético pelo principal fator de transcrição muscular, MyoD. A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite desvendar parceiros MyoD que têm abundância eletivamente baixa, localizada em um compartimento subnuclear específico.Embora esse método possa fornecer informações sobre a regulação da diferenciação muscular, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como quaisquer outros tecidos, especificamente a diferenciação nuclear. Demonstrando o procedimento estará a Dra. Lauriane Fritsch, assistente de pesquisa de nosso laboratório. Neste protocolo, os complexos MyoD serão purificados a partir de células HeLa S3 que expressam MyoD de forma estável com marcadores de glutenina FLAG.As células HeLa S3 transduzidas com o vetor vazio serão usadas como controle. Ambas as linhagens celulares foram previamente cultivadas, coletadas e armazenadas a 80 graus Celsius negativos, conforme descrito no texto do protocolo. Rapidamente, descongele os pellets celulares em banho-maria a 37 graus Celsius.Todos os tampões e homogeneizadores devem ser pré-resfriados e todo esse procedimento deve ser realizado em câmara fria. Normalmente, 20 gramas de células são usados para cada ponto experimental, mas para os fins desta demonstração, apenas 10 gramas, ou cerca de 10 mL de células, serão processados. Ressuspenda as células em 10 mL de tampão hipotônico A, usando 5 mL do tampão primeiro.Em seguida, adicionando 2,5 mL, seguido por outros 2,5 mL. Lave bem a pipeta com tampão novo para obter o máximo de células. Transfira 20 mL da suspensão celular para o homogeneizador pré-resfriado com um pilão bem ajustado.Homogeneizar as células com 20 traços. Transferir a suspensão celular para um tubo de 50 mililitros. Para recuperação máxima das células, lave o homogeneizador com 3,5 mL de tampão de sacarose.Transfira esta suspensão rapidamente para o tubo de 50 mL para preservar os núcleos e limitar o vazamento. Manchar uma alíquota de 30 microlitros da suspensão celular com 30 microlitros de azul de tripano a 4% e analisar ao microscópio para determinar a eficiência da lise. Todos os núcleos devem ser azuis se a lise for bem-sucedida.Se necessário, repita a homogeneização. Centrifugue por sete minutos a 10.000 x g e quatro graus Celsius para granular os núcleos. Salvar o sobrenadante como uma fração citoplasmática.Inicie o procedimento de preparação da fracção extraível do sal nuclear ressuspendendo o sedimento dos núcleos em 4 ml de tampão sacarose. Em seguida, adicione 4 mL de tampão com alto teor de sal gota a gota enquanto mistura bem em um vórtice para obter uma concentração final de 300 mM de cloreto de sódio. Incube por 30 minutos no gelo com mistura a cada cinco minutos.Em seguida, diminua a concentração de cloreto de sódio para 150 mM adicionando 8 mL de tampão de sacarose. Centrifugue durante 10 minutos a 13 000 x g e quatro graus Celsius. Recolha o sobrenadante, que é a fracção extractível do sal, e deixe-o no gelo.Para preparar a fração ligada à cromatina, ressuspenda o pellet meticulosamente em 3,5 mL de tampão de sacarose. Adicionar cloreto de cálcio a uma concentração final de 1 mM e misturar. O cloreto de cálcio ativará a nuclease microcócica que será adicionada posteriormente.Pré-aqueça a suspensão por um minuto a 37 graus Celsius. Adicione 35 microlitros de um estoque de nuclease microcócica de 5 unidades por microlitro para obter uma concentração final de 25 10 milésimas unidades por microlitro. Incube por exatamente 12 minutos a 37 graus Celsius.Misture a cada quatro minutos. Após 12 minutos, coloque imediatamente a reação no gelo. Para interromper a atividade da nuclease microcócica, adicione 56 microlitros de EDTA 5 molar pH 8,0 a uma concentração final de 4 mM e vórtice.Incube por cinco minutos no gelo. Sonicar cinco vezes por um minuto de cada vez em alta amplitude, permitindo um intervalo de um minuto entre as sonicações. Alter centrifugue as frações extraíveis de sal e enriquecidas com nucleossomas durante 30 minutos a 85 000 x g a quatro graus Celsius.Colete os sobrenadantes. A fração extraível do sal deve ser de cerca de 13 mL. E a fração enriquecida com nucleassoma deve ser de cerca de 6 mL.Os complexos proteicos MyoD serão purificados por purificação de dupla afinidade. Como os procedimentos para purificação baseada em FLAG e HA são semelhantes, apenas a purificação baseada em FLAG será demonstrada. Depois de adicionar TEGN, transfira o volume apropriado de resina FLAG para um tubo de 50 mL.300 microlitros de resina FLAG da resina FLAG de pré-lavagem comercial de 50% são necessários para cada ponto experimental. Centrifugar durante dois minutos a 1 000 x g. Remova o sobrenadante, adicione TEGN frio e centrifugue novamente.Lave a resina FLAG com TEGN frio um total de cinco vezes. Após a última lavagem, ressuspenda a resina FLAG em um volume igual de TEGN. Para cada ponto experimental, misture 300 microlitros de resina FLAG lavada e o extrato de proteína correspondente.Utilizar um tubo de 15 ml para a fracção enriquecida com nucleassoma e um tubo de 50 ml para a fracção extractável com sal. Incube os tubos em uma roda giratória durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, centrifugue todos os tubos por dois minutos a 1.000 x g a quatro graus Celsius.Recolher os sobrenadantes e conservá-los a quatro graus Celsius até obter o resultado do ensaio de eficiência de purificação. Para as amostras extraíveis de sal, ressuspender a resina FLAG em 4 ml de TEGN e transferir para um tubo de 15 ml. Repita esta etapa três vezes, cada vez transferindo para os mesmos 15 mL para evitar a perda de grânulos.Centrifugar durante dois minutos a 1 000 x g a quatro graus Celsius. Depois de remover o sobrenadante, adicione 13 mL de TEGN à resina FLAG e centrifugue por dois minutos a 1.000 x g a quatro graus Celsius. Lave a resina sete vezes dessa maneira.Após a última lavagem, ressuspenda a resina em 1 mL de TEGN e transfira para um tubo de baixa ligação de 1,5 mL. Centrifugue durante dois minutos e retire o sobrenadante. Ressuspenda a resina para cada ponto experimental em 100 microlitros de solução peptídica FLAG a 4 mg / mL a pH 7,8 Misture bem e adicione 100 microlitros de tampão TEGN.Incubar a quatro graus Celsius por pelo menos quatro horas para eluir as proteínas ligadas. Centrifugar durante dois minutos e transferir a resina e o sobrenadante para uma coluna de centrifugação vazia colocada num tubo de 2 ml. Centrifugar a coluna durante um minuto a 6 000 x g.Recolher o sobrenadante restante no tubo de 2 ml. A eficiência da purificação é então testada conforme descrito no texto do protocolo, antes de prosseguir com a purificação baseada em HA. Aqui são mostrados resultados representativos de complexos MyoD purificados de dupla afinidade a partir de frações extraíveis de sal nuclear ou enriquecidas com nucleassoma de uma linhagem celular HeLa S3 expressando de forma estável FLAG HA MyoD.A coloração de prata identificou FLAG HA MyoD indicada pela seta que está ausente da linha celular simulada. Os complexos MyoD purificados de dupla afinidade foram fracionados em gradientes de glicerol. O western blotting das frações usando anticorpos anti-FLAG descobriu os subcomplexos MyoD nos dois compartimentos subnucleares.Em particular, o MyoD extraível com sal é distribuído em três subcomplexos, enquanto o MyoD ligado à cromatina pertence principalmente a um complexo. A análise por espectrometria de massa de interagentes MyoD isolados de frações extraíveis de sal nuclear e enriquecidas com nucleossomos identificou uma série de parceiros conhecidos e novos parceiros de MyoD. Aqui, os interagentes MyoD encontrados em ambas as frações ou, especificamente para uma das frações, são agrupados com base em suas anotações funcionais.Algumas das espectrometrias de massa revelaram que os interagentes foram confirmados por Western blot em complexos MyoD. Estes incluem os fatores de transcrição CBF, a subunidade SWI/SNF BAF47 e as proteínas HP1. Como as células HeLa não são células musculares e normalmente não expressam MyoD, é necessário confirmar as interações entre os interagentes recém-identificados e MyoD e mioblastos.Extratos nucleares totais de mioblastos de camundongos em proliferação e diferenciação foram usados para imunoprecipitação e análise ocidental com os anticorpos indicados. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias e meio se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de refinar os resultados obtidos nos mioblastos.Após este procedimento, outros métodos, como o knockdown do parceiro específico no sistema de relevância, como mioblastos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o significado funcional da interação. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da epigenética biológica do desenvolvimento explorarem a rede de regulação de cinco fatores de transcrição na maioria dos sistemas do corpo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar os parceiros do fator de transcrição realizando o fracionamento celular seguido de purificação de afinidade em tandem acoplada à espectrometria de massa.

identification-myod-interactome-using-tandem-affinity-purification

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Identificação de MyoD interactome Usando purificação de afinidade em tandem Acoplado a Espectrometria de Massa

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