Identificação de MyoD interactome Usando purificação de afinidade em tandem Acoplado a Espectrometria de Massa

O objetivo geral deste experimento é caracterizar exaustivamente os parceiros da proteína MyoD. Este método pode responder a questões-chave no campo da biologia do músculo esquelético, como a regulação molecular da deformação tonal do músculo esquelético pelo principal fator de transcrição muscular, MyoD. A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite desvendar parceiros MyoD que têm abundância eletivamente baixa, localizada em um compartimento subnuclear específico.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a regulação da diferenciação muscular, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como quaisquer outros tecidos, especificamente a diferenciação nuclear. Demonstrando o procedimento estará a Dra. Lauriane Fritsch, assistente de pesquisa de nosso laboratório. Neste protocolo, os complexos MyoD serão purificados a partir de células HeLa S3 que expressam MyoD de forma estável com marcadores de glutenina FLAG.

As células HeLa S3 transduzidas com o vetor vazio serão usadas como controle. Ambas as linhagens celulares foram previamente cultivadas, coletadas e armazenadas a 80 graus Celsius negativos, conforme descrito no texto do protocolo. Rapidamente, descongele os pellets celulares em banho-maria a 37 graus Celsius.

Todos os tampões e homogeneizadores devem ser pré-resfriados e todo esse procedimento deve ser realizado em câmara fria. Normalmente, 20 gramas de células são usados para cada ponto experimental, mas para os fins desta demonstração, apenas 10 gramas, ou cerca de 10 mL de células, serão processados. Ressuspenda as células em 10 mL de tampão hipotônico A, usando 5 mL do tampão primeiro.

Em seguida, adicionando 2,5 mL, seguido por outros 2,5 mL. Lave bem a pipeta com tampão novo para obter o máximo de células. Transfira 20 mL da suspensão celular para o homogeneizador pré-resfriado com um pilão bem ajustado.

Homogeneizar as células com 20 traços. Transferir a suspensão celular para um tubo de 50 mililitros. Para recuperação máxima das células, lave o homogeneizador com 3,5 mL de tampão de sacarose.

Transfira esta suspensão rapidamente para o tubo de 50 mL para preservar os núcleos e limitar o vazamento. Manchar uma alíquota de 30 microlitros da suspensão celular com 30 microlitros de azul de tripano a 4% e analisar ao microscópio para determinar a eficiência da lise. Todos os núcleos devem ser azuis se a lise for bem-sucedida.

Se necessário, repita a homogeneização. Centrifugue por sete minutos a 10.000 x g e quatro graus Celsius para granular os núcleos. Salvar o sobrenadante como uma fração citoplasmática.

Inicie o procedimento de preparação da fracção extraível do sal nuclear ressuspendendo o sedimento dos núcleos em 4 ml de tampão sacarose. Em seguida, adicione 4 mL de tampão com alto teor de sal gota a gota enquanto mistura bem em um vórtice para obter uma concentração final de 300 mM de cloreto de sódio. Incube por 30 minutos no gelo com mistura a cada cinco minutos.

Em seguida, diminua a concentração de cloreto de sódio para 150 mM adicionando 8 mL de tampão de sacarose. Centrifugue durante 10 minutos a 13 000 x g e quatro graus Celsius. Recolha o sobrenadante, que é a fracção extractível do sal, e deixe-o no gelo.

Para preparar a fração ligada à cromatina, ressuspenda o pellet meticulosamente em 3,5 mL de tampão de sacarose. Adicionar cloreto de cálcio a uma concentração final de 1 mM e misturar. O cloreto de cálcio ativará a nuclease microcócica que será adicionada posteriormente.

Pré-aqueça a suspensão por um minuto a 37 graus Celsius. Adicione 35 microlitros de um estoque de nuclease microcócica de 5 unidades por microlitro para obter uma concentração final de 25 10 milésimas unidades por microlitro. Incube por exatamente 12 minutos a 37 graus Celsius.

Misture a cada quatro minutos. Após 12 minutos, coloque imediatamente a reação no gelo. Para interromper a atividade da nuclease microcócica, adicione 56 microlitros de EDTA 5 molar pH 8,0 a uma concentração final de 4 mM e vórtice.

Incube por cinco minutos no gelo. Sonicar cinco vezes por um minuto de cada vez em alta amplitude, permitindo um intervalo de um minuto entre as sonicações. Alter centrifugue as frações extraíveis de sal e enriquecidas com nucleossomas durante 30 minutos a 85 000 x g a quatro graus Celsius.

Colete os sobrenadantes. A fração extraível do sal deve ser de cerca de 13 mL. E a fração enriquecida com nucleassoma deve ser de cerca de 6 mL.

Os complexos proteicos MyoD serão purificados por purificação de dupla afinidade. Como os procedimentos para purificação baseada em FLAG e HA são semelhantes, apenas a purificação baseada em FLAG será demonstrada. Depois de adicionar TEGN, transfira o volume apropriado de resina FLAG para um tubo de 50 mL.

300 microlitros de resina FLAG da resina FLAG de pré-lavagem comercial de 50% são necessários para cada ponto experimental. Centrifugar durante dois minutos a 1 000 x g. Remova o sobrenadante, adicione TEGN frio e centrifugue novamente.

Lave a resina FLAG com TEGN frio um total de cinco vezes. Após a última lavagem, ressuspenda a resina FLAG em um volume igual de TEGN. Para cada ponto experimental, misture 300 microlitros de resina FLAG lavada e o extrato de proteína correspondente.

Utilizar um tubo de 15 ml para a fracção enriquecida com nucleassoma e um tubo de 50 ml para a fracção extractável com sal. Incube os tubos em uma roda giratória durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, centrifugue todos os tubos por dois minutos a 1.000 x g a quatro graus Celsius.

Recolher os sobrenadantes e conservá-los a quatro graus Celsius até obter o resultado do ensaio de eficiência de purificação. Para as amostras extraíveis de sal, ressuspender a resina FLAG em 4 ml de TEGN e transferir para um tubo de 15 ml. Repita esta etapa três vezes, cada vez transferindo para os mesmos 15 mL para evitar a perda de grânulos.

Centrifugar durante dois minutos a 1 000 x g a quatro graus Celsius. Depois de remover o sobrenadante, adicione 13 mL de TEGN à resina FLAG e centrifugue por dois minutos a 1.000 x g a quatro graus Celsius. Lave a resina sete vezes dessa maneira.

Após a última lavagem, ressuspenda a resina em 1 mL de TEGN e transfira para um tubo de baixa ligação de 1,5 mL. Centrifugue durante dois minutos e retire o sobrenadante. Ressuspenda a resina para cada ponto experimental em 100 microlitros de solução peptídica FLAG a 4 mg / mL a pH 7,8 Misture bem e adicione 100 microlitros de tampão TEGN.

Incubar a quatro graus Celsius por pelo menos quatro horas para eluir as proteínas ligadas. Centrifugar durante dois minutos e transferir a resina e o sobrenadante para uma coluna de centrifugação vazia colocada num tubo de 2 ml. Centrifugar a coluna durante um minuto a 6 000 x g.

Recolher o sobrenadante restante no tubo de 2 ml. A eficiência da purificação é então testada conforme descrito no texto do protocolo, antes de prosseguir com a purificação baseada em HA. Aqui são mostrados resultados representativos de complexos MyoD purificados de dupla afinidade a partir de frações extraíveis de sal nuclear ou enriquecidas com nucleassoma de uma linhagem celular HeLa S3 expressando de forma estável FLAG HA MyoD.

A coloração de prata identificou FLAG HA MyoD indicada pela seta que está ausente da linha celular simulada. Os complexos MyoD purificados de dupla afinidade foram fracionados em gradientes de glicerol. O western blotting das frações usando anticorpos anti-FLAG descobriu os subcomplexos MyoD nos dois compartimentos subnucleares.

Em particular, o MyoD extraível com sal é distribuído em três subcomplexos, enquanto o MyoD ligado à cromatina pertence principalmente a um complexo. A análise por espectrometria de massa de interagentes MyoD isolados de frações extraíveis de sal nuclear e enriquecidas com nucleossomos identificou uma série de parceiros conhecidos e novos parceiros de MyoD. Aqui, os interagentes MyoD encontrados em ambas as frações ou, especificamente para uma das frações, são agrupados com base em suas anotações funcionais.

Algumas das espectrometrias de massa revelaram que os interagentes foram confirmados por Western blot em complexos MyoD. Estes incluem os fatores de transcrição CBF, a subunidade SWI/SNF BAF47 e as proteínas HP1. Como as células HeLa não são células musculares e normalmente não expressam MyoD, é necessário confirmar as interações entre os interagentes recém-identificados e MyoD e mioblastos.

Extratos nucleares totais de mioblastos de camundongos em proliferação e diferenciação foram usados para imunoprecipitação e análise ocidental com os anticorpos indicados. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias e meio se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de refinar os resultados obtidos nos mioblastos.

Após este procedimento, outros métodos, como o knockdown do parceiro específico no sistema de relevância, como mioblastos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o significado funcional da interação. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da epigenética biológica do desenvolvimento explorarem a rede de regulação de cinco fatores de transcrição na maioria dos sistemas do corpo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar os parceiros do fator de transcrição realizando o fracionamento celular seguido de purificação de afinidade em tandem acoplada à espectrometria de massa.