Name: Segmentação de biofilme Associated Staphylococcus aureus Usando resazurina Baseado Ensaio Drogas susceptibilidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprenda a cultivar biofilmes de Staphylococcus aureus em placas de 96 poços para testes de susceptibilidade a antibióticos usando corante de viabilidade. Este método permite avaliar a eficácia de compostos antimicrobianos contra bactérias associadas a biofilmes.

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Agradecemos a Saran Kupul pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado em parte pela concessão R01-AI104952 do NIH para FW. Apoio adicional foi fornecido pelo Centro de Pesquisa da AIDS (CFAR) da Universidade do Alabama em Birmingham (UAB), um programa financiado pelo NIH (P30 AI027767) que foi possibilitado pelos seguintes institutos do NIH: NIAID, NIMH, NIDA, NICHD, NHLDI, NIA.

1. biofilme Iniciação <ol><li> Crescer uma cultura de biofilme organismo produtor num meio rico em nutrientes. Inocular Staphylococcus aureus estirpe Newman, em 10 ml de meio de Mueller-Hinton a partir de um stock de glicerol. Realizar todos os trabalhos envolvendo a manipulação de S. aureus com luvas e dentro de um gabinete de biossegurança. </li><li> Incubar durante 16 horas a 37 ° C num agitador rotativo (100-200 rpm). </li><li> Determinar DO600 da cultura utilizando um espectrofotómetro e uma cuvete padrão (comprimento do caminho: 1 centímetro). </li><li> Calcular o volume (V) de cultura necessário para preparar 20 ml de inoculo com a DO600 (inoculo) de 0,1 em chelexed meios de Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) 9 utilizando a fórmula: [V = 20 ml * 0,1 / OD 600 (cultura )] Nota: Referência 9 fornece detalhes sobre a preparação cRPMI. <ol><li> Adicionar o volume calculado de cultura (de acima) a um tubo de centrífuga e as células de pelotas por centrifugação durante 1 min a 10.000 x g. para prepare inoculo biofilme, aspirar o sedimento de células e meio de crescimento gasto ressuspender em 20 ml de cRPMI. </li></ol></li><li> Pour inoculo para um reservatório de 25 ml. </li><li> Remova cuidadosamente a tampa de uma placa de peg 96 poços estéril, puxando-o para cima. Nota: É preciso ter cuidado para não contaminar os pinos de suspensão para baixo da tampa. A tampa pode ser colocado de cabeça para baixo em uma superfície limpa dentro de uma cabine de segurança biológica. </li><li> Usando uma pipeta de 200 uL de multi-canal, adicionar 125 uL de inoculo em cada cavidade de filas A a G da placa de fundo. </li><li> Encha meio cRPMI 125 ul estéril em cada poço de uma fila H como o controle de esterilidade. </li><li> Leve o peg-tampa e mantenha-o acima da parte inferior da placa com os pinos voltados para baixo. Alinhe cuidadosamente os pinos individuais com seus respectivos poços. Evitar o contacto físico entre a placa e as estacas. Uma vez alinhadas, abaixe a tampa com cuidado para baixo. Evitar distorções como reajustes realizados após as estacas ter tocado a placa de fundo pode contcontroles de esterilidade aminar em H. linha </li><li> Selar a tampa para a placa com película de parafina para evitar a evaporação e coloque em um saco plástico lacrado, selando firmemente. Manter o volume de ar dentro do saco o mais baixo possível para minimizar a evaporação. </li><li> Incubar sem agitação a 37 ° C durante 48 horas numa incubadora de CO2 a 5%. Nota: 48 horas de crescimento tem sido óptimo para S. aureus, mas irá variar com base no organismo utilizado. Nota: Embora incubação estática é um bom ponto de partida para optimizar o ensaio, agitando a 150 rpm num agitador de microplacas é uma variação possível que pode aumentar a formação de biofilme de alguns S. aureus. </li></ol> 2. Preparação da placa de biofilme Desafio <ol><li> No dia do desafio biofilme tomar uma placa de 96 poços frescas e adicionar 100 ul de cRPMI, equilibrada à temperatura ambiente, a cada poço de linhas B de H. A fim de evitar resultados inconsistentes, utilizar uma placa de 96 poços que pode conter 200 uldos meios de comunicação, quando as cavilhas são para dentro, e apresenta cavidades com dimensões idênticas às da placa de iniciação biofilme. </li><li> Diluir até 4 compostos de teste separadamente em 1,0 ml de cRPMI para 2x a concentração final desejada, de modo a representar uma diluição final no passo 2.7. Nota: Um bom ponto de partida é de 8 vezes acima da concentração inibitória das células planctônicas. </li><li> Adicionar 200 mL de composto 1 em poços A1 para A3, composto 2 em poços A4 a A6, composto 3 em poços A7 a A9 e composto 4 em poços A10 a A12. </li><li> Diluir em série os compostos de teste, utilizando uma pipeta de canais múltiplos e transferir 100 ul da linha A para a linha B e misturar. </li><li> Desse modo, continuam a transferir 100 ul poço a poço. Misturar após cada transferência e parar na linha F. </li><li> Após a mistura, expulsar 100 ul de linha F em um recipiente de resíduos. Não transferir qualquer líquido linhas G e H. </li><li> Adicionar 100 ul de cRPMI a cada poço da placa utilizando uma pipeta de canais múltiplos paraperfazer o volume de 200 uL. Veja a Figura 1 para o layout final da placa. </li></ol> 3. biofilme Desafio <ol><li> Adicionar 200 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma placa de 96 poços estéril fresco que apresenta cavidades com dimensões idênticas às da placa de iniciação biofilme. </li><li> Retire o saco de plástico e filme de parafina a partir de chapa de iniciação biofilme incubadas. </li><li> Levante a tampa para cima. Evitar o contacto entre as estacas e parte inferior da placa, pois isso pode danificar o biofilme. Manter parte inferior para posterior análise de OD 600 (ver 3.8). </li><li> Enxaguar as células planctônicas, colocando o PEG-tampa sobre a placa contendo PBS (do passo 3.1). Submergir estacas por 5 segundos, levante fora da PBS, e submergir mais uma vez, tomando cuidado para não bater as estacas contra os lados também. </li><li> Coloque a tampa peg-lavado na placa de desafio. Evite contato desnecessário entre pinos e placa de fundo, pois isso irá danificar o biofilme levando aresultados inconsistentes. </li><li> placa de vedação com filme de parafina e coloque em um saco plástico lacrado como descrito no passo 1.10. </li><li> Incubar a placa sem agitação durante 24 h a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. </li><li> Tome parte inferior da placa de iniciação biofilme de 3,3. Ressuspender as bactérias em cada poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos e medir a OD 600 com um leitor de microplacas adequado para confirmar o crescimento ocorre em todos os poços mas os controlos de esterilidade em linha H. </li></ol> 4. Determinação de biofilme <ol><li> Usar um leitor de placa equipado com uma câmara de incubação e capaz de tomar leituras de fluorescência para a detecção de resazurina cinéticas de conversão. Defina-se uma medição da fluorescência cinética 24 h usando uma excitação de 530 nm e 590 nm de emissão. </li><li> Definir a temperatura da câmara para 37 ° C e tem a placa lida a cada 20 min. Definir o leitor de placas para medir a partir do fundo da placa de acordo com as instruções de fabricanteções. </li><li> Prepare a placa de lavagem através da adição de 200 ul de PBS com uma pipeta de canais múltiplos para uma placa de 96 cavidades estéreis. </li><li> Preparar o meio de recuperação de biofilme pela adição de 400 ul de 0,8 mg / ml de solução stock de resazurina para 20 ml de meio cRPMI a uma concentração final de 16 ug / mL de resazurina. Nota: resazurina é um irritante da pele conhecido. Use uma bata de laboratório, óculos contra respingos e luvas durante o manuseio. CRPMI como os meios de recuperação de biofilme foi usado porque ele proporciona o menor sinal de fundo, mas pode ser substituído por meios de Mueller Hinton se for caso disso. </li><li> Adicionar 150 ul de meio de recuperação de biofilme com uma pipeta de canais múltiplos para cada poço de uma placa de 96 poços frescas. </li><li> Transferir a placa desafio da incubadora em uma cabine de segurança biológica e remova cuidadosamente saco de plástico e filme de vedação. </li><li> Remover o peg-tampa da placa de desafio e enxaguar células planctônicas em PBS, conforme descrito no ponto 3.4. Manter a parte inferior da placa de desafio subsequente por OD 600 analise (ver 4.10). </li><li> Após a lavagem, coloque o peg-tampa na parte inferior da placa contendo o meio de recuperação do biofilme. </li><li> Enrole a lado da placa com película de parafina, tendo o cuidado de não obstruir o fundo dos poços de perímetro. Imediatamente após o término do prato, coloque-o no leitor de placas e começar uma leitura cinética durante um período de 24 horas iniciando a feita anteriormente resazurina protocolo cinética a partir do passo 4.1. </li><li> Para quantificar o crescimento das células planctônicas que podem ou não podem ocorrer durante o desafio, ler a OD 600 de toda a parte inferior da placa desafio usando um leitor de microplacas. Siga as instruções dadas no passo 3.8. Nota: ressuspender cuidadosamente o conteúdo de cada poço como células derramamento fora do biofilme tendem a crescer em aglomerados na parte inferior do poço. Quaisquer bolhas dentro do bem irá interferir fortemente com leituras OD 600 e deve ser evitado ou removidos antes da leitura. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, nós descrevemos um ensaio de biofilme modificado para determinar a actividade de inibidores testados em S. biofilmes aureus com foco no estado metabólico das células do biofilme associado. Enquanto a iniciação biofilme descritos e procedimentos de desafio recomendações do fabricante principalmente imitava, a utilização de resazurina corante para detectar e quantificar células associada-biofilme que sobrevivem a um desafio inibidor 24 h simplifica significativamente o procedimento recomendado de r...

Micróbios patogênicos podem formar biofilmes in vivo que levam a infecções crónicas não agudos 1. Infecções associadas aos biofilmes é um fator de risco grave de procedimentos médicos que envolvem a implantação de objetos estranhos (por exemplo, substitutos ósseos artificiais, implantes de mama) ou a instalação de tubos traqueais ou cateteres urinários 2. Nestes contextos, a terapia anti-infecciosa é quase sempre necessário, como infecções baseados em biofilme raramente são apuradas por conta própria, mesmo em indivíduos imunocompetentes. Staphylococcus aureus é um dos patógenos mais frequentemente observadas implicados em complicações relacionadas com o biofilme que ocorrem durante o uso de dispositivos médicos invasivos 3. Infelizmente, a própria natureza do biofilme como uma barreira de protecção torna-as mais resistentes ao tratamento do que as células planctônicas de 1,4, e a avaliação da eficácia clínica predito é uma parte crítica de ambos inicialdesenvolvimento de medicamentos, bem como a vigilância da resistência de droga. Há um crescente reconhecimento de que condições de laboratório, com foco em culturas planctônicas, podem não representar fielmente a doença no mundo real 5. Para agravar ainda mais o problema, a replicação de fenótipos de biofilme é difícil, e os modelos de biofilmes existentes são tediosos e sofrem de elevada variabilidade inter- e intra-ensaio de seis. Assim, muitos pesquisadores, por necessidade, o padrão para ensaios de células planctônicas de sensibilidade às drogas, assim potencialmente negligenciar um aspecto importante da virulência bacteriana e doenças. Aqui descrevemos o protocolo para o ensaio de bactérias, especificamente S. aureus, em biofilmes pré-cultivadas utilizando uma base 7,8 sistema biofilme de 96 poços. Enquanto o protocolo para a formação de biofilme e desafio segue essencialmente a recomendação do fabricante, apresentamos uma metodologia alternativa rico em informações para quantificar a viabilidade do BIOFilm após o desafio. Em resumo, as bactérias são cultivadas na placa de PEG, onde formam biofilmes sobre as cavilhas salientes ligados a tampa da placa. Após a formação do biofilme, os pinos são suavemente mergulhado em poços de uma placa fresca cheio com PBS para remover as células planctônicas. O PEG-tampa, com biofilmes em anexo, é transferido para uma nova placa de desafio, contendo várias concentrações de antibiótico a ser ensaiado. Após uma segunda incubação, as tampas são novamente removidos, lavados e transferidos para uma placa de recuperação de corante contendo resazurina, onde são submetidos a uma incubação final. conversão resazurina pode ser gravado cineticamente ou tomado como uma leitura nó de extremidade após um período de recuperação definido. Este método à base de corantes de quantificação da viabilidade do biofilme difere consideravelmente de CFU (unidades formadoras de colónias) tediosas metodologia baseada em contar descrito no protocolo original 7. OD 600 medições da placa desafio de drogas e resazurina cinética de conversão servir como leitura viabilidadeouts de células planctônicas e biofilme, respectivamente, oferecendo um ensaio rápido, confiável e tecnicamente simples rico em informações para a sobrevivência do biofilme.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Mueller-Hinton Medium</td><td>Oxoid</td><td>CM0405</td><td>Siga as recomendações do fabricante</td></tr><tr><td>RPMI-medium</td><td>Corning&nbsp;</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>CRPMI</td><td>Ref 9</td><td></td><td>RPMI-1640 médio quelexo por 1 hora com resina Chelex 100 e depois suplementado com 10% não chelado RPMI-1640</td></tr><tr><td>Chelex 100 Resina</td><td>Bio Rad</td><td>142-2822</td><td></td></tr><tr><td>MBEC-placas</td><td>Innovotech</td><td>19111</td><td></td></tr><tr><td>Sal de Sódio Resazurin</td><td>Sigma</td><td>R7017</td><td>800 &micro; g/ml em água DI&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Plataforma de</td></tr><tr><td>Agitação de Micro Placas</td> Estéril de Filtro<td>Heidolph Titramax 1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytation 3 Plate Reader</td><td>Software Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5</td><td>Biotek</td><td></td><td>Gravação e análise da conversão de resazurina</td></tr><tr><td>Neocuproine</td><td></td><td>Sigma N1501&nbsp;</td><td>prepare o estoque de 10 mM em 100% de etanol, armazene a -80 &ordm; C</td></tr><tr><td>Sulfato de cobre</td><td>Acros Organics</td><td>7758-99-8</td><td>prepara uma solução estoque de 100 mM em água, armazena a 4 &ordm; C</td></tr><tr><td>-Neocuproine</td><td>Self-Made</td><td></td><td>Gerado pela mistura de molaridades iguais de neocuproína e sulfato de cobre. A mistura foi diluída em meio CRPMI até a concentração desejada.</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G3632-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

segmentação de biofilme associated<em&gt; staphylococcus aureus</em&gt; usando resazurina baseado ensaio drogas susceptibilidade

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

A maioria das bactérias patogênicas é capaz de formar biofilmes durante a infecção, mas devido à dificuldade de manipular e avaliar biofilmes, a grande maioria dos trabalhos de laboratório é realizada com células planctônicas. Aqui, descrevemos um ensaio de biofilme de placa de pino realizado com Staphylococcus aureus. Os biofilmes bacterianos são cultivados em pinos presos a uma tampa de placa de microtitulação de 96 poços, lavados por submersão suave em tampão e colocados em uma placa de provocação de drogas. Após a incubação subsequente, eles são novamente lavados e movidos para uma placa de recuperação final, na qual o corante fluorescente resazurina serve como indicador de viabilidade. Este ensaio oferece maior facilidade de uso, confiabilidade e reprodutibilidade, bem como uma riqueza de dados quando conduzido como uma leitura cinética. Além disso, este ensaio pode ser adaptado para uma abordagem de triagem de medicamentos de médio rendimento, pela qual uma leitura fluorescente final é feita, oferecendo um caminho para os esforços de descoberta de medicamentos.

O ensaio resazurina é sensível o suficiente para detectar com segurança muito poucas células viáveis, capazes de se replicar em meio livre de drogas após o desafio. Nesta metodologia, define-se a concentração mínima de biofilme erradicação como a concentração mais baixa à qual nenhuma conversão resazurina é observada após 24 h. O ensaio baseia-se resazurina em moléculas oxidativos encontrados em células metabolicamente activas, que convertem a cor do corante de azul para rosa. conversão ...

A maioria das infecções bacterianas produz um biofilme. Em virtude de seu ambiente, as bactérias associadas ao biofilme são frequentemente fenotipicamente resistentes a medicamentos. Novas moléculas antibacterianas que matam bactérias em biofilmes são, portanto, uma alta prioridade. Estabelecemos um ensaio para rastrear rapidamente compostos antimicrobianos que são eficazes na erradicação de biofilmes.

Segmentação de biofilme Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Usando resazurina Baseado Ensaio Drogas susceptibilidade

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

O objetivo geral deste procedimento é cultivar de forma fácil e reprodutível biofilmes bacterianos em formato de placa de 96 poços, sobre pinos acoplados à tampa, para testes de suscetibilidade a antibióticos utilizando um corante de viabilidade. Este método pode auxiliar na resposta de questões fundamentais na área de descoberta e desenvolvimento de antibióticos, ao explorar atividades sobre células associadas a biofilmes, que muitas vezes são mais representativas de estados de infecção in vivo. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de desafiar facilmente biofilmes pré-formados em um ensaio de três etapas e determinar a inibição com o uso de um corante de viabilidade comum.Para começar, cultive um organismo produtor de biofilme em um meio rico em nutrientes. Inocule a cepa de Staphylococcus aureus Newman a partir de um estoque glicerinado em 10 mililitros de meio Muller-Hinton. Realize todos os procedimentos que envolvam o manuseio de S. aureus com luvas e dentro de uma cabine de segurança biológica.Incubar por 16 horas a 37 graus Celsius em agitador rotativo. Adicione o volume calculado de cultura a um tubo de centrífuga e pelote as células por um minuto a 10.000 Gs. Para preparar o inóculo de biofilme, aspire o meio de crescimento usado e re-suspenda o pellet celular em 20 mililitros de CRPMI. Usando uma pipeta multicanal de 200 microlitros, adicione 125 microlitros de inóculo de um reservatório de 25 mililitros a cada poço das linhas A a G da placa inferior.Adicione 125 microlitros de meio CRPMI estéril em cada poço da linha H como controle de assepsia. Pegue a tampa com pinos e segure-a acima do fundo da placa com os pinos voltados para baixo. Alinhe cuidadosamente cada pino com o respectivo poço.Evite o contato físico entre a placa e os pinos. Uma vez alinhado, abaixe cuidadosamente a tampa. Sobreponha a tampa à placa com filme de parafina para evitar evaporação e coloque-a em um saco plástico fechável, vedando firmemente.Mantenha o volume de ar na bolsa o mais baixo possível para minimizar a evaporação. Incube a placa sem agitação a 37 graus Celsius por 48 horas, em uma estufa com 5% de dióxido de carbono. No dia do desafio com biofilme, pegue uma placa fresca de 96 poços e adicione 100 microlitros de CRPMI, equilibrado à temperatura ambiente, a cada poço das linhas B a H. Dilua até quatro compostos-teste separadamente, em 1,0 mililitro de CRPMI, até 2x a concentração final desejada.Adicione 200 microlitros do composto 1 nos poços A1-A3. 200 microlitros do composto 2 nos poços A4-A6. 200 microlitros do composto 3 nos poços A7-A9. E 200 microlitros do composto 4 nos poços A10-A12. Dilua seriamente os compostos em teste utilizando uma pipeta multicanal.Inicie transferindo 100 microlitros da linha A para a linha B e misture. Dessa forma, continue transferindo 100 microlitros de poço em poço. Misture após cada transferência e pare na linha F. Após a mistura, despreze 100 microlitros da linha F em um recipiente de resíduos.Não transfira nenhum líquido para as linhas G e H. Por fim, adicione 100 microlitros de CRPMI a cada poço da placa utilizando uma pipeta multicanal, para obter um volume final de 200 microlitros. Adicione 200 microlitros de solução salina tamponada com fosfato a uma placa estéril e nova de 96 poços que apresente poços com dimensões idênticas às da placa de iniciação do biofilme. Em seguida, remova o saco plástico e a película de parafina da placa de iniciação do biofilme incubada.Levante a tampa verticalmente, evitando o contato entre os pinos e o fundo da placa, pois isso pode danificar o biofilme. Guarde a parte inferior para análise subsequente de OD600. Remova as células planctônicas lavando a tampa com pinos colocando-a sobre a placa contendo PBS.Mergulhe os pinos por cinco segundos. Retire-os do PBS e mergulhe-os novamente, tomando cuidado para não bater os pinos nas paredes dos poços. Coloque a tampa com os pinos lavados na placa de desafio.Evite o contato desnecessário entre os pinos e a placa inferior, pois isso danificará o biofilme, levando a resultados inconsistentes. Selle a placa com filme de parafina e coloque-a em um saco plást combustível, como antes. Incube a placa, sem agitação, por 24 horas a 37 graus Celsius, em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono.Retire o fundo da placa de inicia&ccedil;&atilde;o de biofilme e re-suspenda as bact&eacute;rias em cada po&ccedil;o utilizando uma pipeta multicanal. Me&ccedil;a a DO600 com um leitor de microplacas apropriado, para confirmar o crescimento ocorrendo em todos os po&ccedil;os, exceto nos controles de assepsia da linha H. Utilize um leitor de placas equipado com c&acirc;mara de incuba&ccedil;&atilde;o e capaz de realizar leituras cin&eacute;ticas de fluoresc&ecirc;ncia para detectar a convers&atilde;o de resazurina. Configure uma medida cin&eacute;tica de fluoresc&ecirc;ncia de 24 horas utilizando uma excita&ccedil;&atilde;o de 530 nan&ocirc;metros e emiss&atilde;o de 590 nan&ocirc;metros.Configure a temperatura da câmara em 37 graus Celsius e realize a leitura da placa a cada 20 minutos. Configure o leitor de placas para medir a partir da parte inferior da placa de acordo com as instruções do fabricante. Prepare-se para lavar a placa adicionando 200 microlitros de PBS em cada poço de uma placa estéril de 96 poços com uma pipeta multicanal.Em seguida, prepare o meio de recuperação de biofilme, adicionando 400 microlitros de uma solução estoque de resazurina a 0,8 miligrama por mililitro ao meio CRPMI, totalizando 20 mililitros, para obter uma concentração final de 16 microgramas por mililitro de resazurina. A seguir, adicione 150 microlitros do meio de recuperação de biofilme com uma pipeta multicanal a cada poço de uma placa fresca de 96 poços. Transfira a placa de desafio do incubador para uma cabine de segurança biológica e remova cuidadosamente o saco plástico e a película selante.Remova a tampa com pinos da placa de desafio e enxágue as células planctônicas em PBS como antes, mantendo a parte inferior da placa de desafio para análise subsequente de OD600. Após a lavagem, coloque a tampa com pinos na parte inferior da placa contendo o meio de recuperação de biofilme. Envolva a lateral da placa com filme de parafina, tomando cuidado para não obstruir o fundo das poças periféricas.Imediatamente após envolver a placa, coloque-a no leitor de placas e inicie uma leitura cinética ao longo de um período de 24 horas, iniciando o protocolo cinético de resazurina previamente configurado. Para quantificar o crescimento de células planctônicas que pode ou não ocorrer durante o desafio, leia a OD600 de toda a parte inferior da placa de desafio utilizando um leitor de microplacas. É mostrado aqui um exemplo de layout de uma placa de desafio, utilizando duas diluições completas para titular as concentrações do composto.Os biofilmes cultivados foram tratados com neocuproína ou seu complexo de cobre. Leituras de OD600 na parte inferior da placa de desafio após 24 horas revelaram que o complexo de cobre da neocuproína, mas não a neocuproína isolada, impediu a liberação e o subsequente crescimento de células viáveis provenientes dos biofilmes tratados em concentrações de 1,25 micromolar ou superiores. Os biofilmes correspondentes foram então testados pelo ensaio de resazurina.A inspeção visual após 24 horas permite uma resposta rápida do tipo sim-não quando várias placas são analisadas em paralelo. A resazurina torna-se rosa em poços com biofilmes viáveis, mas permanece azul quando o biofilme foi erradicado. Uma leitura cinética da conversão da resazurina pode revelar efeitos dependentes da concentração sobre a viabilidade do biofilme, como mostrado aqui com a gentamicina.O atraso dependente da concentração no início da conversão do corante indica uma diminuição na viabilidade do biofilme. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de não bater os pinos contra as laterais dos poços.

targeting-biofilm-associated-staphylococcus-aureus-using-resazurin

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Testes de susceptibilidade antimicrobiana Atualmente, o diagnóstico baseia-se no crescimento planctônico dos isolados em ricas em nutrientes, condições aeróbicas. Aqui, nós utilizamos um meio de escarro alternativa artificial para estudar susceptibilidade antimicrobiana de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa em ambas as condições de aerobiose e microaerofilia mais representativas do pulmão da fibrose cística.

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística

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Fonte: Zhang, M. et al., Teste Rápido de Suscetibilidade Antimicrobiana por Imagem de Espalhamento Raman Estimulado da Incorporação de Deutério em uma única Bactéria. J. Vis. Experiência (2022)Este vídeo demonstra a aplicação da microscopia de espalhamento Raman estimulado para avaliar a suscetibilidade a antibióticos, acompanhando a atividade metabólica marcada com deutério. Ao monitorar sinais de carbono-deutério, o método permite a rápida detecção de populações bacterianas resistentes e...

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Biossensores fagos líticos e contas de anticorpos são capazes de discriminar entre resistente à meticilina (MRSA) e bactérias estafilococos sensíveis. Os fagos foram imobilizadas por um método de Langmuir-Blodgett sobre uma superfície de um sensor de microbalança de cristal de quartzo e trabalhado como de largo espectro de estafilococos sondas. Contas de anticorpos reconhecer MRSA.

Biossensor para detecção de bactérias Staphylococcus resistente a antibióticos

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Este protocolo tem como objetivo descrever como estudar a extensão da internalização do Staphylococcus aureus e sua capacidade de sobreviver dentro da célula hospedeira humana, bem como a eficácia intracelular de compostos antimicrobianos.

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Desenvolvimento de um modelo de biofilme de colônia polimicrobiana para testar antimicrobianos na fibrose cística

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Dish microtitulação Assay formação de biofilme

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O uso do fluxo de gotejamento e Reatores de disco rotativo para Staphylococcus aureus Análise de biofilme

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Segmentação de biofilme Associated

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