Segmentação de biofilme Associated

O objetivo geral deste procedimento é cultivar de forma fácil e reprodutível biofilmes bacterianos em formato de placa de 96 poços, sobre pinos acoplados à tampa, para testes de suscetibilidade a antibióticos utilizando um corante de viabilidade. Este método pode auxiliar na resposta de questões fundamentais na área de descoberta e desenvolvimento de antibióticos, ao explorar atividades sobre células associadas a biofilmes, que muitas vezes são mais representativas de estados de infecção in vivo. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de desafiar facilmente biofilmes pré-formados em um ensaio de três etapas e determinar a inibição com o uso de um corante de viabilidade comum.

Para começar, cultive um organismo produtor de biofilme em um meio rico em nutrientes. Inocule a cepa de Staphylococcus aureus Newman a partir de um estoque glicerinado em 10 mililitros de meio Muller-Hinton. Realize todos os procedimentos que envolvam o manuseio de S. aureus com luvas e dentro de uma cabine de segurança biológica.

Incubar por 16 horas a 37 graus Celsius em agitador rotativo. Adicione o volume calculado de cultura a um tubo de centrífuga e pelote as células por um minuto a 10.000 Gs. Para preparar o inóculo de biofilme, aspire o meio de crescimento usado e re-suspenda o pellet celular em 20 mililitros de CRPMI. Usando uma pipeta multicanal de 200 microlitros, adicione 125 microlitros de inóculo de um reservatório de 25 mililitros a cada poço das linhas A a G da placa inferior.

Adicione 125 microlitros de meio CRPMI estéril em cada poço da linha H como controle de assepsia. Pegue a tampa com pinos e segure-a acima do fundo da placa com os pinos voltados para baixo. Alinhe cuidadosamente cada pino com o respectivo poço.

Evite o contato físico entre a placa e os pinos. Uma vez alinhado, abaixe cuidadosamente a tampa. Sobreponha a tampa à placa com filme de parafina para evitar evaporação e coloque-a em um saco plástico fechável, vedando firmemente.

Mantenha o volume de ar na bolsa o mais baixo possível para minimizar a evaporação. Incube a placa sem agitação a 37 graus Celsius por 48 horas, em uma estufa com 5% de dióxido de carbono. No dia do desafio com biofilme, pegue uma placa fresca de 96 poços e adicione 100 microlitros de CRPMI, equilibrado à temperatura ambiente, a cada poço das linhas B a H. Dilua até quatro compostos-teste separadamente, em 1,0 mililitro de CRPMI, até 2x a concentração final desejada.

Adicione 200 microlitros do composto 1 nos poços A1-A3. 200 microlitros do composto 2 nos poços A4-A6. 200 microlitros do composto 3 nos poços A7-A9. E 200 microlitros do composto 4 nos poços A10-A12. Dilua seriamente os compostos em teste utilizando uma pipeta multicanal.

Inicie transferindo 100 microlitros da linha A para a linha B e misture. Dessa forma, continue transferindo 100 microlitros de poço em poço. Misture após cada transferência e pare na linha F. Após a mistura, despreze 100 microlitros da linha F em um recipiente de resíduos.

Não transfira nenhum líquido para as linhas G e H. Por fim, adicione 100 microlitros de CRPMI a cada poço da placa utilizando uma pipeta multicanal, para obter um volume final de 200 microlitros. Adicione 200 microlitros de solução salina tamponada com fosfato a uma placa estéril e nova de 96 poços que apresente poços com dimensões idênticas às da placa de iniciação do biofilme. Em seguida, remova o saco plástico e a película de parafina da placa de iniciação do biofilme incubada.

Levante a tampa verticalmente, evitando o contato entre os pinos e o fundo da placa, pois isso pode danificar o biofilme. Guarde a parte inferior para análise subsequente de OD600. Remova as células planctônicas lavando a tampa com pinos colocando-a sobre a placa contendo PBS.

Mergulhe os pinos por cinco segundos. Retire-os do PBS e mergulhe-os novamente, tomando cuidado para não bater os pinos nas paredes dos poços. Coloque a tampa com os pinos lavados na placa de desafio.

Evite o contato desnecessário entre os pinos e a placa inferior, pois isso danificará o biofilme, levando a resultados inconsistentes. Selle a placa com filme de parafina e coloque-a em um saco plást combustível, como antes. Incube a placa, sem agitação, por 24 horas a 37 graus Celsius, em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono.

Retire o fundo da placa de iniciação de biofilme e re-suspenda as bactérias em cada poço utilizando uma pipeta multicanal. Meça a DO600 com um leitor de microplacas apropriado, para confirmar o crescimento ocorrendo em todos os poços, exceto nos controles de assepsia da linha H. Utilize um leitor de placas equipado com câmara de incubação e capaz de realizar leituras cinéticas de fluorescência para detectar a conversão de resazurina. Configure uma medida cinética de fluorescência de 24 horas utilizando uma excitação de 530 nanômetros e emissão de 590 nanômetros.

Configure a temperatura da câmara em 37 graus Celsius e realize a leitura da placa a cada 20 minutos. Configure o leitor de placas para medir a partir da parte inferior da placa de acordo com as instruções do fabricante. Prepare-se para lavar a placa adicionando 200 microlitros de PBS em cada poço de uma placa estéril de 96 poços com uma pipeta multicanal.

Em seguida, prepare o meio de recuperação de biofilme, adicionando 400 microlitros de uma solução estoque de resazurina a 0,8 miligrama por mililitro ao meio CRPMI, totalizando 20 mililitros, para obter uma concentração final de 16 microgramas por mililitro de resazurina. A seguir, adicione 150 microlitros do meio de recuperação de biofilme com uma pipeta multicanal a cada poço de uma placa fresca de 96 poços. Transfira a placa de desafio do incubador para uma cabine de segurança biológica e remova cuidadosamente o saco plástico e a película selante.

Remova a tampa com pinos da placa de desafio e enxágue as células planctônicas em PBS como antes, mantendo a parte inferior da placa de desafio para análise subsequente de OD600. Após a lavagem, coloque a tampa com pinos na parte inferior da placa contendo o meio de recuperação de biofilme. Envolva a lateral da placa com filme de parafina, tomando cuidado para não obstruir o fundo das poças periféricas.

Imediatamente após envolver a placa, coloque-a no leitor de placas e inicie uma leitura cinética ao longo de um período de 24 horas, iniciando o protocolo cinético de resazurina previamente configurado. Para quantificar o crescimento de células planctônicas que pode ou não ocorrer durante o desafio, leia a OD600 de toda a parte inferior da placa de desafio utilizando um leitor de microplacas. É mostrado aqui um exemplo de layout de uma placa de desafio, utilizando duas diluições completas para titular as concentrações do composto.

Os biofilmes cultivados foram tratados com neocuproína ou seu complexo de cobre. Leituras de OD600 na parte inferior da placa de desafio após 24 horas revelaram que o complexo de cobre da neocuproína, mas não a neocuproína isolada, impediu a liberação e o subsequente crescimento de células viáveis provenientes dos biofilmes tratados em concentrações de 1,25 micromolar ou superiores. Os biofilmes correspondentes foram então testados pelo ensaio de resazurina.

A inspeção visual após 24 horas permite uma resposta rápida do tipo sim-não quando várias placas são analisadas em paralelo. A resazurina torna-se rosa em poços com biofilmes viáveis, mas permanece azul quando o biofilme foi erradicado. Uma leitura cinética da conversão da resazurina pode revelar efeitos dependentes da concentração sobre a viabilidade do biofilme, como mostrado aqui com a gentamicina.

O atraso dependente da concentração no início da conversão do corante indica uma diminuição na viabilidade do biofilme. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de não bater os pinos contra as laterais dos poços.