A Passo a Passo Protocolo de Cirurgia sub-retiniana em Coelhos

O objetivo geral desta intervenção cirúrgica é substituir o epitélio pigmentar da retina disfuncional, ou EPR, para encontrar uma possível cura para doenças relacionadas ao EPR, como a degeneração macular relacionada à idade. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo optométrico sobre terapia baseada em células e degeneração macular relacionada à idade. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode fornecer uma modalidade de transporte para substrato de substituição celular ou dispositivos de liberação de medicamentos para o espaço sub-retiniano.

Embora esse método possa fornecer informações sobre vitrectomia e cirurgia sub-retiniana em coelhos, ele também pode ser usado em outros organismos modelo, como porcos, macacos ou humanos. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois não apenas a cirurgia intraocular é complexa, mas também o pessoal, a organização e a tecnologia para esse procedimento devem estar bem sincronizados. Demonstrando o procedimento de carregamento de instrumentos estarão Fabian Thieltges, um pós-doutorado, e Ralf Brinken, uma enfermeira cirúrgica, ambos do meu laboratório.

Antes de iniciar a cirurgia, confirme o nível apropriado de anestesia e aplique pomada ocular no outro olho não operado do animal. Em seguida, coloque o coelho sob um microscópio cirúrgico do lado esquerdo, com o olho direito voltado para cima e o nariz ligeiramente elevado por uma dobra de cobertor. Desinfete o olho por um minuto com algumas gotas de iodopovidona.

Em seguida, enxágue o olho com BSS estéril e cubra a cabeça do animal com uma cortina estéril com uma abertura ocular pré-cortada. Coloque um pedaço de 12 por 17 centímetros de incisão cirúrgica pegajosa sobre o olho e use uma tesoura para expor o olho com uma incisão horizontal na linha média. Usando paquímetros invertidos, desloque o olho para a posição proptosa e prenda o tecido com uma sutura de seda 3-0.

Em seguida, use uma tesoura Vannas para incisar a conjuntiva perto do limbo, a aproximadamente um milímetro dos vasos sanguíneos adjacentes, e aumente a peritomia paralela ao limbo. Separe a conjuntiva sem rodeios, seguida por uma incisão vertical perpendicular de seis a sete milímetros para fazer um T" na conjuntiva. Faça outra pequena peritomia em torno da posição das 2 horas.

Em seguida, insira cuidadosamente a ponta de uma lâmina microvitreorretiniana de calibre 23 através da esclera, apontando para o pólo posterior do olho a 3,5 milímetros do limbo na posição de 8 horas. Para evitar o aumento da incisão, retraia lentamente a lâmina na mesma direção e pré-coloque uma sutura de Vicryl 7-0. Em seguida, insira uma cânula de infusão de porta lateral personalizada na abertura escleral e use a sutura pré-colocada para prender a cânula.

Defina a pressão intraocular em 20 a 24 milímetros de mercúrio. Em seguida, use um trocarte de cabeça chata de calibre 25 para perfurar a esclera na posição de 2 horas e insira uma luz de lustre de calibre 25 na porta. Prenda a luz com fita adesiva e ajuste-a para cerca de 30% de potência e, em seguida, ajuste individualmente.

Use um bisturi 20 para remover o epitélio edematoso da córnea para facilitar uma melhor visualização intraocular. Agora, execute outra esclerotomia com a lâmina microvitreorretiniana de calibre 23 às 10 horas e coloque uma sutura de Vicryl 7-0 em forma de U ao redor da esclera incisa sem dar o nó completamente. Insira a ponta de um vitrator de alta velocidade na incisão e comece a vitrectomia ao redor da porta de entrada.

Corte o humor vítreo em pequenos pedaços a um máximo de 2.000 a 3.000 cortes por minuto, continuando a vitrectomia sobre o disco óptico e as fibras-medulares e aspirando a um máximo de 200 milímetros de mercúrio. Para separar suavemente o humor vítreo da retina, segure o vitrecor sobre o pólo posterior e inferior do disco e continue a aspirar sem cortar. Quando o descolamento do vítreo posterior estiver completo, injetar por via intravítrea aproximadamente 50 microlitros do composto de interesse para visualizar o vítreo flutuante durante sua remoção quase total.

Quando o olho estiver preparado, enxágue a cultura de células de implantação três vezes com BSS de grau oftálmico não suplementado. Em seguida, encha uma placa de cultura de células de 100 por 20 milímetros com 10 mililitros de BSS de grau oftálmico e adicione a inserção de cultura de células à placa. Centralize o prato sob um microscópio de luz e use uma agulha oca oval afiada feita sob medida para perfurar um substrato plano em forma de feijão de 2,4 por 1,1 milímetros com duas bordas longas e duas bordas redondas para fora da cultura de células.

Inunde suavemente a agulha através da segunda porta com BSS para lavar o implante na placa de cultura de células preenchida com BSS. Para obter uma terceira borda, faça uma incisão de 0,5 mililitro em uma das extremidades redondas do implante e use uma pinça de peeling de membrana de calibre 23 para transferir o implante para a estação de carregamento feita sob medida. Certifique-se de que o implante esteja na posição vertical e, em seguida, use a pinça para empurrar suavemente o implante completamente no instrumento do atirador até que todo o tecido esteja preso dentro da ponta e coloque a ponta do atirador na estação de carregamento sob BSS até que as células sejam implantadas.

Para permitir a implantação das células sob a retina, aproxime-se da retina neural com uma agulha de injeção sub-retiniana extensível de calibre 41 conectada a uma seringa à prova de gás e injete sub-retinalmente BSS para criar um descolamento de retina de bolha. Quando a bolha tiver cerca de 2 a 3 de diâmetro de disco, use uma tesoura VR vertical de calibre 23 para ampliar a retinotomia para 1,5 milímetros e use uma faca de incisão de 1,4 milímetro para estender com precisão a esclerotomia das 10 horas para uma abordagem de calibre 20. Em seguida, tente passar um manequim de atirador de calibre 20 pela esclerotomia, ampliando a incisão conforme necessário para garantir uma transição suave, mas confortável, do atirador carregado.

Em seguida, passe o disparador carregado pela incisão escleral a 20 a 24 milímetros de mercúrio até a borda da retinotomia e injete o implante sub-retinalmente a partir de uma posição epirretiniana. O atirador deve fazer a transição pela esclera rapidamente na primeira tentativa, portanto, certifique-se de uma esclerotomia de tamanho ideal. As células RPE devem então ser implantadas sub-retinalmente em um ângulo raso para evitar o aprisionamento da borda de ataque do implante na membrana de Bruch.

Ajuste o implante para que seja colocado sob a retina razoavelmente longe da retinotomia. Em seguida, remova a porta da esclerotomia e injete 25 microlitros de triancinolona através da porta do lustre. Usando suturas 7-0, feche as esclerotomias de 2 e 10 horas e verifique se há vazamentos.

Remova a cânula de infusão e feche imediatamente a última esclerotomia com a sutura Vicryl 7-0 pré-colocada. Usando uma agulha de calibre 30, injete BSS para ajustar a pressão intraocular conforme necessário, enquanto palpa. Por fim, suturar a conjuntiva com Vicryl 7-0 e retirar a seda proptosa, tomando cuidado para evitar o plexo venoso orbitário profundo.

O enxerto sob a retina tem uma taxa de sucesso cirúrgico de aproximadamente 60% quando uma vitrectomia central é realizada, que aumenta para mais de 75% quando um descolamento do vítreo posterior é induzido. Aqui, uma imagem de refletância infravermelha de oftalmoscópio a laser de varredura do epitélio pigmentar da retina cultivado com xenotransplante em uma membrana de poliéster após um procedimento não complicado é mostrada, com a atrofia dos fotorreceptores resultante da reação imune aparecendo como um halo ao redor do implante. Nesta imagem de tomografia de coerência óptica de domínio espectral correspondente, pode-se observar afinamento da camada nuclear externa como resposta ao xenotransplante do EPR, principalmente na retina com uma faixa hiper-reflexiva visível acima do implante.

A retina neural adjacente ao implante, no entanto, exibe bandas de reflexão quase normais, sugerindo uma entrega atraumática do implante. Conforme observado pela coloração H/E, cicatrizes sub-retinianas e atrofia da camada nuclear externa ocorrem em coelhos xenotransplantados não imunossuprimidos. A membrana de Bruch sob o implante também parece ser contígua, com o coriocapilar contendo alguns eritrócitos dispersos, confirmando ainda mais a falta de trauma ocorrido durante a entrega do implante.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em uma hora se nenhuma complicação for encontrada. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de criar uma bolha retiniana e retinotomia grande o suficiente para caber no implante. Além disso, uma intervenção cirúrgica mais rápida normalmente produzirá melhores resultados.

Após esse procedimento, outros métodos, como tomografia de coerência óptica ou histologia, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como sucesso do transplante, biocompatibilidade sub-retiniana e sobrevivência das células transplantadas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de biologia de células-tronco e biomateriais explorarem a entrega sub-retiniana de derivados de células-tronco e/ou substratos carreadores biofuncionalizados para doenças da retina, particularmente o RPE. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a vitrectomia e a cirurgia de implante sub-retiniano em coelhos.

Não se esqueça de que trabalhar com a lente, a interface vítreo-retiniana e sub-retiniana pode ser extremamente perigoso e que precauções como posicionamento adequado das mãos, boa visualização e pressão intraocular estável devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.