Visualização dos Vascular e parênquima regeneração após 70% hepatectomia parcial em ratos normais

Visualização da regeneração vascular e parenquimatosa após hepatectomia parcial a 70% em camundongos normais. Tradicionalmente, a regeneração hepática é avaliada medindo o aumento do peso e do volume do fígado, bem como pela determinação da taxa de proliferação de hepatócitos. Atualmente, estamos interessados na regeneração vascular do fígado em camundongos e queremos visualizar e quantificar o crescimento vascular.

Assim, estabelecemos o fluxo de trabalho para a geração de imagens da regeneração vascular. O fluxo de trabalho consiste em quatro etapas: contraste da árvore vascular, aquisição de tomografias computadorizadas, reconstrução 3D e análise quantitativa e qualitativa das imagens resultantes. O fluxo de trabalho começa com o contraste da árvore vascular.

Primeiro expomos o fígado, normal ou ressecado, depois injetamos o composto de contraste de silicone polimerizante na veia porta ou na veia hepática, dependendo do sistema vascular de interesse. Em seguida, os fígados explantados são submetidos a varredura em um MicroCT. Após a digitalização, realizamos uma reconstrução vascular 3D usando o software pré-clínico Imalytics.

Se a qualidade técnica das imagens resultantes for boa o suficiente, a reconstrução 3D pode ser realizada usando o HepaVision. Este programa é usado em clínicas para planejamento de cirurgia hepatobiliar. Além da visualização 3D da árvore vascular, este programa permite a visualização e cálculo do volume hepático, do fígado total e de cada lobo, com base nos vasos supridores e drenantes.

Após a reconstrução, podemos determinar parâmetros adicionais indicativos de crescimento vascular, como o comprimento e o diâmetro de um vaso específico, com a ajuda de técnicas computacionais. Isso permitirá uma descrição quantitativa do crescimento vascular. Por outro lado, as amostras Microfil fixadas em formalina podem ser cortadas em seções seriais.

As seções seriais podem ser coradas e digitalizadas usando um scanner de lâminas inteiras. Após o registro rígido e elástico de cortes seriados, as árvores vasculares 3D dos sistemas venoso portal e hepático podem ser reconstruídas. Em uma etapa futura, queremos explorar a distribuição espacial de eventos moleculares.

Um exemplo de evento molecular de interesse na regeneração hepática é o aparecimento do marcador de proliferação Ki-67 nos núcleos dos hepatócitos e sua distribuição espacial nas árvores vasculares reconstruídas em 3D. A seguir, daremos uma introdução detalhada de como realizar a injeção de Microfil. Preparação dos reagentes.

Para a mistura de compostos Microfil, precisamos de diluente MV, composto MV, no nosso caso, o MV-120 azul e agente de cura. Também precisamos de pipetas, tubos e um pipetador. Prepare dois mililitros MV-120 em um tubo de cinco mililitros.

Em seguida, dilua-o adicionando três mililitros de diluente MV. Misture-os agitando suavemente. Para solução salina de heparina, adicione 1 mililitro de heparina a 10 mililitros de solução salina.

Preparando a mesa de operação. Primeiro, precisamos de um microscópio, segundo, é necessário um conjunto de consumíveis. Suturas de seda 6-0 e polipropileno 6-0, seringas de cinco mililitros e um mililitro, agulhas de calibre 30 e 21, tubo de extensão para conexão de seringa e cateter, cateter de calibre 26 com inserção de agulha, pontas de algodão e gaze.

Em terceiro lugar, são necessários instrumentos cirúrgicos. Micro instrumentos, pinças e coagulador elétrico. Quarto, é necessária uma bomba de perfusão.

Preparando o animal. Coloque o camundongo na câmara de indução de anestesia e anestesie o camundongo com 2% de isoflurano e 0,3 mililitro por minuto de oxigênio. Fixe o mouse anestesiado na mesa cirúrgica usando fitas, com inalação contínua de isoflurano a 2% e oxigênio a 0,3 mililitro por minuto.

Injeção de microfil, sistema venoso portal. Faça uma incisão transversal no abdômen usando uma tesoura para a camada de pele e um coagulador elétrico para a camada muscular. Mova os intestinos para o lado esquerdo usando pontas de algodão e cubra os intestinos com gaze embebida em solução salina.

Disseque a veia porta ao microscópio. Coloque a sutura de seda 6-0 sob a veia porta extra-hepática em aproximadamente um milímetro de distância de sua bifurcação. Amarre-o frouxamente para uso posterior.

Injete a solução salina de heparina por uma veia peniana para heparinização sistêmica por cinco minutos. Esta animação demonstrará o procedimento de inserção do cateter. Primeiro, coloque a sutura de seda 6-0 embaixo da veia porta extra hepática, depois insira o cateter de calibre 26 na veia porta e fixe-o usando uma pinça.

Ligue a sutura pré-colocada para fixar o cateter e bloquear o fluxo sanguíneo da veia esplênica e da veia mesentérica. Aqui vamos demonstrar o procedimento cirúrgico. Insira o cateter de calibre 26 com a agulha.

Insira o cateter e retire a agulha lentamente ao mesmo tempo. Fixe o cateter usando uma pinça. Encha o cateter completamente com solução salina de heparina para evitar bolhas de ar.

Conecte o tubo de extensão ao cateter e fixe-o firmemente. Ligue a bomba de perfusão. Inicie a perfusão salina de heparina com uma taxa de fluxo de 0.4 mililitro por minuto.

Observe os lobos direitos ficando pálidos imediatamente após a perfusão. Enxágue o fígado com soro fisiológico para mantê-lo úmido durante todo o procedimento de perfusão. Eutanasiar o camundongo por exsanguinação via perfusão sob anestesia.

Continue a perfusão de heparina por vários minutos até que todo o fígado fique pálido. Antes da perfusão de Microfil, adicione 0,1 mililitro de agente de cura ao composto Microfil preparado para acelerar o procedimento de polimerização. Carregue o composto Microfil em seringa de cinco mililitros e tubo de extensão.

Livre-se das bolhas de ar injetando a solução salina de heparina no cateter, da mesma forma que antes. Conecte o tubo ao cateter e fixe-o firmemente. Inicie a injeção de Microfil com uma taxa de fluxo de 0,2 mililitro por minuto por aproximadamente um a dois minutos.

Observe o agente azul se espalhando lentamente nos ramos da veia porta. Pare a perfusão quando a estrutura azul do vaso aparecer na superfície de cada lobo do fígado, conforme indicado em um círculo vermelho. Deixe o fígado por pelo menos 15 minutos para a polimerização do composto Microfil.

Injeção de microfil, sistema venoso hepático. O procedimento segue basicamente os mesmos passos da injeção no sistema venoso portal. Coloque uma sutura de seda 6-0 sob a veia porta extra hepática em aproximadamente um milímetro de distância de sua bifurcação.

Em seguida, insira um cateter na veia porta e fixe-o por meio de uma pinça. Insira outro cateter na veia cava inferior e fixe-o também com uma pinça. Ligue a sutura pré-colocada para fixar o cateter e bloquear o fluxo sanguíneo da veia esplênica e da veia mesentérica.

Coloque uma pinça na veia cava inferior supra-hepática para obstruir o fluxo de saída do fígado. Ligue ramos da veia cava inferior, incluindo as veias renais e a extremidade distal da veia cava inferior. Lave o fígado usando solução salina de heparina através do cateter um.

Perfundir o sistema venoso hepático com o composto Microfil através do cateter dois. Resultados, reconstrução da micro CT. Obtivemos reconstruções vasculares 3D usando o software pré-clínico Imalytics após a microtomografia computadorizada.

A regeneração vascular nos sistemas venoso portal e hepático apareceu como alongamento e alargamento das principais estruturas vasculares em combinação com uma ramificação de vasos menores. No segundo dia de pós-operatório, as árvores vasculares dos lobos remanescentes se alongaram. No sétimo dia de pós-operatório, pequenos ramos adicionais da mesma veia porta principal e da veia hepática tornaram-se visíveis.

Resultados, reconstrução codificada por cores 3D da árvore vascular hepática e dos territórios hepáticos dependentes. Cada lobo do fígado foi facilmente visualizado em todas as três dimensões após a reconstrução codificada por cores pela HepaVision. Conforme indicado na tabela, os volumes hepáticos do fígado total e de cada lobo foram determinados, conforme mostrado aqui, para o sistema venoso hepático de um fígado normal.

Resultados, cortes seriados e reconstrução. Por outro lado, a amostra Microfil fixada em formalina foi submetida a seccionamento seriado. Os cortes seriados corados foram digitalizados usando um scanner de lâmina inteira e usados para reconstrução da árvore vascular de ambos os sistemas.

Estas são seções transversais de uma pilha de seções seriais de fígado de camundongo antes e depois do registro rígido e elástico. Após o registro no computador, os sistemas venoso portal e venoso hepático podem ser reconstruídos em um único modelo 3D. Essa etapa manual e computacionalmente demorada precisa de mais otimização.

O próximo passo, ou seja, a visualização da distribuição espacial dos eventos moleculares em relação às árvores vasculares, está atualmente em desenvolvimento. Esta etapa pode ser vista como uma fusão de informações de Micro CT derivadas da árvore vascular contrastada com informações histológicas ou como uma visualização 3D de informações puramente histológicas. Nesse caso, as informações da Micro CT serviriam como controle de qualidade para a exigente reconstrução 3D baseada em histologia.

Uma vez alcançado, temos uma ferramenta para investigar melhor a regeneração hepática. Especialmente a distribuição espacial dos eventos moleculares e do parênquima hepático em relação à regeneração vascular.