Murino Hind Limb Ossos Longos Dissecção e Medula Óssea O isolamento

O objetivo geral deste procedimento de dissecção de ossos longos e isolamento da medula óssea é remover rápida e sistematicamente os ossos longos e coletar a medula óssea para posterior análise a jusante. Este método pode ajudar a responder a questões-chave relacionadas à biologia da medula óssea, metástase de câncer e imunologia. A principal vantagem desta técnica é que o processo de dissecção é rápido e padronizado, o procedimento de isolamento da medula óssea é bastante estéril, Comece posicionando o mouse em decúbito dorsal.

Em seguida, prenda todas as quatro almofadas das patas abaixo da articulação do tornozelo e borrife o mouse com etanol a 70%, encharcando completamente as pernas. Em seguida, faça uma pequena incisão à direita da linha média na parte inferior do abdômen, logo acima do quadril, e estenda a incisão pela perna e pela articulação do tornozelo. Puxe a pele para trás.

Em seguida, corte o músculo quadríceps ancorado na extremidade proximal do fêmur para expor o lado anterior do fêmur e prenda o músculo da perna com o pino em um ângulo de 45 graus em relação à placa. Com a tesoura contra a parte posterior do fêmur, corte os isquiotibiais da articulação do joelho. Em seguida, puxe para trás a pele e os músculos isquiotibiais ancorados na extremidade proximal do fêmur para expor o lado posterior do osso e prenda os músculos isquiotibiais para fora da perna, colocando o pino em um ângulo de 45 graus.

Com a pinça, segure a extremidade distal do fêmur logo acima da articulação do joelho. Em seguida, guie as lâminas da tesoura em ambos os lados da diáfise femoral em direção à articulação do quadril. Depois de atingir a cabeça femoral, gire a tesoura, movendo a lâmina superior diretamente sobre a cabeça femoral para deslocar o fêmur.

Agora segure a parte superior da diáfise femoral com a pinça e corte o tecido mole da cabeça do fêmur para liberar o fêmur do acetábulo. Em seguida, puxe todo o osso da perna, incluindo o fêmur, joelho e tíbia, para cima e para longe do corpo, e corte cuidadosamente o tecido conjuntivo e o músculo que prende a perna à pele. Quando todo o tecido conjuntivo tiver sido removido, estenda demais a articulação do tornozelo e torça a tesoura como acabou de demonstrar para deslocar a tíbia.

Segurando a extremidade distal da tíbia e tomando cuidado para não cortar os tendões, puxe a tíbia para cima e para longe do corpo e da placa de pinos. Em seguida, remova qualquer tecido conjuntivo remanescente ligado ao osso longo do joelho e qualquer músculo ou tecido conjuntivo adicional ligado ao fêmur e à tíbia. Para preparar o osso longo para o isolamento da medula, segure o fêmur com a patela voltada para o lado oposto e a cabeça do fêmur voltada para baixo.

Estenda demais a articulação do joelho e gire a tesoura para deslocar a tíbia do fêmur. Em seguida, remova qualquer tecido conjuntivo que mantenha o fêmur e a tíbia juntos. Em seguida, segure o fêmur com o lado anterior voltado para longe e a cabeça do fêmur voltada para baixo e guie a tesoura pela diáfise femoral até os côndilos.

Gire suavemente a tesoura para frente e para trás para remover os côndilos, a patela e a epífise, expondo a metáfise. Em seguida, use a pinça, tesoura e Kimwipes para remover qualquer músculo adicional ou tecido conjuntivo preso ao fêmur. Em seguida, segure a tíbia com o lado anterior voltado para longe e a extremidade do tornozelo voltada para baixo.

Se a epífise tibial estiver intacta, guie a tesoura pela haste da tíbia até os côndilos e gire suavemente a tesoura para frente e para trás para remover os côndilos e a epífise, expondo a metáfise tibial. Em seguida, remova qualquer músculo adicional ou tecido conjuntivo ligado à tíbia, como acabamos de demonstrar. Para colher a medula óssea, primeiro empurre uma agulha de calibre 18 através do fundo de um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro.

Em seguida, coloque os ossos longos no tubo, com a ponta do joelho para baixo e feche a tampa. Aninhe o tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrifugue os tubos a mais ou igual a 10.000 vezes g em uma microcentrífuga por 15 segundos. Verifique se a medula óssea foi arrancada dos ossos por inspeção visual.

Os ossos devem parecer brancos e uma grande pelota deve ser visível no tubo maior. Em seguida, rejeitar os ossos do tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros e suspender a medula óssea na solução adequada para a análise a jusante desejada. Esta técnica de dissecção rápida é adequada para uma série de análises a jusante, incluindo histomorfometria e histologia.

De fato, como demonstrado por esta reconstrução 3D histomorfométrica representativa de micro-CT, tanto o osso esponjoso quanto a casca cortical são mantidos, permitindo uma quantificação precisa dos parâmetros estruturais padronizados para histomorfometria óssea. Neste corte histológico representativo de uma tíbia formal corada com H e E e fixa e descalcificada, pode-se observar a manutenção da integridade tanto do osso calcificado quanto da medula óssea celular para análise histológica. Além disso, a medula óssea isolada por este procedimento é adequada para muitas aplicações a jusante, incluindo a cultura de células primárias de osteoclastos ou osteoblastos.

Uma vez dominada, a técnica pode ser concluída em cerca de sete minutos, desde a dissecção do osso longo até o isolamento da medula óssea, se for realizada corretamente. Ao tentar o procedimento, é importante lembrar de posicionar o mouse para facilitar a dissecação. Após este procedimento, outros métodos, como FACS ou outros processos unicelulares podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre alterações nas populações de células da medula óssea.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar rapidamente os ossos longos de camundongos e isolar a medula óssea por centrifugação.