Name: Murino Hind Limb Ossos Longos Dissecção e Medula Óssea O isolamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Aprenda a dissecar ossos longos de membros posteriores de camundongos e isolar medula óssea por centrifugação em apenas sete minutos. Esta técnica padronizada preserva a integridade tecidual para análises histológicas e cultura celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelos nºs de concessão do NCI U54CA143803, CA163124, CA093900 e CA143055 a K.J.P. Os autores agradecem aos membros atuais e anteriores do laboratório Weilbaecher, especialmente Katherine Weilbaecher, Michelle Hurchla e Hongju Deng, e aos membros do Instituto Urológico Brady, especialmente aos membros do laboratório Pienta pela leitura crítica do manuscrito.

Todo o trabalho com animais foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais de acordo com as recomendações descritas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde.
1. Dissecção de ossos longos de membros posteriores
<ol>
	<li>Eutanásia do camundongo de acordo com as diretrizes institucionais.</li>
	<li>Posicione o mouse em decúbito dorsal e fixe prendendo as quatro pernas nas almofadas das patas do mouse abaixo da articulação do tornozelo.</li>
	<li>Pulverize o mouse com etanol 70%, molhando completamente as pernas.</li>
	<li>Faça uma pequena incisão à direita da linha média na parte inferior do abdômen, logo acima do quadril.</li>
	<li>Estenda a incisão pela perna e passe pela articulação do tornozelo.</li>
	<li>Puxe a pele para trás e corte o músculo quadríceps ancorado na extremidade proximal do fêmur para expor o lado anterior do fêmur e prender a perna, colocando o pino em um ângulo de 45 graus em relação à placa.</li>
	<li>Com a lâmina da tesoura contra a parte posterior do fêmur, corte os isquiotibiais da articulação do joelho.</li>
	<li>Puxe para trás a pele e os músculos isquiotibiais ancorados na extremidade proximal do fêmur para expor o lado posterior do fêmur e prenda a perna, colocando o pino em um ângulo de 45 graus em relação à prancha.</li>
	<li>Com a pinça, segure a extremidade distal do fêmur, logo acima da articulação do joelho. Guie as lâminas da tesoura em ambos os lados da diáfise femoral em direção à articulação do quadril, tomando cuidado para não cortar o próprio fêmur.</li>
	<li>Após atingir a cabeça femoral, indicada pela abertura leve da tesoura, gire a tesoura com a lâmina superior da tesoura movendo-se diretamente sobre a cabeça femoral para deslocar o fêmur, tomando cuidado para não quebrar o osso abaixo da cabeça femoral.</li>
	<li>Segure a parte superior da diáfise femoral com a pinça, corte o tecido mole da cabeça do fêmur para liberá-lo do acetábulo.</li>
	<li>Puxe todo o osso da perna, incluindo fêmur, joelho e tíbia, para cima e para longe do corpo, cortando cuidadosamente o tecido conjuntivo e o músculo que conecta a perna à pele.</li>
	<li>Estenda demais a articulação do tornozelo e use novamente a tesoura em um movimento de torção para deslocar a tíbia.</li>
	<li>Agarrando a extremidade distal da tíbia, tomando cuidado para não cortar os tendões, puxe a tíbia para cima e para longe do corpo e da placa de pinos.</li>
	<li>Corte qualquer tecido conjuntivo restante que prenda o osso longo ao camundongo no joelho.</li>
	<li>Remova qualquer músculo adicional ou tecido conjuntivo ligado ao fêmur e à tíbia.</li>
	<li>Para quaisquer aplicações que exijam que o osso permaneça intacto (histologia, histomorfometria, testes biomecânicos, etc.), prossiga com protocolos internos padrão (como em 4-7). Para isolar a medula óssea, prossiga para a seção 2.</li>
</ol>
2. Preparação de ossos longos para isolamento da medula óssea
<ol>
	<li>Usando a pinça, segure o fêmur com a patela voltada para longe e a extremidade proximal (cabeça femoral) para baixo.</li>
	<li>Estenda demais a articulação do joelho e use a tesoura em um movimento de torção para deslocar a tíbia e o fêmur.</li>
	<li>Corte qualquer tecido conjuntivo que mantenha o fêmur e a tíbia juntos.</li>
	<li>Usando a pinça, segure o fêmur com o lado anterior voltado para longe e a extremidade proximal (extremidade da cabeça femoral) para baixo.</li>
	<li>Guie a tesoura pela diáfise femoral até os côndilos.</li>
	<li>Gire suavemente a tesoura para frente e para trás para remover os côndilos, a patela e a epífise para expor a metáfise.</li>
	<li>Remova qualquer músculo adicional ou tecido conjuntivo preso ao fêmur usando fórceps, tesouras e Kimwipes.</li>
	<li>Usando a pinça, segure a tíbia com o lado anterior voltado para longe e a extremidade distal (extremidade do tornozelo) para baixo.</li>
	<li>Se a epífise tibial estiver intacta, guie a tesoura pela haste da tíbia até os côndilos.</li>
	<li>Gire suavemente a tesoura para frente e para trás para remover os côndilos e a epífise para expor a metáfise.</li>
	<li>Remova qualquer músculo adicional ou tecido conjuntivo preso à tíbia usando fórceps, tesouras e Kimwipes.</li>
</ol>
3. Isolamento da medula óssea
<ol>
	<li>Empurre uma agulha de 18 G pelo fundo de um tubo de microcentrífuga de 0,5 ml.</li>
	<li>Coloque os ossos longos (máximo de 2 fêmures e 2 tíbias) no tubo, com a extremidade do joelho para baixo e para baixo e feche a tampa.</li>
	<li>Encaixe o tubo de microcentrífuga de 0,5 ml em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugue os tubos aninhados a ≥ 10.000 x g em uma microcentrífuga por 15 segundos.</li>
	<li>Verifique se a medula óssea foi arrancada dos ossos por inspeção visual. Os ossos devem parecer brancos e deve haver um grande pellet visual no tubo maior.</li>
	<li>Rejeitar o tubo de microcentrífuga de 0,5 ml com os ossos.</li>
	<li>Suspenda a medula óssea em solução apropriada (por exemplo, PBS, meio de cultura, tampão FACS) e prossiga com o protocolo experimental (isolamento de DNA, RNA ou proteína, análise FACS ou cultura de células primárias).</li>
</ol>

<ol><li>McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ch.+80%5BTitle%5D)+AND+%22Primer+on+the+Metabolic+Bone+Diseases+and+Disorders+of+Mineral+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Ch. 80.</a> Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. , American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).</li>
<li>Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+to+bone%3A+a+fatal+attraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer to bone: a fatal attraction.</a> Nat Rev Cancer. 11 (6), 411-425 (2011).</li>
<li>Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prostate+cancer+bone+marrow+niche%3A+more+than+just+%27fertile+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil.</a> Asian J Androl. 14 (3), 423-427 (2012).</li>
<li>Amend, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin-1+regulates+bone+homeostasis+through+effects+on+bone+matrix+integrity+and+nitric+oxide+signaling+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts.</a> J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).</li>
<li>Hurchla, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epoxyketone-based+proteasome+inhibitors+carfilzomib+and+orally+bioavailable+oprozomib+have+anti-resorptive+and+bone-anabolic+activity+in+addition+to+anti-myeloma+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects.</a> Leukemia. 27 (2), 430-440 (2013).</li>
<li>Rauch, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ARF+tumor+suppressor+regulates+bone+remodeling+and+osteosarcoma+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice.</a> PLoS One. 5 (12), e15755(2010).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ADP+receptor+P2RY12+regulates+osteoclast+function+and+pathologic+bone+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling.</a> J Clin Invest. 122 (10), 3579-3592 (2012).</li>
<li>Dempster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+nomenclature%2C+symbols%2C+and+units+for+bone+histomorphometry%3A+a+2012+update+of+the+report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 28 (1), 2-17 (2013).</li>
<li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+development%3A+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).</li>
<li>Festing, M. F., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+design+and+statistical+analysis+of+experiments+using+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals.</a> ILAR J. 43 (4), 244-258 (2002).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Apresentamos um método simples e eficiente para remoção de ossos longos posteriores de camundongos e subsequente isolamento da medula óssea. Este método mantém a alta integridade estrutural e celular dos ossos e da medula óssea e tem baixo tempo de manuseio, minimizando a probabilidade de fratura induzida pelo usuário ou escore ósseo que pode influenciar as análises a jusante. Além disso, o método de centrifugação para isolar a medula óssea não requer o corte do osso para expor o espaço da medula óssea ou fluido para lavar a medula óssea, reduzindo os pontos potenciais de contaminação. Além disso, a técnica de centrífuga é de rendimento relativamente alto com menor tempo de prática do que outros métodos, reduzindo assim o tempo de processamento.
A alta variação é inerente aos estudos in vivo em camundongos devido à alta variação fenotípica de camundongo para camundongo. Para maximizar o impacto da pesquisa de estudos caros e trabalhosos com camundongos, é fundamental minimizar o erro técnico experimental9,10. O tempo desde o sacrifício do animal até a análise a jusante ou fixação do tecido introduz variações experimentais que podem superar mudanças sutis e reduzir grandes diferenças entre os grupos. Portanto, o processamento rápido de amostras é essencial para uma análise precisa dos dados. As técnicas de dissecção de ossos longos e isolamento da medula óssea descritas aqui são otimizadas para processamento rápido de animais e amostras para reduzir a variação técnica.
Este protocolo pode ser amplamente aplicado a muitos campos de pesquisa, incluindo a investigação do próprio tecido ósseo ou interrogação das células da medula óssea. Além disso, essa abordagem direta para a dissecção de ossos longos permitirá que pesquisadores em áreas relacionadas interroguem diretamente as contribuições ósseas, a fim de expandir nosso conhecimento sobre a disfunção da medula óssea em patologias pouco estudadas.

O estudo dos ossos longos e das células da medula óssea é fundamental para uma infinidade de disciplinas de pesquisa, incluindo, mas não se limitando a, biologia óssea, biologia do câncer, imunologia, hematologia e biomecânica. O osso é um órgão altamente dinâmico que, juntamente com a cartilagem, forma o esqueleto para fornecer suporte mecânico contra carga e proteção dos órgãos internos. Além disso, os componentes minerais do osso são um sumidouro de armazenamento para as moléculas sinalizadoras críticas cálcio e fósforo, além de outros fatores1. Finalmente, os ossos abrigam a medula óssea e, juntamente com osteoblastos formadores de osso metabolicamente ativos e osteoclastos de reabsorção óssea, fornecem o nicho de células-tronco necessário para a manutenção das populações de células hematopoiéticas e linfóides.
O osso e a medula óssea são afetados em muitos distúrbios, muitas vezes levando à disfunção da medula óssea, dor óssea intensa e fratura patológica. O osso é um local comum de metástase em muitos tumores sólidos, principalmente câncer de mama e câncer de próstata, onde as células tumorais envolvem diretamente o nicho da medula óssea para iniciar o ciclo vicioso de metástase óssea e deslocar células-tronco hematopoiéticas2,3. As neoplasias hematopoiéticas, incluindo mieloma e leucemia, são caracterizadas por disfunção da medula óssea, bem como desregulação da remodelação óssea saudável1. Outros distúrbios esqueléticos não malignos também são áreas ativas de pesquisa, como osteoartrite, osteoporose, escoliose e raquitismo. Mesmo em um indivíduo saudável, a falha biomecânica em um osso leva a uma fratura dolorosa. Todos esses distúrbios representam áreas ativas de pesquisa com o objetivo de identificar novas medidas preventivas e regimes de tratamento para reduzir a morbidade e a mortalidade.
Para pesquisar a infinidade de papéis do osso e da medula óssea, tanto em condições fisiológicas quanto patológicas, é fundamental que os pesquisadores tenham um método padronizado simples e eficiente para dissecação dos ossos longos do camundongo para processamento rápido de grandes experimentos in vivo. O protocolo de dissecção descrito aqui é adequado para todas as análises de ossos longos, incluindo imagens ex vivo, histologia, histomorfometria e testes de força, entre outros. Da mesma forma, um método padronizado de isolamento da medula óssea com alta recuperação de células da medula óssea e baixa variabilidade entre usuários é importante para análises experimentais, como classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) ou PCR quantitativo (qPCR), bem como aplicações a jusante, como cultura de células primárias de células da medula óssea.

<table><tbody><tr><td>Pinboard Pins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>70% Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça</td><td></td><td></td><td></td>de dissecção</tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>16 G agulha</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tubo</td><td></td><td></td><td></td>de microcentrífuga</tr><tr><td>0,5 ml Tubo</td><td></td><td></td><td></td>de microcentrífuga</tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

murino hind limb ossos longos dissecção e medula Óssea o isolamento

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

A investigação do osso e da medula óssea é crítica em muitos campos de pesquisa, incluindo biologia óssea básica, imunologia, hematologia, metástase de câncer, biomecânica e biologia de células-tronco. Apesar da importância do osso em estados saudáveis e patológicos, no entanto, é um órgão amplamente pouco pesquisado devido à falta de conhecimento especializado sobre dissecção óssea e isolamento da medula óssea. Os camundongos são um organismo modelo comum para estudar os efeitos no osso e na medula óssea, necessitando de um método padronizado e eficiente para dissecção de ossos longos e isolamento da medula óssea para processamento de grandes coortes experimentais. Descrevemos um procedimento de dissecção simples para a remoção do fêmur e da tíbia que é adequado para aplicações a jusante, incluindo, mas não se limitando a, análise histomorfológica e teste de força. Além disso, descrevemos um procedimento rápido para isolamento da medula óssea dos ossos longos por centrifugação com tempo de manuseio limitado, ideal para classificação de células, cultura de células primárias ou extração de DNA, RNA e proteínas. O protocolo é simplificado para processamento rápido de amostras para limitar o erro experimental e é padronizado para minimizar a variabilidade de usuário para usuário.

O protocolo descrito aqui é otimizado para a dissecação rápida do fêmur e da tíbia de camundongo com o mínimo de danos ao tecido ósseo. Esta técnica é adequada para diversas análises posteriores, incluindo estudos de biomecânica, histomorfometria (Figura 1A - B) e histologia (Figura 1C)4,7. A reconstrução tridimensional representativa de microTC histomorfométrica (Figura 1A - B) demonstra que tanto o osso trabecular quanto a camada cortical são mantidos, permitindo a quantificação precisa de parâmetros estruturais padronizados para histomorfometria óssea, incluindo número, espessura e espaçamento trabecular; volume ósseo; e espessura cortical, entre outras medidas8. A seção histológica representativa mostra uma tíbia corada com H&amp;E, fixada em formalina e descalcificada (Figura 1C). A imagem demonstra a integridade tanto do osso calcificado quanto da medula óssea celular para análise histológica.
O procedimento de isolamento da medula óssea preserva a esterilidade do espaço medular, possui baixa manipulação para reduzir contaminação e não requer o corte do osso longo, reduzindo assim a perda no rendimento da medula óssea. Esta medula óssea é adequada para diversas aplicações posteriores, incluindo citometria de fluxo5 e análises por PCR. Além disso, este procedimento pode ser usado para isolar medula óssea para cultivo primário de células da medula óssea, incluindo osteoclastos e osteoblastos (Figura 2A - B)4,6.
<img alt="Exames de tomografia óssea e imagem de histologia; análise estrutural e observação de detalhes celulares." src="/files/ftp_upload/53936/53936fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Análises Histomorfológica e Histológica de Osso Longo de Camundongo. Reconstrução tridimensional por microTC de uma tíbia de camundongo mostrando (A) a camada cortical externa e (B) o osso trabecular (barra de escala = 0,5 mm). (C) Coloração histológica com hematoxilina e eosina (H&amp;E) de uma tíbia descalcificada e seccionada (4x). Imagens cortesia de Katherine Weilbaecher, Escola de Medicina da Universidade de Washington, EUA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53936/53936fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Seção de histologia e análise de cultura celular, imagens de microscópio, morfologia tecidual, estudo de amostras." src="/files/ftp_upload/53936/53936fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2. Cultura Primária de Células da Medula Óssea para Diferenciação de Osteoclastos e Osteoblastos. (A) Coloração por TRAP para osteoclastos multinucleados após 7 dias em meio osteoclastogênico (4x). (B) Fosfatase alcalina (cor roxa) para osteoblastos e coloração com alizarina vermelha (cor vermelha) para mineralização após 21 dias em meio osteogênico. Imagens cortesia de Katherine Weilbaecher, Escola de Medicina da Universidade de Washington, EUA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53936/53936fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>

Aqui apresentamos um protocolo para a dissecção de ossos longos de membros posteriores (fêmures e tíbias) do camundongo de laboratório. Descrevemos ainda uma técnica rápida para isolamento da medula óssea desses ossos que utiliza centrifugação para remoção da medula óssea do espaço da medula óssea.

Murino Hind Limb Ossos Longos Dissecção e Medula Óssea O isolamento

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

O objetivo geral deste procedimento de dissecação de ossos longos e isolamento de medula óssea é remover rapidamente e de forma sistemática os ossos longos e coletar a medula óssea para análises downstream adicionais. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais relacionadas à biologia da medula óssea, metástase de câncer e imunologia. A principal vantagem desta técnica é que o processo de dissecação é rápido e padronizado, e o procedimento de isolamento da medula óssea é razoavelmente estéril. Comece posicionando o camundongo em posição supina.Em seguida, fixe todas as almofadas das patas abaixo da articulação do tornozelo e pulverize o camundongo com etanol a 70%, molhando bem as pernas. A seguir, faça uma pequena incisão à direita da linha média no abdômen inferior, logo acima do quadril, e prolongue a incisão ao longo da perna até além da articulação do tornozelo. Puxe para trás a pele.Em seguida, corte o músculo quadríceps fixado à extremidade proximal do fêmur para expor a face anterior do osso da coxa e fixe o músculo afastado da perna com o alfinete em um ângulo de 45 graus em relação à placa. Com a tesoura encostada na face posterior do fêmur, corte os músculos isquiotibiais afastando-os da articulação do joelho. Em seguida, puxe para trás a pele e os músculos isquiotibiais fixados à extremidade proximal do fêmur para expor a face posterior do osso e fixe os músculos isquiotibiais afastados da perna, colocando o alfinete em um ângulo de 45 graus.Com a pinça, segure a extremidade distal do fêmur logo acima da articulação do joelho. Em seguida, guie as lâminas da tesoura para ambos os lados do corpo do fêmur em direção à articulação do quadril. Após alcançar a cabeça do fêmur, gire a tesoura, movendo a lâmina superior diretamente sobre a cabeça do fêmur para luxar o fêmur.Agora segure a extremidade superior do corpo do fêmur com a pinça e corte o tecido mole ao redor da cabeça femoral para liberar o fêmur do acetábulo. Em seguida, puxe todo o osso da perna, incluindo fêmur, joelho e tíbia, para cima e para longe do corpo, e corte cuidadosamente o tecido conjuntivo e o músculo que fixam a perna à pele. Quando todo o tecido conjuntivo tiver sido removido, hiperestenda a articulação do tornozelo e gire a tesoura como demonstrado anteriormente para luxar a tíbia.Segurando a extremidade distal da tíbia e tomando cuidado para não cortar os tendões, puxe a tíbia para cima e para longe do corpo e da placa de fixação. Em seguida, remova qualquer tecido conjuntivo remanescente ligado ao osso longo no joelho, bem como qualquer músculo ou tecido conjuntivo adicional ligado ao fêmur e à tíbia. Para preparar o osso longo para o isolamento da medula, segure o fêmur com a patela voltada para longe e a cabeça femoral voltada para baixo.Estenda excessivamente a articulação do joelho e gire a tesoura para luxar a tíbia do fêmur. Em seguida, remova qualquer tecido conjuntivo que mantenha o fêmur e a tíbia unidos. Depois, segure o fêmur com o lado anterior voltado para longe e a cabeça femoral voltada para baixo, e conduza a tesoura ao longo do corpo femoral em direção aos côndilos.Gire suavemente as tesouras para frente e para trás para remover os côndilos, a patela e a epífise, expondo a metáfise. Em seguida, use a pinça, as tesouras e os Kimwipes para remover qualquer músculo ou tecido conjuntivo adicional aderido ao fêmur. Depois, segure a tíbia com o lado anterior voltado para longe e a extremidade do tornozelo voltada para baixo.Se a epífise tibial estiver intacta, conduza a tesoura ao longo do eixo da tíbia até os côndilos e gire suavemente a tesoura para frente e para trás para remover os côndilos e a epífise, expondo a metáfise tibial. Em seguida, remova qualquer músculo ou tecido conjuntivo adicional aderido à tíbia, conforme demonstrado anteriormente. Para coletar a medula óssea, primeiro empurre uma agulha de calibre 18 através da base de um tubo microcentrífugo de 0,5 mililitro.Em seguida, coloque os ossos longos no tubo, com a extremidade do joelho voltada para baixo, e feche a tampa. Encaixe o tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro dentro de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrifugue os tubos a uma força maior ou igual a 10.000 ×g em uma microcentrífuga por 15 segundos. Verifique, por inspeção visual, se a medula óssea foi expelida dos ossos.Os ossos devem aparecer brancos, e um pellet grande deve ser visível no tubo maior. Em seguida, descarte os ossos no tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro e suspenda a medula óssea na solução apropriada para a análise downstream desejada. Esta técnica rápida de dissecação é adequada para diversas análises downstream, incluindo histomorfometria e histologia.De fato, como demonstrado por esta reconstrução tridimensional representativa de micro-TC histomorfométrica, tanto o osso esponjoso quanto o invólucro cortical são mantidos, permitindo uma quantificação precisa dos parâmetros estruturais padronizados para a histomorfometria óssea. Nesta seção histológica representativa de uma tíbia corada com H e E, fixada em formalina e descalcificada, pode-se observar a manutenção da integridade tanto do osso calcificado quanto da medula óssea celular para análise histológica. Além disso, a medula óssea isolada por este procedimento é adequada para diversas aplicações subsequentes, incluindo o cultivo primário de células como osteoclastos ou osteoblastos.Uma vez dominada, a técnica pode ser concluída em cerca de sete minutos, desde a dissecação do osso longo até o isolamento da medula óssea, se for realizada corretamente. Ao tentar o procedimento, é importante lembrar-se de posicionar o camundongo para facilitar a dissecação. Após este procedimento, outros métodos, como FACS ou outros processos de célula única, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre alterações nas populações celulares da medula óssea.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como dissecar rapidamente os ossos longos de camundongos e isolar a medula óssea por centrifugação.

murine-hind-limb-long-bone-dissection-and-bone-marrow-isolation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Isolamento e Transplante de Células-Tronco Hematopoéticas (HSCs)

Este vídeo descreve um protocolo detalhado para isolar a medula óssea inteira fresca dos membros posteriores do camundongo para investigar defeitos de MO total para pacientes com doenças do sangue, como leucemia.

Colheita de medula óssea do membro posterior do camundongo

Este protocolo descreve um procedimento para amostragem seriada da medula óssea (MO) femoral sem exigir o sacrifício de camundongos. Este procedimento facilita estudos longitudinais da composição da MO de camundongos ao longo do tempo e fornece acesso serial às células dentro da MO para estudos ex vivo e de transplante.

Femoral Medula Óssea aspiração Live Ratos

Os osteoclastos são as células de reabsorção óssea principais no corpo. Uma capacidade de isolar os osteoclastos em grandes números resultou em avanços significativos na compreensão da biologia dos osteoclastos. Neste protocolo, nós descrevemos um método para o isolamento, cultivo e quantificar a actividade dos osteoclastos in vitro.

Osteoclastos Derivação do mouse Medula Óssea

Aqui apresentamos um protocolo que gera grandes quantidades de monócitos murinos a partir de medula óssea heterogênea para aplicações translacionais. Em comparação com outros, esse novo método ajuda a reduzir o número de animais sacrificados e reduz os custos, evitando métodos caros, como a separação de células magnéticas de alto gradiente (MACS).

Isolamento e injecção intravenosa de Murino de Medula Óssea Derivado monócitos

Células da medula óssea cultivadas com fator estimulador de colônias de macrófagos granulócitos (GM-CSF) geram uma cultura heterogênea contendo macrófagos e células dendríticas (DCs). Este método destaca o uso da ligação de MHCII e hialuronano (HA) para diferenciar macrófagos das DCs na cultura GM-CSF. Os macrófagos nesta cultura têm muitas semelhanças com os macrófagos alveolares.

Geração e identificação de GM-CSF macrófagos derivados e dendríticas células alveolares do tipo de ratinho de Medula Óssea

Neste artigo, apresentamos métodos para isolar e diferenciar as células do estroma da medula óssea e células-tronco hematopoiéticas de ossos longos de rato. Dois protocolos diferentes apresentam-se populações de células diferentes rendimento adequadas para a expansão e diferenciação em osteoblastos, osteoclastos e adipócitos.

Isolamento, cultura e diferenciação de células do estroma da medula óssea e osteoclasto progenitores dos ratos

Descrevemos três métodos de transplante de medula óssea (TMO): TMO com irradiação total do corpo, TMO com irradiação blindada e método de TMO sem pré-condicionamento (TMO adotivo) para o estudo da hematopoiese clonal em modelos de camundongos.

Procedimentos de transplante de medula óssea em camundongos para estudar hematopoiese clonal

Este método descreve a purificação por citometria de fluxo de MEP e MKp de fêmures, tíbias e ossos pélvicos.

Isolamento de Progenitores de Megacaiócitos de Rato

O sucesso da transcriptômica de célula única/núcleo único e multi-ômica depende em grande parte da qualidade das células/núcleos. Portanto, o isolamento de células/núcleos do tecido e sua purificação devem ser altamente padronizados. Este protocolo descreve a preparação de núcleos do cérebro e da medula óssea para o ensaio de multioma de núcleo único a jusante.

Preparação de Núcleos Cerebrais e de Medula Óssea de Alta Qualidade para Ensaios Multioma de Núcleos Únicos

Aqui, um método baseado em citometria de fosfofluxo é descrito para analisar a sinalização a jusante das vias mTORC1, JAK/STAT5 e MAPK em células de leucemia mielóide humana aguda xenoenxertadas em camundongos e obtidas de aspirados de medula óssea. Os níveis de p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 e p-ERK1/2 são medidos simultaneamente usando um citômetro de fluxo espectral de última geração com alta sensibilidade.

Citometria de fosfofluxo intracelular de xenotransplantes derivados de pacientes com leucemia mielóide aguda

Aprenda a dissecar ossos longos de membros posteriores de camundongos e isolar medula óssea por centrifugação em apenas sete minutos. Esta técnica padronizada preserva a integridade tecidual para análises histológicas e cultura celular.

Murino Hind Limb Ossos Longos Dissecção e Medula Óssea O isolamento

Explorar mais vídeos