Eficiente de Ácido Nucleico Extração e sequenciamento genético 16S rRNA para Bacteriana Comunidade Caracterização

O objetivo geral deste procedimento é isolar DNA e RNA de alta qualidade de swabs e, em seguida, determinar sua composição bacteriana usando o sequenciamento do gene 16S rRNA. Este método pode ajudar um pesquisador a identificar quais bactérias estão contidas em uma determinada amostra humana e determinar associações entre bactérias específicas e características do hospedeiro ou estado da doença. Embora esse método tenha sido projetado para fornecer informações sobre as comunidades bacterianas vaginais humanas, o método também pode ser aplicado para estudar comunidades bacterianas de outros locais do corpo, como narinas, boca, pele e reto e de outros organismos.

Observe que este vídeo destaca as partes mais complicadas do protocolo e não cobre a parte de sequenciamento ou a análise de sequenciamento. Brittany Bowman, uma técnica do meu laboratório, irá demonstrar. Comece este procedimento com swabs ectocervicais coletados e armazenados em gelo úmido, conforme descrito no documento anexo.

Em preparação para a extração de ácido nucleico, limpe todas as superfícies do exaustor e todos os itens trazidos para o exaustor com alvejante seguido de um descontaminante que remove RNases, DNases e DNA. No capô, coloque um tubo de contas por amostra. Para cada tubo, adicione 500 microlitros de tampão NaCl-Tris-EDTA, 210 microlitros de 20% SDS e 500 microlitros de álcool fenol clorofórmio isoamílico.

O manuseio cuidadoso dos swabs é fundamental para obter resultados claros com este protocolo. É preciso um pouco de prática para transferir o cotonete sem deixá-lo cair e é mais fácil se você usar um cotonete de haste oca como este. Usando uma pinça estéril, transfira o cotonete do frasco de transporte para o tubo de contas do cordão.

Esfregue bem a cabeça do cotonete contra as paredes internas do tubo por pelo menos 30 segundos. Coloque o tubo no gelo. Em seguida, troque as luvas e repita o procedimento de esfregaço com a próxima amostra.

Depois que todas as amostras tiverem sido esfregadas vigorosamente, deixe-as esfriar no gelo por pelo menos 10 minutos. Após 10 minutos para remover o cotonete, segure a alça com uma pinça estéril e, usando uma ponta P200 limpa, pressione a cabeça contra o interior da parede do tubo. Este processo libera o líquido do cotonete, aumentando a recuperação de ácidos nucleicos.

Coloque o tubo de beading de contas no beader e homogeneize a amostra por dois minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugue o tubo de contas a 6.000 gs e quatro graus Celsius por três minutos para pellet os detritos e separar as fases aquosa e fenol. Após a rotação, geralmente podem ser vistas três fases.

A camada superior é a fase aquosa, contendo o DNA e o RNA. A camada inferior é a fase orgânica, contendo lipídios e detritos das células e swabs. A fina camada intermediária branca, chamada de interfase, contém proteínas.

Transfira a fase aquosa, cerca de 500 a 600 microlitros, para um tubo estéril de 1,5 mililitro. Adicione um volume igual de álcool fenol, clorofórmio isoamílico. Misture por inversão e breve vórtice.

Centrifugue o tubo por cinco minutos. Após a centrifugação, transfira a fase aquosa para um novo tubo estéril de 1,5 mililitro. Tome cuidado para não transferir material da interfase ou da fase fenol subjacente.

Observe o volume transferido e guarde a fase fenol para futuro isolamento proteico. Em seguida, adicione 0,8 volume de isopropanol e 0,1 volume de acetato de sódio de três molares. Misture bem por inversão e vórtice brevemente.

Precipite o ácido nucléico resfriando o tubo a 20 graus Celsius por pelo menos duas horas e durante a noite. Após a precipitação, centrifugue o tubo por 30 minutos. Após a centrifugação, use cuidadosamente uma pipeta para remover o sobrenadante, deixando o pellet intacto.

Adicione 500 microlitros de etanol 100%. Desaloje o pellet com vórtice suave ou pipetagem sem tocar no pellet. Centrifugue por cinco minutos.

Usando uma pipeta P10, remova e descarte o máximo de etanol possível sem perturbar o pellet. Seque o pellet ao ar em temperatura ambiente por 15 minutos. Ressuspenda o pellet em 20 microlitros de tampão UltraPure 0.1X-Tris-EDTA.

Deixe a amostra esfriar no gelo por 10 minutos e pipete repetidamente para garantir a ressuspensão total. Meça a concentração de ácido nucleico usando um espectrofotômetro. Se desejar, separe o DNA do RNA usando um kit de limpeza de coluna seguindo o protocolo do fabricante.

A configuração da PCR é uma etapa crítica neste procedimento. É muito importante minimizar a contaminação, garantindo a esterilidade dos reagentes, do capuz de PCR e das luvas. Trabalhe rapidamente, mas com cuidado, e use a técnica adequada ao mover itens para dentro e para fora do capô.

Coloque um rack de resfriamento de bancada limpo para tubos de microcentrífuga e um resfriador de placa PCR no exaustor. Rotule os tubos de tira de 8 poços com tampas individuais e coloque-os no resfriador de PCR. A amplificação deve ser realizada em triplicata e um controle de água sem modelo deve ser incluído para cada par de primers.

Coloque um tubo de microcentrífuga no refrigerador para a mistura principal. Em seguida, para cada amostra, combine água UltraPure, tampão 5X HF, DNTPs, primer direto 515F e 3% DMSO conforme descrito no documento anexo. Em seguida, adicione a polimerase à mistura principal e misture por pipetagem.

Ao primeiro poço, adicione 90 microlitros da mistura master e dois microlitros do primer reverso, misture bem. Em seguida, para o quarto poço, que serve como controle sem modelo, adicione 23 microlitros do mestre e dois microlitros de água e misture. Em seguida, adicione seis microlitros da amostra apropriada ao primeiro poço.

Misture bem e transfira 25 microlitros para o segundo poço. Troque as pontas e transfira mais 25 microlitros do primeiro poço para o terceiro poço. Tampe firmemente todos os poços.

Tome cuidado para não tocar no interior dos poços ou na tampa. Em seguida, repita esse processo para cada amostra. Depois que todas as amostras estiverem preparadas, gire rapidamente os tubos de tira, transfira-os para um termociclador e execute o programa.

Após a conclusão da corrida, gire rapidamente os tubos para coletar o líquido das paredes. Em seguida, em uma bancada de laboratório limpa, combine as reações de PCR triplicada de cada amostra em um tubo de microcentrífuga estéril rotulado. Transfira 25 microlitros de cada controle sem modelo para um tubo estéril separado.

Não combine amplicons de amostras diferentes ainda. Para validar a amplificação de PCR bem-sucedida, carregue cinco microlitros de cada amostra em um gel de 1,5% de agarose e realize eletroforese a 120 volts por 30 a 60 minutos. Veja o gel sob luz ultravioleta.

Verifique a amplificação bem-sucedida de cada amostra observando uma única banda forte em torno de 380 pares de bases. Se houver uma banda dupla, re-amplifice a amostra com um código de barras reverso diferente. Se não houver nenhuma banda, re-amplifice a amostra usando o mesmo código de barras reverso ou um primer com um novo código de barras reverso.

Se a reamplificação não for bem-sucedida, os inibidores de PCR podem estar presentes na amostra, caso em que Armazene os 70 microlitros restantes de amplicon a 20 graus Celsius. Descarte os 20 microlitros restantes do controle sem modelo, supondo que ele não tenha produzido uma banda.

Para criar o pool de amplicon, combine de dois a cinco microlitros de cada amplicon em um único tubo estéril. Se a banda de uma amostra for fraca, adicione o dobro do volume em relação ao restante das amostras. Em seguida, remova os primers de PCR usando um kit.

Se aplicável, combine os pools de amplicon sem primer para criar a biblioteca final. Determine a concentração de DNA da biblioteca usando um espectrofotômetro ou um sistema fluorométrico. Por fim, diluir as amostras para dois nanomolares e enviá-las para sequenciamento.

Informações detalhadas sobre a análise de sequência são fornecidas no documento anexo. DNA e RNA de alta qualidade foram isolados e o DNA foi usado como modelo para amplificação por PCR da região V4 do gene 16S rRNA, conforme descrito neste vídeo. A eletroforese em gel foi usada para confirmar a presença de uma única banda em torno de 380 pares de bases em cada amostra que foi amplificada com molde.

Os controles no template executados em paralelo com o mesmo par de primers não tinham uma banda presente. Os amplicons de PCR foram então combinados em um único tubo, quantificados e posteriormente diluídos antes do sequenciamento. Aqui é mostrado um gráfico de barras representativo das pontuações de qualidade da sequência em cada posição da leitura.

É normal que a qualidade da sequência caia após 200 pares de bases. Mas o índice de qualidade médio deve permanecer acima de 30. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar DNA e RNA de swabs usando uma extração à base de clorofórmio de fenol, amplificar a região V4 do gene de RNA ribossômico 16SR e preparar uma biblioteca para sequenciamento de alto rendimento.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante tomar muito cuidado para evitar contaminação durante a coleta de amostras, extração de ácido nucleico e amplificação por PCR. Não se esqueça de que trabalhar com fenol clorofórmio pode ser extremamente perigoso e precauções como trabalhar com capuz ventilado e usar luvas impermeáveis, óculos de segurança com proteção lateral e jaleco devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.