Name: Procedimento para avaliar a eficiência de floculantes para a Remoção de partículas dispersas de extractos de plantas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Aprenda a avaliar floculantes para remoção de partículas em extratos vegetais usando design de experimentos. Este método otimiza a clarificação, reduzindo custos e aumentando a capacidade de filtração.

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Gostaria de agradecer ao Dr. Thomas Rademacher por fornecer as sementes de tabaco transgênicas e Ibrahim Al Amedi por cultivar as plantas de tabaco. Gostaria de agradecer ao Dr. Richard M Twyman pela assistência editorial e ao Prof. Dr. Rainer Fischer pelas discussões frutíferas. Este trabalho foi financiado em parte pela Bolsa Avançada do Conselho Europeu de Pesquisa ''Future-Pharma'', proposta número 269110, pela Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fundação Fraunhofer Future) e pelos Programas Internos da Fraunhofer-Gesellschaft sob a Concessão nº. Atraia 125-600164.

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O autor não tem conflitos de interesse para divulgar.

O aspecto mais importante a considerar ao configurar um DoE para caracterizar a floculação de partículas é que o projeto deve, em princípio, ser capaz de detectar e descrever os efeitos esperados ou possíveis 36,38, por exemplo, a influência do pH, tipo de polímero e concentração de polímero 16. Portanto, é importante para avaliar a fracção do espaço de concepção (FDS) antes de iniciar as experiências reais. O FDS é a fracção do espaço experimental multidimensional (coberto pelos factores ...

As plantas são amplamente utilizados para produzir produtos alimentares, tais como sucos de frutas, mas eles também podem ser desenvolvidos como plataformas para a fabricação de maior valor produtos biofarmacêuticos 1-3. Em ambos os casos, o processamento a jusante (DSP) geralmente começa com a extracção de líquidos a partir de tecidos, tais como folhas ou frutos, seguida pela clarificação dos extractos de partículas carregadas de 4,5. Para a fabricação de produtos biofarmacêuticos, os custos de DSP podem ser responsáveis ​​por até 80% dos custos globais de produção 6,7 e isso em parte reflete a alta de partículas carga presente em extratos preparados por métodos perturbadores, como a homogeneização baseada em lâmina 8,9 . Embora a selecção racional de camadas de filtro para igualar a distribuição de tamanho de partícula no extracto pode aumentar a capacidade do filtro e reduzir os custos de 10,11, a melhoria nunca poderá exceder o limite máximo da capacidade absoluta definida pelo número de partículas que deve ser retida porunidade de área de filtro para obter esclarecimentos. O limite pode ser levantada, se menos partículas alcançam a superfície dos filtros mais finos no trem de filtração, e isto pode ser conseguido se partículas dispersas são misturados com polímeros conhecidos como floculantes que promovem agregação para formar flocos grandes 12. Tais flocos pode ser retido mais a montante pelos filtros grossos e menos caros saco, reduzindo a carga de partículas de alcançar o mais finos e filtros de profundidade mais caros. Os polímeros devem ter perfis de segurança adequadas para as suas aplicações, por exemplo, para biofármacos eles devem estar em conformidade com as boas práticas de fabricação (BPF), e, normalmente, eles devem ter uma massa molar&gt; 100 kDa e pode ser neutro ou carregado 13. Considerando floculantes neutros actuam geralmente através de ligação cruzada partículas dispersas causando a sua agregação e a formação de flocos com diâmetros&gt; 1mm 11, polímeros carregados neutralizar a carga de dispersed partículas, reduzindo a sua solubilidade e assim causando a precipitação 14. A f loculação pode ser melhorado ajustando os parâmetros tais como pH ou a condutividade, e o tipo de polímero ou concentração, para combinar as propriedades do extracto 15,16. Para extractos de tabaco pré-tratados com 0,5-5,0 g L-1 de polietilenimina (PEI), um aumento superior a duas vezes na capacidade do filtro de profundidade foi relatado num processo à escala piloto 100-G. O custo deste polímero é inferior a € 10 kg -1 pelo que a sua introdução no processo resultou em economia de custos de cerca de € 6.000 para filtros e consumíveis por lote de 16 ou ainda mais quando combinado com ajudas filtração de base celulósica 17. Mesmo assim, modelos preditivos são necessários para avaliar os benefícios económicos a priori de floculantes porque a sua inclusão pode exigir etapas de espera de 15-30 min 16,18, resultando em mais custos de investimento para o armazenamentotanques. No entanto, não existem actualmente modelos mecanicistas disponíveis que podem prever o resultado de tais experiências, devido à natureza complexa de floculação. Portanto, uma abordagem de concepção de experiências-mais adequadas (DOE) 19 foi desenvolvido como descrito neste artigo. Um protocolo para o procedimento geral DoE foi recentemente publicada 20. Dispositivos de pequena escala estão agora disponíveis para o rastreio de alto rendimento de condições de floculação 21. No entanto, estes dispositivos podem não realista simular as condições durante a floculação de extractos de plantas, porque as dimensões do vaso de reacção (~ 7 mm para os poços de uma placa de 96 poços) e as partículas ou flocos pode ser menor do que uma ordem de magnitude de intervalo. Isso pode afetar misturar padrões e, portanto, o poder preditivo do modelo. Além disso, pode ser difícil de reduzir os processos que envolvem precipitação devido às mudanças não lineares no comportamento de mistura e STA precipitadodade 22. Portanto, este artigo descreve um sistema de triagem-top-escala de bancada com um rendimento de 50-75 amostras por dia, produzindo resultados que são escaláveis ​​do volume de reacção de 20 ml inicial para um processo em escala piloto 100 L 16. Quando combinado com uma abordagem DoE, isso permite que os modelos de previsão a ser usado para otimização de processos e documentação como parte de um conceito de qualidade-by-design. O método descrito abaixo também pode ser adaptado para biofármacos produzidos em processos baseados em cultura de células, onde floculantes também estão sendo considerados como uma ferramenta de redução de custos 23. Ele também pode ser usado para modelar a precipitação de proteínas-alvo a partir de um extracto bruto, como parte de uma estratégia de purificação, como foi demonstrado para β-glucuronidase produzidas em canola, milho e soja 24,25. Uma descrição detalhada das propriedades floculantes podem ser encontrados em outros lugares 16,26 e é importante para assegurar que o polímero concentrções são ou não-tóxico ou abaixo dos níveis prejudiciais no produto final 11.

<table><tbody><tr><td>2100P Turbidimeter</td><td>portátil Hach</td><td>4650000</td><td>Turbidímetro</td></tr><tr><td>2G12 anticorpo</td><td>Polymun</td><td>AB002</td><td>Anticorpo de referência</td></tr><tr><td>Biacore T200</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9750-01</td><td>Dispositivo SPR</td></tr><tr><td>BP-410</td><td>Furh</td><td>2632410001</td><td>Filtro de saco</td></tr><tr><td>Catiofast VSH</td><td>BASF 79002360</td><td></td><td>Agente</td></tr> <tr><td>floculanteCentrífuga 5415D</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td>Centrífuga</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga 15 ml</td><td>Labomedic</td><td>2017106</td><td>Tubo de reação</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga 50 ml autônomo</td><td>Labomedic</td><td>1110504</td><td>Tubo de reação</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>5375.1</td><td>Agente floculante</td></tr><tr><td>Design-Expert(R) 8</td><td>Stat-Ease, Inc.</td><td>n.a.DoE</td> <td>software</td></tr><tr><td>Fosfato dissódico</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>&nbsp; 4984.3&nbsp;</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>Ferty 2 Mega</td><td>Kammlott</td><td>5.220072</td><td>Fertilizante</td></tr><tr><td>Forma -86C ULT freezer</td><td>ThermoFisher</td><td>88400</td><td>Freezer</td></tr><tr><td>Greenhouse</td><td>n.a.n.a.Para</td><td></td> <td>cultivo de plantas</td></tr><tr><td>Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm</td><td>Grodan</td><td>102446</td><td>Rockwool block</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9105.3</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>K700P 60D</td><td>Pall</td><td>5302305</td><td>Camada de filtro de profundidade</td></tr><tr><td>KS50P 60D</td><td>Pall</td><td>B12486</td><td>Camada de filtro de profundidade</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Labomedic</td><td>475855-1R</td><td>Pano de filtro</td></tr><tr><td>MultiLine Multi 3410 IDS</td><td>WTW</td><td>WTW_2020</td><td>medidor de pH / medidor de condutividade</td></tr><tr><td>Osram cool white 36 W</td><td>Osram</td><td>4930440</td><td>Fonte de luz</td></tr><tr><td>Phytotron</td><td>Ilka Zell</td><td>n.a.Para</td> <td>cultivo de plantas</td></tr><tr><td>Polymin P</td><td>BASF</td><td>79002360</td><td>Agente floculante</td></tr><tr><td>POLYTRON PT 6100 D</td><td>Kinematica</td><td>11010110</td><td>Dispositivo de homogeneização com ferramenta de lâmina personalizada</td></tr><tr><td>Proteína A</td><td>Life technologies</td><td>10-1006</td><td>Proteína de ligação ao anticorpo</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>Sinergia HT</td><td>BioTek</td><td>SIAFRT</td><td>Leitor de placas de fluorescência</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4855.3</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9127.3</td><td>Componente de mídia</td></tr><tr><td>VelaPad 60</td><td>Pall</td><td>VP60G03KNH4</td><td>Caixa de filtro</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td>ZEN3600</td><td>Medição de distribuição de tamanho de partícula DLS</td></tr></tbody></table>

procedimento para avaliar a eficiência de floculantes para a remoção de partículas dispersas de extractos de plantas

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

As plantas são importantes para os seres humanos não apenas porque fornecem commodities como alimentos, rações e matérias-primas, mas cada vez mais porque podem ser usadas como plataformas de fabricação para produtos de valor agregado, como biofarmacêuticos. Em ambos os casos, os extratos líquidos de plantas podem precisar ser clarificados para remover partículas. A clarificação ideal reduz os custos de filtração e centrifugação, aumentando a capacidade e a longevidade. Isso pode ser alcançado com a introdução de polímeros carregados conhecidos como floculantes, que reticulam partículas dispersas para facilitar a separação sólido-líquido. Não existem modelos de floculação mecanicistas para misturas complexas, como extratos de plantas, portanto, modelos empíricos são usados. Aqui é descrito um procedimento de planejamento de experimentos que permite a triagem rápida de diferentes floculantes, otimizando a clarificação de extratos vegetais e reduzindo significativamente a turbidez. Os modelos preditivos resultantes permitem a identificação de condições de processo robustas e conjuntos de polímeros com propriedades complementares, por exemplo, floculação eficaz em extratos com condutividades específicas. Os resultados apresentados para extratos de folhas de tabaco podem ser facilmente adaptados a outras espécies ou tecidos vegetais e, assim, facilitarão o desenvolvimento de processos a jusante mais econômicos para commodities e produtos farmacêuticos derivados de plantas.

A floculação do extracto de tabaco com diferentes polímeros O método descrito acima foi utilizado com sucesso para desenvolver um processo para a floculação de extractos de tabaco durante o fabrico de um anticorpo monoclonal (o anticorpo de HIV-neutralizante 2G12) e uma proteína fluorescente (DsRed) (Figura 1) 16, e uma vez que tenha sido transferida a outras proteínas incluindo lectinas, candidatos...

O procedimento de planejamento de experimentos apresentado aqui permite a avaliação de diferentes floculantes em termos de sua capacidade de agregar partículas dispersas em extratos vegetais, reduzindo assim a turbidez e os custos de processamento a jusante.

Procedimento para avaliar a eficiência de floculantes para a Remoção de partículas dispersas de extractos de plantas

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar floculantes que possam melhorar a remoção de partículas dispersas de extratos vegetais. Isso é alcançado mediante a elaboração de um delineamento experimental para identificar os polímeros mais eficazes e os parâmetros que controlam a agregação dessas partículas dispersas. O segundo passo define o fluxo de trabalho, que corresponde às operações unitárias utilizadas em uma aplicação em larga escala.Em seguida, extratos de folhas são preparados como floculantes sob diversas condições e analisados para medir a turbidez e a recuperação do produto. Os resultados mostram as condições ótimas de floculação e os polímeros com base na avaliação de um modelo de planejamento de experimentos, que abreviamos como DoE. A principal vantagem desta técnica em comparação com a clarificação tradicional usando somente filtração em profundidade é que a capacidade do filtro pode ser aumentada várias vezes, reduzindo os custos totais do processo.A floculação pode aumentar o diâmetro efetivo das partículas e facilitar sua remoção por centrifugação ou filtração. Portanto, os parâmetros do processo ambiental relevantes para o procedimento de floculação devem ser identificados primeiro. Normalmente, existem vários desses parâmetros.Portanto, uma abordagem de DoE é apropriada dada a falta de modelos mecanicistas. O DoE é configurado selecionando parâmetros com base em dados da literatura e conhecimento prévio. Parâmetros típicos incluem tempo de incubação, bem como tipo e concentração de polímero.Os resultados experimentais utilizados para avaliar a eficiência da floculação, como a filtrabilidade, também são definidos antes do experimento. Essas informações são então inseridas em um planejamento experimental (DoE) apropriado ao número de fatores a serem investigados e ao grau de conhecimento já acumulado sobre o sistema. Um fluxo de trabalho é desenvolvido para abranger todas as etapas relevantes para a floculação e o processamento em escala laboratorial de extratos vegetais.O volume da alíquota deve ser pequeno o suficiente para permitir alto rendimento na amostragem. O desempenho dos equipamentos de laboratório deve se correlacionar com o dos dispositivos em escala de processo. As plantas são cultivadas de maneira que represente o processo final.E todas as utilidades são preparadas antes de iniciar os experimentos de extração e floculação. As soluções estoque de floculantes são preparadas cuidadosamente, levando em consideração qualquer pré-diluição feita pelo fabricante. Escolher a mesma concentração estoque para todos os floculantes simplifica as etapas subsequentes de pipetagem, reduzindo a probabilidade de erros.Os componentes do tampão, pH e condutividade de cada solução estoque fresca de floculante são preparados para corresponder às condições dos extratos. O planejamento experimental (DoE) é convertido em um esquema de pipetagem que especifica os volumes das soluções estoque a serem adicionados às amostras de extrato vegetal. As amostras de extrato vegetal são preparadas a partir de folhas de tabaco colhidas, utilizando tampões que correspondem às condições a serem testadas no DoE.Enquanto se agita o extrato, são preparadas alíquotas com volume pré-definido. Isso garantirá distribuição homogênea das partículas em todas as amostras. Tampão de extração é adicionado a cada alíquota de modo que todas as amostras tenham o mesmo volume após a adição do estoque de floculante.O volume da solução estoque definido no DoE é adicionado à amostra sequencialmente, conforme indicado pela ordem aleatória de execução. O polímero é distribuído homogeneamente por toda a amostra agitando-se o tubo imediatamente após a adição do polímero, o que também garantirá a reprodutibilidade dos resultados de floculação. O método pode ser facilmente modificado para testar combinações de floculantes ou a adição repetida do mesmo floculante.Mas isso deve ser implementado no planejamento de experimentos (DoE). A formação de flocos geralmente requer um tempo de incubação de três a 30 minutos. É necessário seguir os tempos de incubation definidos no DoE para obter resultados reprodutíveis.A velocidade de sedimentação dos flocos ou a turbidez dos filtrados e as capacidades dos filtros podem ser utilizadas para avaliar o desempenho do floculante. Também é importante confirmar que os polímeros não interferem em produtos como proteínas. Uma vez confirmada a qualidade dos dados, as informações podem ser transferidas para o software de planejamento de experimentos (DoE).Os dados experimentais são analisados utilizando as ferramentas integradas ao software de DoE, incluindo transformação de dados, seleção de fatores e ferramentas de controle de qualidade. Além de usar essas ferramentas, o modelo final também deve estar de acordo com as leis básicas da física e da termodinâmica. Uma vez confirmada a qualidade do modelo, ele pode ser usado para prever as condições ótimas para a floculação.Com base nas previsões do modelo, o espaço de projeto pode ser reduzido à região mais relevante, para a qual um novo planejamento de experimentos (DoE) pode ser estabelecido, repetindo o procedimento descrito anteriormente. Os resultados podem então ser confirmados em escala piloto ou de produção. Neste estudo representativo, o desempenho de 23 floculantes sintéticos diferentes e quatro naturais foi testado quanto à sua capacidade de flocular extratos de folhas de tabaco utilizando uma abordagem de DoE.Levando em consideração parâmetros específicos do polímero, como concentração e tipo de polímero, bem como parâmetros do processo, como tempo de incubação, temperatura, pH e condutividade do tampão. Com a sequência de quatro delineamentos IV-ótimos aninhados, incluindo um total de cerca de 200 alíquotas de 20 mL de extrato, descobrimos que o Polymin P foi o floculante mais eficaz para extratos de tabaco na faixa de pH de quatro a oito, desde que a temperatura estivesse entre quatro e 30 graus Celsius. Um tempo de incubação de 15 minutos foi suficiente para a floculação, mas a eficácia diminuiu em condutividades superiores a 40 mS por cm.No entanto, a abordagem de DoE mostrou que o Catiofast VSH era complementar ao Polymin P, alcançando uma floculação eficaz em condutividades superiores a 40 mS por cm. Quando esses floculantes foram introduzidos no processamento a jusante de extratos de tabaco, a capacidade dos filtros de profundidade utilizados aumentou de 3,2 a 5,7 vezes, reduzindo proporcionalmente o custo dos produtos nesta etapa. Confirmamos que os floculantes não reduziram a recuperação de proteínas-alvo, incluindo um anticorpo monoclonal, uma proteína fluorescente, uma lectina e diferentes candidatos a vacinas.As condições ideais de floculação também foram confirmadas em uma batelada em escala piloto de 100 L. Os resultados do delineamento experimental (DoE) também foram transferidos com sucesso para extratos de tabaco preparados com prensa helicoidal, em vez de homogeneizador baseado em lâminas, destacando a ampla aplicabilidade das informações obtidas. Também adaptamos o método para testar combinações de floculantes, que apresentaram eficácia semelhante.Após assistir a este vídeo, você deverá compreender como montar experimentos de floculação para extratos vegetais utilizando uma abordagem de DoE.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Um Procedimento volume pequeno para Concentração Viral da Água

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