Imobilização de Multi-biocatalisadores em alginato Beads para Cofator Regeneração e melhorada Reutilização

O objetivo geral deste procedimento experimental é demonstrar o uso de um sistema biocatalítico acoplado de células inteiras imobilizadas em microesferas de alginato para melhorar o rendimento da produção e a reutilização. Este é o meu tema de pesquisa, no qual respondi questões fundamentais na área de biocatálise, como imobilização de biocatalisadores, estabilidade, regeneração de cofatores e biocatalisadores de células inteiras. A principal vantagem desta técnica é que ela oferece uma abordagem simples, porém flexível, para a produção aprimorada de muitas biomoléculas importantes por meio de vias dependentes de cofatores.

São utilizadas duas linhagens recombinantes de E. coli neste protocolo. A linhagem SpNOx E. coli, que expressa NADH oxidase, e a linhagem HjLAD E. coli, que expressa L-arabinitol desidrogenase. Como este procedimento é o mesmo para ambas as linhagens de E. coli, ele será demonstrado apenas para a linhagem HjLAD E. coli.

Inocule uma única colônia de E. coli HjLAD em três mililitros de meio LB, suplementado com 15 microgramas por mililitro de Quetós-Â-Mi-Cina, e incube durante a noite em um agitador incubador. No dia seguinte, dilua o cultivo na proporção de um para 100 em 200 mililitros de meio LB fresco contendo 15 microgramas por mililitro de Quetós-Â-Mi-Cina, e incube a 37 graus Celsius a 250 RPM até que a DO 600 atinja cerca de 0,6. Induza a expressão da proteína HjLAD adicionando 0,1 milimolar de IPTG ao meio de cultivo, e continue a incubação a 25 graus Celsius, 200 RPM, por seis horas.

Recolha as células induzidas por centrifugação a 3200 vezes G e quatro graus Celsius por 20 minutos. Descarte o sobrenadante e prossiga com o processamento do pellet celular conforme demonstrado no próximo segmento. Para iniciar este procedimento, suspendemos os pellets celulares de HjLAD E coli e SpNox E coli separadamente em tampão Tris-HCl 50 milimolar, com uma densidade celular de cinco gramas de peso seco celular por litro.

Em um tubo redondo de 14 mililitros, misture 600 microlitros de E. coli HjLAD a cinco gramas de peso seco de células por litro, 600 microlitros de E. coli SpNOx a cinco gramas de peso seco de células por litro, 100 microlitros de NAD⁺ 20 milimolar e 150 microlitros de L-arabinitol 2 molar. Ajuste o volume da reação a dois mililitros adicionando 550 microlitros de Tris-HCl 50 milimolar. Incube a mistura de reação a 30 graus Celsius e 200 RPM por oito horas.

Após oito horas, centrifugue a mistura a 3200 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos e colete o sobrenadante da reação. Para quantificar a produção de L-xilulose por meio de um ensaio colorimétrico, aspire 100 microlitros do sobrenadante coletado para um tubo de 1,5 mililitro. Adicione 50 microlitros de 1,5% de cisteína, 900 microlitros de ácido sulfúrico 70% e 50 microlitros de 0,1% de Kar-Piz-All dissolvido em etanol, e misture suavemente invertendo o tubo três vezes.

Incube a mistura de reação a 37 graus Celsius e 200 rpm por 20 minutos. Meça a absorbância óptica da mistura de reação a 560 nanômetros utilizando um espectrofotômetro. Inicie o protocolo de imobilização preparando uma solução de alginato 4%.

Adicione 0,8 gramas de alginato de sódio a 20 mililitros de água destilada e aqueça a mistura para dissolver o alginato de sódio. Adicione 600 microlitros de E. coli HjLAD com cinco gramas de peso seco de células por litro e 600 microlitros de E. coli SpNOx com cinco gramas de peso seco de células por litro a 1,2 mililitros da solução de alginato 4%. Misture as células e o alginato por pipetagem suave para evitar a formação de bolhas.

Para garantir a formação de esferas de alginato com tamanho, morfologia e rigidez uniformes, é essencial adicionar a suspensão de células em alginato a uma distância ideal, de forma lenta e gota a gota, em um volume suficiente de solução de cloreto de cálcio para cobrir todas as esferas. Aspire a suspensão de células em alginato em uma seringa usando uma agulha e, em seguida, adicione a mistura gota a gota em uma solução de cloreto de cálcio 0,3 molar em um béquer de 100 mililitros com agitação contínua. Deixe as esferas na solução de cloreto de cálcio por duas a três horas à temperatura ambiente, sem agitação, para permitir que ocorra a reticulação.

Decante a solução de cloreto de cálcio sem perturbar as esferas, despejando cuidadosamente a solução de cloreto de cálcio em um tubo cônico de 15 mililitros. Transfira as esferas remanescentes para outro tubo cônico de 50 mililitros. Para remover o excesso de cloreto de cálcio e as células não encapsuladas, lave as esferas com tampão Tris-HCl 50 milimolar.

Adicione 10 mililitros de tampão às esferas e deixe a suspensão repousar, sem perturbação, por três a cinco minutos. Após as esferas sedimentarem no fundo, decante o tampão para outro recipiente. Dessa forma, lave as esferas três vezes.

Não centrifugue as microesferas em nenhuma etapa, pois elas se romperão. Não descarte o tampão de lavagem Tris-HCl usado. Recolha os 30 mililitros do tampão de lavagem usado com a solução de cloreto de cálcio usada coletada anteriormente.

Pelicularize as células de E. coli não imobilizadas por centrifugação da solução de cloreto de cálcio e Tris-HCl recuperada a 3200 × g durante 20 minutos. Transferir as esferas lavadas para um tubo. Posteriormente, avaliar a biossíntese de L-xilulose seguindo o procedimento demonstrado para os pellets celulares, mas utilizando todas as esferas lavadas no lugar dos pellets celulares.

Para avaliar a estabilidade dos biocatalisadores imobilizados para a produção de L-xilulose, colete as pérolas após a sua formação. E lave-as duas vezes com 10 mililitros de tampão Tris-HCl 50 milimolar sem centrifugação, conforme mostrado anteriormente. Utilize todas as pérolas lavadas para realizar a reação de produção de L-xilulose, conforme demonstrado anteriormente.

Quantifique a produção de L-xilulose por meio de um ensaio colorimétrico, como demonstrado anteriormente. Repita a reação de produção de L-xilulose pelo número desejado de ciclos de produção e meça a quantidade de L-xilulose produzida no sobrenadante da reação em cada ciclo. A produção de L-xilulose é potencializada por este sistema biocatalítico acoplado de células inteiras.

Partindo de uma concentração inicial de 150 milimolares de L-arabinitol, o uso do biocatalisador HjLAD E coli isoladamente produziu um rendimento de 79% de L-xilulose. Em comparação, o uso das células HjLAD E coli e SpNOx E coli em uma proporção de um para um produziu um rendimento de 96% de L-xilulose. Uma avaliação dos parâmetros que influenciam a eficiência da imobilização do biocatalisador revelou que a eficiência aumenta com o aumento da concentração de alginato de sódio na faixa de um a três por cento.

No entanto, concentrações de alginato de sódio superiores a 2% resultam em redução no rendimento de L-xilulose. Utilizando uma concentração de alginato de sódio de 2%, a concentração ideal de cloreto de cálcio para imobilização e rendimento de L-xilulose foi determinada como 0,3 molar. A reutilização do biocatalisador foi avaliada.

Neste gráfico, a produção de L-xilulose em sete ciclos sucessivos de reutilização de biocatalisadores celulares acoplados imobilizados e livres é mostrada, respectivamente, em cinza escuro e cinza claro. Embora o rendimento máximo de L-xilulose por biocatalisadores celulares acoplados imobilizados seja menor do que o de um sistema celular acoplado livre, a reutilização é aprimorada pela imobilização. Ao final de sete ciclos de reutilização sucessiva, os biocatalisadores imobilizados mantiveram sua estabilidade e preservaram 65% do rendimento original de L-xilulose.

Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biocatálise explorarem os rendimentos de biocatalisadores completos de múltiplas células e as principais reações que envolvem cofatores.