Imobilização de Multi-biocatalisadores em alginato Beads para Cofator Regeneração e melhorada Reutilização

O objetivo geral deste procedimento experimental é demonstrar o uso de um sistema biocatalítico de célula inteira acoplado imobilizado em grânulos de alginato para melhorar o rendimento da produção e a reutilização. Este é o meu assunto, respondi a perguntas-chave no campo da biocatálise, como imobilização de biocatalisadores, estabilidade, regeneração de cofatores e biocatalisadores de células inteiras. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma abordagem simples, mas flexível, para melhorar a produção de muitas biomoléculas importantes por vias dependentes de cofatores.

Duas cepas de E coli recombinantes são usadas neste protocolo. SpNOx E coli, que expressa NADH oxidase, e HjLAD E coli, que expressa L-arabinitol desidrogenase. Como esse procedimento é o mesmo para ambas as cepas de E coli, ele só será demonstrado para HjLAD E coli.

Inocular uma única colônia de HjLAD E coli em três mililitros de meio LB, suplementado com 15 microgramas por mililitro de Ket-A-My-Sin, e incubar durante a noite em uma incubadora agitadora. No dia seguinte, diluir a cultura em um a 100 em 200 mililitros de LB fresco contendo 15 microgramas por mililitro de Ket-A-My-Sin e incubar a 37 graus Celsius a 250 RPM até que o OD 600 atinja cerca de 0,6. Induza a expressão da proteína HjLAD adicionando IPTG 0,1 milimolar ao meio de cultura e incubando a 25 graus Celsius, 200 RPM, por seis horas.

Colha as células induzidas por centrifugação a 3200 vezes G e quatro graus Celsius por 20 minutos. Descarte o sobrenadante e prossiga com o processamento do pellet celular conforme demonstrado no próximo segmento. Para iniciar este procedimento, suspendemos os grânulos celulares de HjLAD E coli e SpNox E coli separadamente em 50 milimolares de tampão Tris-Hcl, a uma densidade celular de cinco gramas de peso de célula seca por litro.

Em um tubo inferior redondo de 14 mililitros, misture 600 microlitros de cinco gramas de peso de célula seca por litro de HjLAD E coli, 600 microlitros de cinco gramas de peso de célula seca por litro de SpNOx E coli, 100 microlitros de 20 milimolares NAD plus e 150 microlitros de L-aribinitol de dois molares. Traga o volume de reação para dois mililitros adicionando 550 microlitros de Tris-HCl 50 milimolares. Incubar a mistura de reação a 30 graus Celsius e 200 RPM por oito horas.

Após oito horas, centrifugue a mistura a 3200 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos e colete o sobrenadante da reação. Para quantificar a produção de L-xilulose por um ensaio colorimétrico, aspire 100 microlitros do sobrenadante coletado em um tubo de 1,5 militro. Adicione 50 microlitros de 1,5% de cisteína, 900 microlitros de ácido sulfúrico a 70% e 50 microlitros de 0,1% de Kar-Piz-All dissolvido em etanol e misture delicadamente invertendo o tubo três vezes.

Incube a mistura de reação a 37 graus Celsius e 200 RPM por 20 minutos. Meça a absorbância óptica da mistura de reação em 560 nanômetros usando um espectrofotômetro. Comece o protocolo de imobilização preparando uma solução de alginato a 4%.

Adicione 0,8 gramas de alginato de sódio a 20 mililitros de água destilada e aqueça a mistura para dissolver o alginato de sódio. Adicione 600 microlitros de cinco gramas de peso de célula seca por litro de HjLAD E coli e 600 microlitros de cinco gramas de peso de célula seca por litro de SpNOx E coli a 1,2 mililitros da solução de alginato a 4%. Misture as células e o alginato por pipetagem suave para evitar a formação de bolhas.

Para garantir a formação de grânulos de alginato com tamanho, morfologia e rigidez uniformes, é fundamental adicionar a suspensão de alginato celular por uma distância ideal de maneira lenta e gota, em um volume suficiente de solução de cloreto de cálcio para cobrir todos os grânulos. Aspirar a suspensão de células de alginato para uma seringa com uma agulha e, em seguida, adicionar a mistura gota a gota numa solução de cloreto de cálcio 0,3 molar num copo de 100 ml, agitando continuamente. Deixe as esferas na solução de cloreto de cálcio por duas a três horas em temperatura ambiente sem mexer para permitir a reticulação.

Transvase a solução de cloreto de cálcio sem perturbar as esferas, despejando cuidadosamente a solução de cloreto de cálcio em um tubo cônico de 15 mililitros. Transfira as contas restantes para outro tubo cônico de 50 mililitros. Para remover o excesso de cloreto de cálcio e células não encapsuladas, lave as esferas com tampão Tris-HCl 50 milimolar.

Adicione 10 mililitros de tampão aos grânulos e deixe a suspensão repousar sem ser perturbada por três a cinco minutos. Assim que as contas se assentarem no fundo, transvase o tampão para outro recipiente. Desta forma, lave as contas três vezes.

Não centrifugue os grânulos em nenhuma etapa ou eles se romperão. Não descarte o tampão de lavagem Tris-HCl usado. Puxe os 30 mililitros de tampão de lavagem usado com a solução de cloreto de cálcio usada coletada anteriormente.

Pulverizar as células de E coli não imobilizadas por centrifugação da solução de cloreto de cálcio e Tris-HCl a 3200 vezes G durante 20 minutos. Transfira as contas lavadas para um tubo. Posteriormente, avalie a biossíntese de L-xilulose seguindo o procedimento demonstrado para os pellets celulares, mas usando todos os grânulos lavados no lugar dos pellets celulares.

Para avaliar a estabilidade dos biocatalisadores imobilizados para a produção de L-xilulose, colete as esferas depois de formadas. E lave duas vezes com 10 mililitros de tampão Tris-HCl 50 milimolar sem centrifugação, como mostrado anteriormente. Use todos os grânulos lavados para realizar a reação para a produção de L-xilulose, conforme demonstrado anteriormente.

Quantificar a produção de L-xilulose por um ensaio colorimétrico, também como demonstrado anteriormente. Repita a reação de produção de L-xilulose pelo número desejado de ciclos de produção e meça a quantidade de L-xilulose produzida no sobrenadante da reação em cada ciclo. A produção de L-xilulose é aumentada por este sistema biocatalítico de célula inteira acoplado.

Começando com uma concentração inicial de 150 milimolares de L-aribinitol, o uso do biocatalisador HjLAD E coli sozinho produziu um rendimento de 79% de L-xilulose. Em comparação, o uso das células HjLAD E coli e SpNOx E coli na proporção de um para um produziu um rendimento de 96% L-xilulose. Uma avaliação dos parâmetros que influenciam a eficiência da imobilização do biocatalisador revelou que a eficiência aumenta com o aumento da concentração de alginato de sódio na faixa de um a três por cento.

No entanto, concentrações de alginato de sódio superiores a 2% resultam em diminuição do rendimento de L-xilulose. Usando uma concentração de alginato de sódio de 2%, a concentração ideal de cloreto de cálcio para imobilização e rendimento de L-xilulose foi determinada em 0,3 molar. A reutilização do biocatalisador foi avaliada.

Neste gráfico, a produção de L-xilulose para sete ciclos sucessivos de reutilização de biocatalisadores de células inteiras imobilizados e acoplados livres é mostrada em cinza escuro e claro, respectivamente. Embora o rendimento máximo de L-xilulose por biocatalisadores de células inteiras acoplados imobilizados seja menor do que por um sistema de células inteiras acopladas livres, a reutilização é melhorada pela imobilização. Ao final de sete ciclos de reutilização sucessiva, os biocatalisadores imobilizados mantiveram sua estabilidade e retiveram 65% do rendimento original de L-xilulose.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biocatálise explorarem os rendimentos de biocatalisadores multicelulares completos e as principais reações que envolvem cofatores.