Avaliando Neurogênese Primária em Xenopus Os embriões Usando Imunomarcação

O objetivo geral deste experimento é permitir a visualização rápida e conveniente de diferentes populações de células neuronais no cérebro embrionário de xenopus em desenvolvimento. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave no campo da neurogênese primária, como observar o processo de regulação da diferenciação neuronal no sistema nervoso central do xenopus. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a observação simultânea do pool de progenitores de células-tronco neurais, bem como um pool neural primário diferenciado dentro de um único experimento.

Para iniciar este procedimento, aspire cuidadosamente cinco a dez embriões para fora do frasco de vidro usando uma pipeta de plástico ou vidro sem introduzir bolhas de ar. Transfira os embriões para a câmara de montagem e observe sob um estereoscópio. Encha a câmara de montagem com solução de gelatina para garantir a rigidez do bloco de secção.

Em seguida, organize os embriões lado a lado usando uma pinça de ponta fina. Marque a orientação da cabeça desenhando uma seta na borda da câmara usando um marcador compatível com criogenia. Para vários grupos de embriões, anote a descrição de cada grupo na borda da câmara correspondente.

Em seguida, coloque cuidadosamente a câmara horizontalmente em uma caixa de espuma cheia até a metade com gelo seco. Feche a tampa e deixe a câmara de montagem congelar uma de cada vez por cinco a dez minutos. Depois disso, prossiga com o crioseccionamento ou mantenha as amostras congeladas a 80 graus Celsius por pelo menos uma a duas semanas sem perder a imunogenicidade.

Neste procedimento, remova o bloco de amostra congelado da câmara pressionando o fundo da câmara usando um bastão cego ou um dedo. Em seguida, adicione várias gotas de meio de congelamento de tecido no disco de retenção da amostra. Montar o bloco de amostras com a extremidade anterior dos embriões virada para cima e deixar o bloco montado repousar na câmara do criostato durante cerca de um minuto ou até que o meio de congelação dos tecidos se torne opaco.

Instale imediatamente o sample disco de retenção no micrótomo com a parte inferior do sample bloco voltado para cima. Apare uma parte do sample bloco usando uma lâmina quando o sample bloco ainda estiver relativamente macio. Em seguida, deixe o disco de retenção de amostra no micrótomo por pelo menos cinco minutos para permitir que sua temperatura atinja o equilíbrio.

Depois, corte gradualmente o bloco de amostra até que as cabeças dos girinos sejam visíveis através da gelatina translúcida. Para aumentar a velocidade de corte, aumente a espessura da seção. Monitore o desempenho do criostato, como a nitidez e o ângulo da lâmina, para garantir que as seções subsequentes sejam geradas em uma faixa longa.

Assim que as cabeças dos girinos ficarem visíveis, ajuste as configurações do criostato de volta ao normal, para garantir que as fatias acabadas possam formar tiras e não se sobreponham ou grudem na lâmina. Em seguida, continue aparando até que as cabeças dos girinos estejam quase expostas. Escove todas as seções remanescentes no palco antes de começar a coletar as seções de amostra.

Faça aproximadamente 10 a 15 seções e deixe-as formar uma longa tira. Vire a placa de vidro de cobertura grossa para o lado e remova cuidadosamente a tira da lâmina usando um pincel de ponta fina. Em seguida, organize-o no palco com o eixo longo paralelo à lâmina.

Faça de 10 a 15 seções e deixe-as formar uma longa tira sem quebrar. Pode não ser fácil e requer prática. Um truque é tentar não aplicar a velocidade muito alta no volante.

Em vez disso, gire o volante com cuidado e lentamente. Depois disso, escolha uma lâmina carregada positivamente em temperatura ambiente e etiquete-a com um lápis. Em seguida, pressione-o rápida e firmemente na tira com o lado rotulado voltado para baixo.

Em seguida, remova a lâmina da câmara do criostato. Repita esta etapa para organizar de 20 a 30 fatias em paralelo em cada lâmina. Seque as laterais ao ar por 10 minutos e, em seguida, prossiga imediatamente para o procedimento de imunocoloração ou armazene as lâminas em uma caixa de lâminas a 80 graus Celsius por até três a seis meses antes da realização do procedimento de imunocoloração.

Aqui, podemos ver os planos de seção correspondentes do prosencéfalo, mesencéfalo, rombencéfalo e medula espinhal de um girino xenopus, que serão usados para fornecer referências posicionais para as imagens a seguir. As seções transversais correspondentes, que foram coradas com Anti-Sox 3, Tubulina Antiacetilada e DAPI, mostram as localizações relativas dos pools de células-tronco neurais, bem como dos neurofilamentos dentro do tubo neural. E aqui estão as seções transversais correspondentes coradas com Anti-MyT1 e DAPI que mostram as localizações relativas dos neurônios primários diferenciados dentro do tubo neural.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de garantir tempo de resfriamento suficiente para o bloco de amostra em gelo seco. Caso contrário, o bloco de amostra pode não ser duro o suficiente e, portanto, difícil de cortar.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência do desenvolvimento explorarem a diferenciação neural no sistema nervoso central de xenopus. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer seções e observar pools específicos de células neuronais em um sistema nervoso central de xenopus.