Name: Um romance Ex Ovo Técnica Banding para Alter intracardíaca Hemodinâmica em um sistema embrionário de galinha (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprenda a técnica de bandagem Ex Ovo para alterar hemodinâmica intracardíaca em embriões de galinha. Este método permite estudar consequências genéticas de mudanças hemodinâmicas no desenvolvimento cardiovascular.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Robert Price e à equipe do Centro de Recursos de Instrumentação da Escola de Medicina da Universidade da Carolina do Sul. Este trabalho foi parcialmente apoiado por uma Bolsa de Pesquisa de Pós-Graduação SPARC do Gabinete do Vice-Presidente de Pesquisa da Universidade da Carolina do Sul (JDP / VM). Além disso, este trabalho foi apoiado pelo acordo de pesquisa Cook Biotech (JDP) e pela FirstString Research Inc (JDP) e NIH 2 P20-RR016434-06 (JDP). Além disso, a concessão do NIH IDeA Networks of Biomedical Research Excellence (INBRE) para o P20GM103499 da Carolina do Sul (JE)

embriões de aves não são considerados animais vertebrados nos termos da regulamentação IUCAC. 1. A obtenção de embriões para Cirurgia <ol><li> Incubar 80 - 90 ovos de galinha fertilizados Bovan (sem corte final para cima) em um umidificado (60%) incubadora roqueiro a 40 ° C durante aproximadamente 72 horas para se obter embriões em Hamilton e Hamburger (HH) estágio 17. Determinar o número exato de ovos com base em análise de poder e taxa de sobrevivência de embriões 17. Use bandejas de ovos de plástico para a incubação para permitir a circulação de ar adequada. </li><li> Uma vez que esta fase de desenvolvimento desejado é atingido, coloque aproximadamente 20 ml de tampão quente (37 ° C) de Tyrode (suplementado com bicarbonato de sódio (1 g / L)) em 100 mm x 26 mm de placa de petri. </li><li> Esterilizar uma casca de ovo com 70% de etanol. </li><li> Suavemente quebrar a casca com um cabo de bisturi e solte cuidadosamente o seu conteúdo para o prato contendo tampão de Tyrode. Descartar embriões se (i) que visualmente parece anormal (ii)não estão na fase de desenvolvimento direita (iii) forem mal orientados sobre a gema e / ou (iv) ocorre o sangramento. Reter quaisquer embriões não sujeitos a cirurgia imediatamente após ser colocado ex ovo a 40 ° C de modo a não comprometer o desenvolvimento. Nota: Staging é realizada com base em Hamilton e Hamburger 18. A anormalidade de embriões de galinha é determinada a olho nu e sob o escopo de dissecação. Certifique-se que o embrião tem dobragem apropriada e flexão e vasculatura. </li></ol> 2. OFT Banding <ol><li> Tweeze out individuais tópicos de 1 cm de comprimento de um único 11/0 nylon sutura cirúrgica e formar um nó frouxo. UV esterilizar todos nós pré-formados. </li><li> Sob um microscópio de dissecção, visualmente assegurar que o coração está a bater, a uma taxa normal (~ 120 batimentos / min). Se não, descartar o embrião. </li><li> Imediatamente antes da cirurgia, aplica 5 - 6 ml de tampão quente (37 ° C) de Tyrode à superfície do embrião utilizando uma pipeta de transferência. </li><li> Passe uma extremidade livre do nó pré-formada sob o OFT, posicione a sutura na junção OFT / ventrículo (OVJ) (ou local desejado), e passar a extremidade livre para o nó contraindo assim o OFT incluindo as membranas que envolvem o coração. </li><li> Após a cirurgia, molhar a superfície da gema com 5 - 6 mL de água morna (37 ° C) utilizando tampão de Tyrode uma pipeta de transferência. </li><li> Manter embriões de controlo ex ovo como os embriões faixas; no entanto, não submetê-las com o procedimento cirúrgico. </li><li> Incubar os embriões, durante o período de tempo desejado, a 40 ° C em um (60%) incubador humidificado. </li><li> Uma vez que o ponto de tempo desejado seja alcançado, extirpar o embrião da gema com uma tesoura reta. Dissecar o coração com uma pinça fina e usar para diversos estudos a jusante, tais como alterações na morfologia cardíaca devido a hemodinâmica alterada 17. </li></ol> 3. Afirmar que a intervenção Banding provoca uma mudança na Hemodinâmica Nota: A constrição parcial causado pela intervenção bandas leva a um aumento da velocidade do fluxo sanguíneo na OVJ. Este parâmetro hemodinâmico é convenientemente avaliada utilizando ecografia 2D de imagem, a qual é realizada no ponto de tempo desejado do experimento. <ol><li> Uma vez que apenas um único embrião pode ser trabalhada ao mesmo tempo, manter todas as outras embriões designados para imagiologia de ultra-sons numa incubadora a 40 ° C. </li><li> Colocar a placa de petri contendo o embrião a ser trabalhada sobre uma almofada de aquecimento para 40 ° C. </li><li> Encha o prato, até a borda, com tampão quente (37 ° C) de Tyrode. Lentamente, deitar a solução de tampão para o prato de modo a manter a gema intacta. Se, no entanto, a integridade da gema seja comprometida durante este passo, descartar o embrião. </li><li> Oriente o embrião de tal modo que o eixo central do embrião é perpendicular à sonda de ultra-sons, que está suspensa a partir de um suporte ajustável. </li><li> Com a ópera máquina de ultra-somting no modo B, obter uma imagem 2D do coração batendo na tela e mover o palco (almofada de aquecimento) de tal forma que o OFT, ventrículo e OVJ são claramente visíveis. </li><li> Mudar para o modo pulsado de ondas (PW), com a frequência de repetição do pulso desejado (por exemplo, 20 kHz) e obter dados de velocidade exatamente no OVJ. Uma imagem em modo B do batimento cardíaco é obtido na tela. <ol><li> Mova o palco para ver o OFT, ventrículo e da OVJ. Usando o software da máquina de ultra-som, obter medições de velocidade exatamente no OVJ. </li></ol></li></ol> Nota: Se a frequência cardíaca de um embrião diminui durante a imagem, dados de velocidade assim obtidos não devem ser utilizados para a análise. Todos os embriões utilizados para medições de velocidade devem, preferencialmente, ser utilizados para quaisquer outros experimentos após ultra-sonografia.

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<li>Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraembryonic+venous+obstructions+lead+to+cardiovascular+malformations+and+can+be+embryolethal%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Extraembryonic venous obstructions lead to cardiovascular malformations and can be embryolethal.</a> Cardiovasc Res. 41 (1), 87-99 (1999).</li>
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<li>Lucitti, J., Tobita, K., Keller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+hemodynamics+and+mechanical+properties+after+circulatory+intervention+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Arterial hemodynamics and mechanical properties after circulatory intervention in the chick embryo.</a> J Exp Biol. 208 (pt 10), 1877-1885 (2005).</li>
<li>Menon, V., Eberth, J., Goodwin, R., Potts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Hemodynamics+in+the+Embryonic+Heart+Affects+Outflow+Valve+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Dev.+Dis%22%5BJournal%5D)">Altered Hemodynamics in the Embryonic Heart Affects Outflow Valve Development.</a> J. Cardiovasc. Dev. Dis. 2 (2), 108-124 (2015).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 473-481 (1951).</li>
<li>Midgett, M., Goenezen, S., Rugonyi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+dynamics+reflect+degree+of+outflow+tract+banding+in+Hamburger-Hamilton+stage+18+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Blood flow dynamics reflect degree of outflow tract banding in Hamburger-Hamilton stage 18 chicken embryos.</a> J R Soc Interface. 11 (100), (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Esta técnica é relativamente rápido e fácil de executar, no entanto alguns pontos essenciais precisam ser mantidos em mente, de modo a obter resultados a jusante precisos. Os embriões deve ser mantido ex ovo numa placa de Petri que contém tampão de Tyrode para proporcionar re-hidratação adequada. Também é importante para hidratar a gema de pós-operatório com tampão de Tyrode e para garantir que a câmara de incubação é adequadamente hidratado. Cirurgias não deve ser realizada em um embrião se houver sangramento ...

As válvulas de saída anormalmente formadas são o tipo mais comum de defeitos cardíacos congênitos 1. No entanto, a estrutura e a função da válvula cardíaca defeituosas, embora presentes no nascimento, podem se tornar sintomáticas apenas na idade adulta. De fato, várias doenças valvares do adulto podem ser atribuídas a uma origem congênita. O tratamento desses pacientes geralmente envolve a substituição de válvulas defeituosas e, mais importante, as válvulas aórticas substituídas demonstraram ter anomalias congênitas 2. Dado o fato de que os processos críticos envolvidos no desenvolvimento valvar começam precocemente durante a embriogênese, destaca-se a importância de entender melhor os mecanismos que regulam esses eventos. 
O tubo cardíaco primitivo, que é o primeiro órgão funcionante em um embrião, exibe duas camadas distintas - um endocárdio endotelial circundado por miocárdio - separadas por matriz extracelular (geléia cardíaca) que é produzida e secretada principalmente pelo miocárdio 3-5. À medida que o desenvolvimento continua, os primórdios valvares (almofadas endocárdicas) são formados, após a alça direita do coração embrionário, pela expansão local da geléia cardíaca no canal atrioventricular (AV) e na via de saída (OFT) 4,6. Essa expansão é mediada pelo processo altamente regulado de transição epitelial-mesenquimal (EMT), durante o qual a geléia cardíaca torna-se povoada por células mesenquimais derivadas do endocárdio 6. Além da população mesenquimal derivada da EMT, as células da crista neural também estão envolvidas na valvulogênese do OFT 3. 
Estímulos hemodinâmicos, como o estresse de cisalhamento, são importantes fatores epigenéticos que regulam o desenvolvimento cardíaco no embrião 7,8. Usando um sistema 3D in vitro, mostramos anteriormente que a tensão de cisalhamento é um fator que influencia a expressão e a deposição de proteínas fibrosas da matriz extracelular (MEC) em almofadas AV e OFT 9,10. Além disso, estudos realizados por vários pesquisadores demonstraram que o fluxo sanguíneo alterado leva à impropriedade das valvas e à formação de septos11-16. Recentemente, usando o novo procedimento de bandagem aqui apresentado, mostramos que a mudança hemodinâmica no coração embrionário do pintinho afeta os processos iniciais envolvidos na formação da válvula OFT 17.
A técnica descrita aqui fornece um novo modelo para alterar a hemodinâmica no coração de pintinho em desenvolvimento, contraindo parcialmente o OFT ex ovo. Este procedimento reprodutível é relativamente rápido e permite que os pesquisadores obtenham um número suficiente de embriões / corações inteiros / tecido OFT, etc. para análises a jusante, incluindo estudos de expressão gênica. Além disso, este novo modelo pode ser usado para estudar os efeitos "crônicos" da hemodinâmica alterada no desenvolvimento da válvula OFT.

<table><tbody><tr><td>Ovos de galinha Bovan fertilizados</td><td>Clemson University, Clemson, SC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>11 / 0 Sutura de nylon</td><td>Ashaway</td><td>S30001</td><td>UV esterilizar nós antes da cirurgia</td></tr><tr><td>100 x 26 mm placa de Petri</td><td>VWR</td><td>25387-030</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td>Cabo de bisturi <td>232-20S</td><td></td></tr><tr><td>#3</td><td>Tesoura reta Fine Science Tools</td><td>91003-12</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pinça fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Tyrodes buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2145-10L</td><td>Esterilize o filtro antes de usar&nbsp;</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 770 Sistema de imagem de ultrassom</td><td>VisualSonics, Inc.</td>Transdutor de ultrassom <td>VS-11392</td><td></td></tr><tr><td>708</td><td>VisualSonics, Inc.</td><td>VS-11171</td><td></td></tr></tbody></table>

um romance<em&gt; ex ovo</em&gt; técnica banding para alter intracardíaca hemodinâmica em um sistema embrionário de galinha

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

O novo modelo aqui apresentado pode ser usado para entender a influência da hemodinâmica em processos específicos do desenvolvimento cardíaco, em nível celular e molecular. Para alterar a hemodinâmica intracardíaca, ovos de galinha fertilizados são incubados em uma câmara umidificada para obtenção de embriões do estágio desejado (HH17). Uma vez alcançado esse estágio de desenvolvimento, o embrião é mantido ex ovo e a hemodinâmica no coração embrionário é alterada pela constrição parcial da via de saída (OFT) com uma sutura cirúrgica na junção do OFT e do ventrículo (OVJ). Os embriões de controle também são cultivados ex ovo, mas não são submetidos à intervenção cirúrgica. Os embriões em bandas e o controle são então incubados em uma incubadora umidificada pelo período de tempo desejado, após o qual o ultrassom 2D é empregado para analisar a mudança na velocidade do fluxo sanguíneo na JVA como resultado da bandagem OFT. Uma vez que os embriões são mantidos ex ovo, é importante garantir uma hidratação adequada na câmara de incubação para evitar o ressecamento e, eventualmente, a morte do embrião. Usando este novo modelo em bandas, agora é possível realizar análises de mudanças na expressão dos principais atores envolvidos no desenvolvimento da válvula e entender o papel da hemodinâmica nas respostas celulares in vivo, o que não poderia ser alcançado anteriormente.

Mostrado na Figura 1 são os instrumentos necessários para OFT banding recomendado. A placa de petri (Figura 1A), contendo o embrião ex ovo deve ser suficientemente profundo, de forma a não destruir o embrião quando coberta com a tampa. As placas de Petri profundas (Figura 1C) também deve ser utilizado para imagiologia de ultra-sons para permitir um volume adequado de tampão de Tyrode para ser derramado sobre a gema. <p class...

Pela primeira vez, apresentamos aqui um procedimento de bandagem reprodutível para alterar a hemodinâmica no coração em desenvolvimento ex ovo. Isso é conseguido restringindo parcialmente o trato de saída (OFT).

Um romance<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Técnica Banding para Alter intracardíaca Hemodinâmica em um sistema embrionário de galinha

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

O objetivo geral deste procedimento de bandagem Ex Ovo é criar uma alteração reprodutível e não letal na hemodinâmica cardíaca para estudar as consequências genéticas resultantes. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do desenvolvimento cardiovascular, como o desenvolvimento das válvulas cardíacas e os estados patológicos associados. A força deste sistema é que ele pode ser usado para estudar vias genéticas que respondem a alterações hemodinâmicas no coração e nas válvulas em desenvolvimento, além de auxiliar na identificação de um ponto crítico no qual a recuperação de um coração não apresenta efeitos deletérios a longo prazo.Assim, demonstrando o procedimento estar&aacute; Lorain Junor, t&eacute;cnica do meu laborat&oacute;rio, e o Sr. Vinal Menon, um estudante de doutorado no laborat&oacute;rio, que demonstrar&atilde;o o manuseio dos ovos e o uso do aparelho de ultrassom. Incube de 80 a 90 ovos de galinha Bovan fertilizados com suas extremidades arredondadas voltadas para cima em bandejas pl&aacute;sticas para ovos, dentro de uma incubadora oscilante umidificada ajustada a 40 graus Celsius. Deixe-os desenvolverem por aproximadamente 72 horas at&eacute; o est&aacute;gio HH 17.Uma vez no Estágio 17, despeje

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