Isolamento e Caracterização de uma cabeça e pescoço carcinoma espinocelular subpopulação Tendo-tronco características celulares

O objetivo geral deste procedimento é isolar células-tronco cancerígenas de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço ou linhagens celulares de HNSCC. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do tratamento do câncer sobre como usar a quimioterapia para superar a radiorresistência do tumor. A principal vantagem dessa técnica é que ela usa uma combinação de marcadores para obter uma alta especificidade em células-tronco cancerígenas de linhagens celulares de CECP.

A demonstração do procedimento será feita por Prescillia Battiston-Montagne, nossa técnica, e Marion Gilormini, PhD do meu laboratório. Para selecionar uma população lateral de células-tronco cancerígenas pelo ensaio de efluxo de corante de Hoechst, primeiro rotule um tubo cônico Hoechst e um Hoechst e Verapamil. Em seguida, lave uma cultura de células HNSCC com PBS estéril, seguida pela adição de um mililitro de Tripsyn EDTA.

Após três minutos a 37 graus Celsius, pare a reação com meio de cultura de células frescas e conte as células. Dilua a cultura para uma vez 10 elevado a sétima células por mililitro e complete o meio da linha celular parental. Em seguida, adicione 100 microlitros ao tubo Hoechst e Verapamil e quatro mililitros de células ao tubo Hoechst.

Em seguida, misture suavemente 10 microlitros de solução de cloridrato de Verapamil de cinco milimolares na amostra de Hoechst e Verapamil, seguida de cinco microlitros de Hoechst por um vezes 10 elevado à sexta célula em ambos os tubos. Em seguida, cubra as amostras com papel alumínio e coloque-as a 37 graus Celsius. Após 90 minutos com mistura suave, a cada 15 minutos centrifugue os tubos e ressuspenda os pellets em dois mililitros de PBS.

Após centrifugação central, ressuspender o chumbinho Hoechst e Verapamil em 500 microlitros de iodeto de propídio em PBS e o pastilha Hoechst em quatro mililitros do mesmo. Agora filtre as amostras através de filtros de células de 70 mícrons em tubos FACS para remover quaisquer agregados e coloque as amostras em gelo protegido da luz. Em seguida, carregue a amostra Hoechst no citômetro de fluxo e abra a janela Planilha Global no software do citômetro de fluxo.

Clique em Dot Plot para criar um gráfico na Planilha Global e clique com o botão direito do mouse para selecionar os parâmetros de dispersão direta e lateral. Crie uma dispersão lateral ampla por um gráfico de pontos de altura de dispersão lateral da mesma maneira e, em seguida, clique na porta do polígono para criar uma região P1 no segundo gráfico para selecionar as células individuais e discriminar os dublês. Em seguida, crie uma área Hoechst vermelha por um gráfico de pontos de área Hoechst azul e clique com o botão direito do mouse nas células para destacar a população P1.

Em seguida, crie uma região P2 para selecionar a população de células do lado do corante Hoechst negativo que aparece como um braço lateral à esquerda da população principal de células e colete 10.000 dos eventos de amostra Hoechst. Para confirmar que a porta P2 que representa a população lateral está posicionada corretamente, colete também 10.000 eventos de amostra Hoechst e Verapamil. A população secundária deve desaparecer.

Em seguida, classifique a população lateral de células negativas para corante Hoechst em um tubo cônico de 15 mililitros contendo um mililitro de meio completo de células-tronco cancerígenas. No final da classificação, gire as células e ressuspenda o pellet da população lateral em um mililitro de meio de células-tronco cancerígenas completas frescas. Em seguida, contar as células e semeá-las no número adequado para um novo balão de cultura de células.

Para selecionar o subconjunto CD44-high/ALDH-high das células da população lateral classificadas, primeiro rotule sete tubos cônicos estéreis de 15 mililitros, conforme indicado. Em seguida, dilua as células classificadas para uma vez 10 elevado a sete células por mililitro em meio de células-tronco e alíquota de 100 microlitros de células para os tubos CD44-APC e IGG1-APC não corados e quatro mililitros de células para o tubo ALDH e CD44-APC, tudo em gelo. Gire as células e ressuspenda os pellets CD44-APC e IGG1-APC não corados em 100 microlitros de tampão um do kit ALDEFLUOR.

Em seguida, adicione cinco microlitros do inibidor de ALDH DEAB aos tubos ALDH e DEAB e ALDH DEAB e CD44-APC. Ressuspenda as células no tubo ALDH e CD44-APC em quatro mililitros de reagente C contendo quatro mililitros de tampão um e 20 microlitros do reagente do kit e transfira imediatamente 100 microlitros dessas células para os tubos ALDH, ALDH e DEAB, e ALDH DEAB e CD44-APC. Em seguida, coloque todos os tubos em banho-maria a 37 graus Celsius por 30 minutos, protegidos da luz, misturando as amostras após 15 minutos por vórtice suave.

No final da incubação, centrifugar todas as amostras e rejeitar os sobrenadantes. Em seguida, coloque todos os tubos no gelo e ressuspenda o pellet ALDH e CD44-APC em quatro mililitros de tampão A, um pellet CD44-APC e ALDH DEAB e CD44-APC em 100 microlitros do mesmo. Ressuspenda o pellet IGG1-APC em 100 microlitros de tampão B e os tubos ALDH e ALDH e DEAB não corados em 100 microlitros de tampão um.

Após 10 minutos, gire todas as amostras novamente, seguidas de uma lavagem em 1 mililitro de tampão um para todas as amostras, exceto a amostra ALDH e CD44-APC, que é lavada em quatro mililitros de tampão um. Após a segunda centrifugação, ressuspenda todos os pellets em um mililitro de tampão fresco um, exceto a amostra ALDH e CD44-APC, que é ressuspensa em quatro mililitros de tampão um. Agora carregue o tubo ALDH e CD44-APC no citômetro de fluxo e crie um APC por gráfico de pontos fitsy para visualizar a população com coloração dupla.

Em seguida, carregue o tubo ALDH para criar uma porta para células ALDH-high. As células positivas devem desaparecer quando o tubo ALDH e DEAB é carregado. No mesmo gráfico, crie uma segunda porta usando os tubos CD44-APC e IGG1-APC para selecionar as células CD44-high.

As células positivas desaparecerão quando o tubo IGG1-APC for carregado. Em seguida, carregue os tubos ALDH e CD44-APC e ALDH DEAB e CD44-APC para criar uma terceira porta que inclua as células CD44-high/ALDH-high. Use o tubo ALDH-CD44 de coloração dupla para posicionar a última porta nas células duplamente positivas.

Em seguida, classifique as células CD44-high/ALDH-high em um tubo cônico de 15 mililitros contendo um mililitro de meio completo de células-tronco cancerígenas, coletando as células CD44-low/ALDH-low em um mililitro de meio de cultura de células completo, conforme desejado. Após a segunda classificação, colocar as células CD44-high/ALDH-high num balão de cultura de células adequado com meio completo de células cancerígenas na incubadora de cultura de células durante 18 a 24 horas. Quando as células estiverem fixadas ao fundo do balão, mudar o meio de cultura e voltar a colocá-lo na incubadora.

Para confirmar o potencial tumoral das células CD44-high/ALDH-high, tripsinize a monocamada semelhante a um tronco cancerígeno, conforme demonstrado, para obter uma suspensão de célula única e transfira uma vez 10 para as seis células para um tubo cônico de 15 mililitros. Depois de girar as células, ressuspenda o pellet em meio sérico baixo suplementado com fator de crescimento epidérmico humano recombinante heparina e B27 e incube as células em uma placa de Petri de baixa ancoragem na incubadora de cultura de células até que as esferas tumorais sejam observadas por microscopia óptica. Quando a triagem é realizada pela primeira vez em uma nova linhagem celular, é necessário confirmar o potencial tumoral da linhagem celular, conforme evidenciado por sua capacidade de formar esferas tumorais em meio livre de soro in vitro.

Além disso, a QPCR deve demonstrar uma alta expressão de beta-catenina e outros marcadores de células-tronco pelas células CD44-high/ALDH-high. As células CD44-high/ALDH-high também devem ser capazes de formar tumores in situ quando injetadas em pequenas quantidades em comparação com as células CD44-low/ALDH-low. Uma vez dominado, cada classificação de células deve ser capaz de ser concluída em cinco horas se forem executadas corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de proteger as amostras marcadas com fluorocromo da exposição direta à luz. Após este procedimento, outros métodos, como ensaios de migração de invasão, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre o envolvimento de células-tronco cancerígenas no processo metastático. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do câncer explorarem os mecanismos de escape do tumor no câncer de CECP.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar células-tronco cancerígenas de linhagens celulares de HNSCC usando análise multiparamétrica, citometria de fluxo e classificação de células. Não se esqueça de que trabalhar com células tumorais e intercalar agentes de DNA pode ser extremamente perigoso e que precauções como usar jaleco e luvas devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.