Name: Isolamento e Caracterização de uma cabeça e pescoço carcinoma espinocelular subpopulação Tendo-tronco características celulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco cancerígenas de linhagens de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço usando citometria de fluxo multiparamétrica. Este método permite estudar resistência terapêutica e recorrência tumoral.

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Agradecemos a Thibault Andrieu e Sebastien Dussurgey da Plataforma de Citometria de Fluxo da UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) por seus conselhos e ajuda durante nossa triagem. Este trabalho foi realizado no âmbito científico do ETOILE e Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes locais sobre cuidados com animais. Todos os detalhes deste estudo foram aprovados pelo CECCAPP, uma comissão de ética francesa. 1. Selecção de uma População lateral (SP) pelo corante Hoechst efluxo Ensaio <ol><li> A coloração 50 milhões de células com corante Hoechst 33342. <ol><li> Preparar dois tubos de 15 ml estéreis com um fundo cônico: um tubo rotulado &quot;Hoechst&quot; e um marcado &quot;Hoechst e Verapamil&quot;. Preparar 10 ml de uma solução 5 mM de cloridrato de verapamil em água estéril. Prepara-se o meio de cultura (CM) de células estaminais. <ol><li> Para preparar CM para CSC (CM-CSC), combinar o seguinte: meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM): F12 (1: 3, v: v), 5% de soro fetal de vitelo (FCS), 0,04 mg / L de hidrocortisona , 100 U / ml de penicilina, 0,1 g / L de estreptomicina, e 20 ug / L do factor de Crescimento epidérmico (EGFR). </li></ol></li><li> Sob uma capela de fluxo laminar, trypsinize células. Remova a mídia, lavar com sterile fosfato tamponado salino (PBS) e adicionar 1 ml de tripsina-EDTA (0,5 g / l) para um frasco de 75 cm. Incubar 3 min a 37 ° C. Parar a reacção pela adição de meio de cultura utilizado para a linha de célula parental. Contar o número de células utilizando um contador de células. <ol><li> Para preparar CM para a linha celular parental (CM-P), complementar DMEM com 10% de FCS, 0,4 mg / L de hidrocortisona, 100 U / ml de penicilina e 0,1 g / L de estreptomicina). </li></ol></li><li> Dilui-se a suspensão de células obtida na etapa 1.1.2 para se obter 10 7 células / mL em CM-P. Dividir a suspensão de células em tubos preparados os 2: colocar 100 ul (10 6 células) no tubo &quot;Hoechst e Verapamil&quot; e 4 ml (4 x 10 7 células) no tubo &quot;Hoechst&quot;. </li><li> Na amostra &quot;Hoechst e Verapamil&quot;, adicione 10 ml de 5 solução de cloridrato de Verapamil mM (concentração final: 0,5 mM) e misture delicadamente. Adicionar 5 uL de 1 g / L a Hoechst solução (concentração final: 0,1 g / L). Na amostra # &amp;34; Hoechst &quot;, adicionar 5 mL de 1 g / L Hoechst solução por 10 6 células (200 ul total) Daí em diante, manter as amostras protegidas da exposição à luz directa usando papel alumínio.. </li><li> Incubar todos os tubos em um banho de água a 37 ° C durante 1 hora e 30 minutos. Misture suavemente a cada 15 min para evitar que as células de se estabelecer. </li><li> tubos de centrifugação a 250 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender cada sedimento com 2 mL de PBS 1x. </li><li> tubos de centrifugação a 250 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante. Ressuspender &quot;Hoechst e Verapamil&quot; sedimento em 500 ul de 5 mg / l de iodeto de propídio (PI) diluído em tampão PBS e &quot;Hoechst&quot; sedimento em 4 ml de 5 mg / L de PI diluído em tampão PBS. </li><li> A transferência das soluções amostra através de um filtro de 70 | iM de células para remover agregados e recolher células individuais em tubos de amostra para a absorção no citómetro de fluxo. Manter as amostras em gelo e proteger da exposição à luz directa usando papel alumínio. </li></ol></li><li> Eusolation da População Side Excluindo Hoechst corante classificando celular. <ol><li> Realizar a separação celular negativa Hoechst em uma citometria de fluxo classificador com os seguintes parâmetros: laser UV (355 nm), 2 detectores no caminho laser UV com Hoechst azul (450/50 BP) e Hoechst vermelho (610/20 BP) filtros e 2 colecionadores. <ol><li> Em primeiro lugar, analisar amostra &quot;Hoechst&quot; que serve como um controlo positivo para a coloração de citometria de fluxo e set-up. </li><li> Usando o software citômetro, na janela &quot;Global de Planilha&quot;, clique em &quot;Dot Plot&quot; (quinto topo imagem da direita) e criar um gráfico na planilha global. Em ordenada, com um clique direito, selecione FSC-A (dispersão para a frente) e em abcissas, SSC-A (dispersão lateral) (Figura 1A). Da mesma forma, criar um CSC-W contra gráfico de pontos SCC-H. Nesta segunda gráfico de pontos, para criar uma região P1, clique em &quot;Polígono gate&quot; (XIV topo direito de imagem) (Figura 1B) 33. Nota: A região P1abrangem células individuais e discriminar dupletos. </li><li> Opcional: Excluir PI células positivas criando um FSC-A versus PI fechado em P1. Nesta gráfico de pontos, selecione a população negativa PI (P2) para excluir as células mortas positivos PI. </li><li> Usando o software citômetro, na janela &quot;Global de Planilha&quot;, clique em &quot;Dot Plot&quot; e criar um gráfico na planilha global. Em ordenada, com um clique direito, selecione azul Hoechst-A e na abscissa, vermelho Hoechst-A. Com um clique direito sobre a população, selecione &quot;Mostrar população&quot; e P1. Nesta gráfico de pontos, criar uma região (P2) para seleccionar as células Hoechst população lado corante negativo (SP) que aparece como um braço lateral do lado esquerdo da população principal de células (Figura 1C). </li></ol></li><li> Analisar a amostra &quot;Hoechst&quot; e recolher 10.000 eventos. Para garantir que o P2 portão, que representa a população SP, está bem posicionado, analisar a amostra &quot;Hoechst e Verapamil&quot; (10.000 eventos)observar o desaparecimento da população SP (Figura 1D). </li><li> Recolher as células negativas SP corante Hoechst em um tubo de 15 ml contendo 1 ml de CM-CSC preparados em 1.1.1.1. </li><li> No fim da separação de células, centrifugação da suspensão de células a 250 xg durante 5 minutos, remover o sobrenadante e ressuspender o pellet com 1 ml de CM-CSC. Contar o número de células classificadas usando um contador de células e transferir número adequado de células para um frasco de cultura (ver Tabela 1). Adicionar CM-CSC e incubar a 37 ° C e atmosfera de 5% de CO 2. </li><li> Manter as células em cultura sob as mesmas condições para um máximo de 2 passagens até que haja um mínimo de 5 x 10 7 células (ver passo 3, &quot;método de cultura celular&quot;). </li></ol></li></ol> 2. Seleção do alto / ALDH alta Sub-população CD44 na lateral População Ordenado <ol><li> Coloração 50 milhões de células SP com a Detecção Kit ALDH e CD44 de anticorpo. <ol><li> Prepare sete 15 ml tubos estéreis rotulados como segue: &quot;Unstained&quot; (tubo a) &quot;, CD44-APC&quot; (tubo b), &quot;IgG1-APC&quot; (Tubo c), &quot;ALDH&quot; (Tubo d), &quot;ALDH e DEAB &quot;(tubo e)&quot;, ALDH e CD44-APC &quot;(tubo f),&quot; ALDH, DEAB e CD44-APC &quot;(Tubo g). Mantenha todos os tubos e reagentes a 4 ° C durante a coloração. </li><li> Preparar tampão A com 4,5 ml de tampão 1 (contida no kit) e 45 uL de CD44-APC (aloficocianina) anticorpo (diluição 1: 100). Preparar tampão B com 100 ul de tampão 1 e 1 ul de anticorpo de IgG1-APC (diluição 1: 100). Preparar tampão C com 4 ml de tampão 1 e 20 ul de reagente do kit. </li><li> Prepara-se uma suspensão de células das células previamente ordenadas (passo 1.2.5) em 10 7 células / ml. Adicionar 100 mL (10 6 células) da suspensão de células para tubos, b e c, e 4 ml (4 x 10 7 células) ao tubo f. Para o momento não colocar as células em tubos de d, e, g. </li><li> Centrifugar os tubos contendo as células a 250 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender as pastilhas em tubos A, B e C em 100 ul de tampão 1. Adicionar 5 uL de dietilaminobenzaldeído (deab), um inibidor da ALDH para tubos e e g. <ol><li> Ressuspender as células em tubos de f com 4 ml de reagente C e imediatamente transferir 100? l em tubos de d, e, g. Incubar todos os tubos em um banho de água a 37 ° C durante 30 min e proteger da exposição à luz directa utilizando folha de alumínio. Misture a suspensão de células suavemente em vórtex após 15 min para evitar que as células de decantação. </li></ol></li><li> A partir deste momento, manter os tubos em gelo e protegida da exposição à luz directa utilizando folha de alumínio. Centrifugar todos os tubos a 250 xg durante 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender tubo f em 4 mL e os tubos B e G com 100 ul de tampão A. Ressuspender tubo C com 100 ul de tampão B. Para os outros tubos, adicionar 100 ul de tampão 1. Incubar 10 min a 4 °; C. </li><li> Centrifugar todos os tubos a 250 xg durante 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Lavar uma vez com 1 ml de tampão 1 (4 ml) para o tubo f e centrifugar novamente a 250 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante. Re-suspender tubo f sedimento em 4 ml e todos os outros tubos em 1 ml de tampão 1. </li><li> Transfira as soluções de amostra através de 70 filtros celulares mm para remover agregados e recolher células individuais em tubos apropriados para a absorção de exemplo no citômetro de fluxo. </li></ol></li><li> Isolamento da alta / ALDH alta celular População CD44 por fluorescência Activated Seleção Cell. <ol><li> Realizar alta CD44 / ALDH elevada separação de células em um separador de citometria de fluxo com os parâmetros seguintes: a laser azul (488 nm) e o laser vermelho (633 nm), um detector de acordo com o caminho do laser azul com um filtro FITC (530/30), 1 detector no caminho de laser vermelho com um filtro de APC (660/20) e 2 coletores. </li><li> Usando o software citômetro, clique em &quot;Dot Plot &quot;(o quinto imagem canto superior direito) para criar um FSC-A versus SSC-A gráfico de pontos, como descrito no ponto 1.2.1.2, para verificar a morfologia das células e escolha uma população composta de células individuais com um SSC-W contra o SSC-H gráfico de pontos. </li><li> Usando o software citômetro, na janela &quot;Global de Planilha&quot;, clique em &quot;Dot Plot&quot; e criar um gráfico na planilha global. Em ordenada, com um clique direito, selecione APC-A e na abscissa, FITC-A, a fim de selecionar a população manchado de casal. Criar um portão utilizando tubos d e e para seleccionar células de alta ALDH (Figura 2A). Nota: As células positivas desaparecer no tubo e tratada com DEAB (Figura 2B). <ol><li> Na mesma carta, criar um segundo portão utilizando tubos b e c, a fim de seleccionar células de alta CD44 (Figura 2C e 2D). As células positivas desaparecer no tubo contendo IgG1-APC. Analisar tubos F e G e criar um terceiro portão que inclui CD44 alta / ALDH &lt;sup&gt; células de alta (Figura 2E e 2F). Nota: Se as células positivas estão presentes no tubo contendo IgG1-APC (Figura 2D), a interacção entre as células e o anticorpo de APC-coradas não é específica. </li></ol></li><li> Recolhe alta CD44 / ALDH células elevados para um tubo de 15 ml contendo 1 ml de CM-CSC. Recolha também CD44 baixo / ALDH baixo em um tubo de 15 ml contendo 1 ml de CM 19. Nota: Preparar CM-CSC tal como descrito no passo 1.1.1.1. </li><li> Centrifugar a suspensão de células a 250 xg durante 5 minutos, remover o sobrenadante e ressuspender o pellet com 1 ml de CM-CSC. Contar o número de células separadas. </li></ol></li></ol> 3. celular Método Cultura <ol><li> Após a dupla ordenação das células, tal como descrito acima, a chapa células classificadas em um frasco de cultura apropriado (Tabela 1) com CM-CSC a 37 ° C com 5% de CO 2. Depois de 18-24 horas,verificar se as células aderiram e alterar o meio de cultura. Mudar o meio de cultura a cada 3 dias até as colónias em expansão são maiores do que 50% confluentes. </li><li> Usar o volume apropriado de tripsina 0,5 g / L - EDTA (Tabela 1) para trypsinize células a partir do balão de cultura. Incubar as células 3 a 5 min a 37 ° C. Adicionar o volume apropriado de CM-CSC (Tabela 1) para parar a acção da tripsina. </li><li> Contar o número de células obtidas e placa 4 x 10 5 células em uma garrafa de cultura de 175 cm² com CM-CSC. Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2. A esta concentração, as células com um tempo de duplicação de 24 horas será de 70% confluentes em 7 dias. </li><li> Use CSCs para in vitro ou in vivo antes de terem sido submetidos a 3 passagens. </li></ol> 4. Confirmação de potencial de um tumor e CSC Características <ol><li> Tumor Formação Sphere para confirmam o potencial tumor do CD44 alta / ALDHaltas células. <ol><li> Trypsinize células como descrito no ponto 3.2. Adicionar 1 x 10 6 células para um tubo de 15 ml e centrifugar a 250 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em um DMEM: F12 (3: 1) meio isento de FCS, 20 ng / ml de rhEGF, 4 mg / L de heparina e 1x B27. Incubar as células num frasco de cultura de 6 poços baixo placas de fixação a 37 ° C e 5% de CO 2. Nota: O uso de DMEM: F12 (3: 1) meio contendo 5% de FCS, 20 ng / ml de rhEGF, 4 mg / L de heparina e 1x B27 se células não crescem sem FCS. </li><li> Observar a formação de tumor esfera com um microscópio óptico a partir de 4 a 10 dias após a sementeira (Figura 3A). Nota: O tumor esfera diâmetro deve ser superior a 35 um. As células CD44 altas / ALDH altos irá mostrar uma esfera formação mais rápida e mais reforçada tumor em termos de número e de tamanho em comparação com CD44 baixo / ALDH baixa. </li></ol></li><li> Avaliação In Vivo de tumorigenicidade DepoisA injecção subcutânea de CD44 alta / alta Cells ALDH em camundongos NOD-SCID. <ol><li> Após separação, as células re-suspender em PBS em três concentrações diferentes (10 4 culas / ml, 10 5 culas / ml, e 10 6 células / ml). Injectar por via subcutânea 100 ul de 10 4 culas / ml (3 10 células) no flanco direito região de 6 ratinhos. Fazer o mesmo durante 10 5 culas / ml (10 células), 4 e 10 6 células / ml (10 5 células). Nota: diluição inferior a 10 três células pode ser testada. </li><li> Injectar a mesma concentração de células CD44 de baixo Baixo / ALDH na região do flanco esquerdo. Ratos do Monitor injetado por até 10 semanas para ver a progressão do tumor 19. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo descreve um método de confiança para o isolamento bem sucedido de CSCs a partir de uma linha celular específica, que é aplicável a outras linhas de células de carcinoma epidermóide. CSCs de cabeça e pescoço isoladas são então adequado para posterior caracterização molecular in vitro e validação funcional por transplante em ratinhos imunodeficientes 19. No entanto, algumas modificações podem ser testados de acordo com a população CD44 lado ou os alta / ALDH percentagens ...

carcinoma da cabeça e pescoço de células escamosas (CECP) é um tumor maligno comum em todo o mundo e apesar dos progressos em tratamentos atuais, os pacientes com doença avançada têm um mau prognóstico. A taxa de sobrevivência de cinco anos geral do paciente é de cerca de 30%, apesar da combinação de abordagens terapêuticas, incluindo cirurgia, radioterapia e quimioterapia-segmentados terapias. Estudos recentes atribuem recorrência local e metástases à distância para a sobrevivência de câncer de células estaminais-like (CSCs) após terapias anticâncer 1. Existem provas acumuladas de apoiar a existência de células que apresentam propriedades de células estaminais (capacidades de estado indiferenciado, auto-renovação e diferenciação e actividade de telomerase) em diversos tumores sólidos incluindo cancro da mama, do cérebro, da próstata, do pulmão, do cólon, do pâncreas, do fígado e da pele 2- 10. No entanto, a origem de CSCs permanece obscuro 11,12. Eles podem resultar da transformação maligna de células-tronco normais 3,13 ou dedifferenciação de células tumorais que adquirem CSCs-como características 14,15. Portanto, a compreensão percursos distintos relacionados com CSCs irá fornecer informações sobre diagnóstico e tratamento de HNSCC resistentes cedo. Tem sido proposto que os CSCs também possuem fenótipos resistentes que contornam a quimioterapia e radioterapia padrão, resultando em recidiva tumoral em comparação com a maior parte das células tumorais 16-19 e estão localizadas em nichos 20 hipóxico. Numerosos factores têm sido propostos para explicar estas resistências de CSCs, tais como a propensão para a quiescência, reparação melhorada de ADN, sobre-regulada mecanismos de controlo do ciclo celular, e de eliminação de radicais livres 21. Além disso, várias vias moleculares oncogénicos podem ser especificamente activado em CSCs 17. A fim de melhorar o conhecimento dos CSCs para-terapias-alvo ainda mais, precisamos de métodos confiáveis ​​para a identificação e isolamento de CSCs, devido à heterogeneidade dos marcadores relacionados com células-tronco emvários tipos de cânceres 22. Em HNSCC, caule-como células de iniciação do tumor foram isoladas a partir de tumores primários do paciente por células que expressam diferentes biomarcadores CSC (tais como transportadores de efluxo de drogas expressão 23, CD44 alto, CD24 low CD133 alta, c-Met + fenótipo 10,24 triagem, 25, ou uma elevada actividade de ALDH 26) ou cultivar tumor primário paciente para formar squamospheres que têm propriedades CSC. No entanto, o número de squamospheres diminui dramaticamente após duas passagens, proporcionando, assim, um pequeno tamanho de amostra para caracterização adicional 27 estuda. Portanto, ensaios in vitro a partir de linhas celulares bem estabelecidas é uma solução mais fácil para projetar experiências, a fim de melhorar o conhecimento dos CSCs. O objetivo deste artigo é propor um método para isolar CSCs de linhas celulares CECP usando citometria de fluxo multiparamétrica análise de umnd separação de células. A expressão de CD44 em correlação com várias propriedades, incluindo a actividade de ALDH CSCs, lateral População (SP) fenótipo, a capacidade de formação de esferóides e tumorigenicidade são usados ​​para isolar e caracterizar esta sub-população de CCC. CD44, uma glicoproteína de superfície celular, está envolvido na adesão celular e migração. CD44 é altamente expressa em muitos tumores sólidos CSCs 28, inclusive em modelos de câncer de cabeça e pescoço 29-31. Além disso, células de alta CD44 pode gerar in vivo um tumor heterogêneo enquanto que as células CD44 baixas não pode 10. O ensaio SP baseia-se na diferença de potencial das células ef luxar o corante Hoechst 22 através da família de cassete de ligação a ATP (ABC) de proteínas transportadoras sobre-expressas na membrana CSC. Este ensaio inclui o uso de inibidores de transportadores ABC tais como verapamil em amostras de controlo. Aldeído desidrogenase (ALDH) é uma enzima intracelular que está envolvido na conversão de retinol para retácido inoic durante a diferenciação de células-tronco cedo 25,26. As células que exibem um comportamento de alta ALDH atividade show de haste-como células em HNSCC 26 e um número muito poucos de células de alta ALDH são capazes de gerar tumores in vivo 26,32. A combinação destes marcadores e propriedades foi utilizada com sucesso por Bertrand e t al., Para estudar a resistência in vitro e in vivo destes CSCs de fotões e de iões de carbono radiação 19. Os resultados mostraram claramente que a combinação de vários marcadores de células e propriedades são mais seletivos para estudos úteis sobre as populações HNSCC CSCs do que as abordagens-marcador único.

<table><tbody><tr><td>Soro de bezerro fetal Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona solúvel em água</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina 100x</td><td>Dominique Dutscher</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td>A solução deve ser preparada imediatamente antes do uso porque é muito instável</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>StemcellTM Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50x), menos vitamina A</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>Corrosivo, toxicidade aguda (oral, dérmica, inalação) categoria 4</td></tr><tr><td>Cloridrato de</td> <td>VerapamilSigma-Aldrich</td><td>V-4629</td><td>Toxicidade aguda (oral, dérmica, inalação) categoria 3</td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Toxicidade aguda (oral, dérmica, inalação) categoria 4</td></tr><tr><td>Kit ALDEFLUOR</td><td>Células-tronco</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>CD44-APC, anticorpo humano</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-095-177</td><td></td></tr><tr><td>IgG1-APC, anticorpo humano</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-189</td><td></td></tr><tr><td>Z1 coulter partícula</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio óptico</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>Linha celular CKX31</td><td></td></tr><tr><td>SQ20B</td><td>Presente do John Little ' s Linha</td> celular de <td>laboratório-FaDu</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ATCC</td><td>HTB-43</td><td></td></tr><tr><td>Placas de ancoragem baixa</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>145383</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva software v8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e caracterização de uma cabeça e pescoço carcinoma espinocelular subpopulação tendo-tronco características celulares

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Apesar dos avanços na compreensão da cabeça e pescoço progressão carcinomas de células escamosas (CECP), a taxa de sobrevivência de cinco anos permanece baixa devido à recorrência local e metástases à distância. Uma hipótese para explicar esta recorrência é a presença de câncer de células estaminais-like (CSCs) que apresentam quimioterapia inerente e radio-resistência. A fim de desenvolver novas estratégias terapêuticas, é necessário dispor de modelos experimentais que validam a eficácia dos tratamentos específicos e, por conseguinte, dispor de métodos fiáveis ​​para a identificação e isolamento das CSCs. Para este fim, é apresentado um protocolo para o isolamento de linhas CSCs de células de carcinoma epidermóide humano que assenta na combinação de duas células sucessivas ordenações realizadas por células activadas por fluorescência (FACS). O primeiro é baseado na propriedade de CSCs para superexpressão ATP de Ligação a cassete (ABC) proteínas transportadoras e, portanto, excluir, entre outros, corantes de ADN vitais como a Hoechst 33342. As células classificadas com thé método são identificados como um &quot;side population&quot; (SP). À medida que as células SP representa uma percentagem baixa (&lt;5%) de células parentais, uma fase de crescimento é necessária, a fim de aumentar o seu número, antes da segunda separação de células. O próximo passo permite a selecção de células que possuem outras duas características de células estaminais HNSCC ie alto nível do marcador da superfície celular CD44 (CD44 alto) e o-expressão através de aldeído desidrogenase (ALDH alta) expressão. Uma vez que a utilização de um único marcador tem numerosas limitações e armadilhas para o isolamento de CSCs, a combinação de SP, CD44 e marcadores ALDH fornecerá uma ferramenta útil para isolar CSCs para mais ensaios analíticos e funcionais que necessitam de células viáveis. As características estaminais semelhante de CSCs finalmente foi validado in vitro pela formação de tumorispheres e a expressão de β-catenina.

O isolamento de CSCs de linhas celulares CECP necessários dois triagem sucessiva por causa da percentagem muito baixa de CSCs na linha de células parental. A primeira classificação baseou-se na capacidade das CSCs de excluir o corante Hoechst devido a transportadores de efluxo de drogas. Isto resultou na aquisição de 1-5% da população total de células classificadas (Figura 1). Durante a separação de células negativa Hoechst corante, verifique o tamanho e granulação de cé...

Compreender o papel das células-tronco cancerígenas na recorrência tumoral e na resistência às terapias tornou-se um tópico de grande interesse na última década. Este artigo descreve o isolamento e a caracterização da subpopulação de células-tronco cancerígenas de linhagens celulares de carcinoma escamoso de cabeça e pescoço (CECP).

Isolamento e Caracterização de uma cabeça e pescoço carcinoma espinocelular subpopulação Tendo-tronco características celulares

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar células-tronco cancerígenas de carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço ou linhagens celulares de CCECP. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de tratamento do câncer sobre como utilizar a quimioterapia para superar a radiorresistência tumoral. A principal vantagem desta técnica é que ela utiliza uma combinação de marcadores para alcançar uma alta especificidade na identificação de células-tronco cancerígenas provenientes de linhagens celulares de CCECP.Quem demonstrará o procedimento será Prescillia Battiston-Montagne, nossa técnica, e Marion Gilormini, doutoranda do meu laboratório. Para selecionar uma população lateral de células semelhantes a células-tronco tumorais por meio do ensaio de efluxo do corante Hoechst, primeiramente rotule um tubo cônico como Hoechst e outro como Hoechst e Verapamil. Em seguida, lave uma cultura celular de CHC com PBS estéril, seguido pela adição de um mililitro de tripsina-EDTA.Após três minutos a 37 graus Celsius, interrompa a reação com meio de cultura celular fresco e conte as células. Dilua a cultura até uma vez 10 à sétima células por mililitro e complete com meio da linhagem celular parental. Em seguida, adicione 100 microlitros ao tubo de Hoechst e Verapamil e quatro mililitros de células ao tubo de Hoechst.Em seguida, misture suavemente 10 microlitros de solução de cloreto de verapamila cinco milimolar na amostra de Hoechst e verapamila, seguido por cinco microlitros de Hoechst por uma vez 10 à sexta células em ambos os tubos. Em seguida, cubra as amostras com papel alumínio e coloque-as a 37 graus Celsius. Após 90 minutos, com mistura suave a cada 15 minutos, centrifugue os tubos e re-suspenda os pellets em dois mililitros de PBS.Após uma centrifugação centrífuga, reconstitua o pellet de Hoechst e Verapamila em 500 microlitros de iodeto de propídio em PBS e o pellet de Hoechst em quatro mililitros do mesmo. Em seguida, filtre as amostras através de peneiras celulares de 70 microns em tubos FACS para remover quaisquer agregados e coloque as amostras em gelo protegidas da luz. A seguir, carregue a amostra de Hoechst no citômetro de fluxo e abra a janela da Planilha Global no software do citômetro de fluxo.Clique em Gráfico de Dispersão para criar um gráfico na Planilha Global e clique com o botão direito para selecionar os parâmetros de dispersão frontal e dispersão lateral. Crie um gráfico de dispersão lateral largura por dispersão lateral altura da mesma maneira e, em seguida, clique em seleção poligonal para criar uma região P1 no segundo gráfico, a fim de selecionar as células individuais e discriminar os dupletos. Em seguida, crie um gráfico de área vermelha do Hoechst por área azul do Hoechst e clique com o botão direito nas células para destacar a população P1.Em seguida, crie uma região P2 para selecionar a população lateral de células negativas para o corante Hoechst, que aparece como um braço lateral à esquerda da população principal de células, e colete 10.000 eventos da amostra com Hoechst. Para confirmar que o gate P2 que representa a população lateral está posicionado corretamente, colete também 10.000 eventos da amostra com Hoechst e Verapamil. A população lateral deve desaparecer.Em seguida, separe a população lateral de células negativas para o corante Hoechst em um tubo cônico de 15 mililitros contendo um mililitro de meio completo para células semelhantes a células-tronco cancerígenas. Ao final da separação, centrifugue as células e re-suspenda o pellet da população lateral em um mililitro de meio completo fresco para células semelhantes a células-tronco cancerígenas. Em seguida, conte as células e semeie-as em número apropriado em um novo frasco de cultura celular.Para selecionar o subconjunto CD44-alto/ALDH-alto a partir das células da população lateral classificadas, rotule primeiro sete tubos cônicos estéreis de 15 mililitros conforme indicado. Em seguida, dilua as células classificadas para uma concentração de um vezes 10 à sétima células por mililitro em meio para células-tronco e distribua alíquotas de 100 microlitros de células para os tubos CD44-APC sem corante e IGG1-APC, e quatro mililitros de células para o tubo ALDH e CD44-APC, todos mantidos no gelo. Centrifugue as células e reconstitua os pellets dos tubos CD44-APC sem corante e IGG1-APC em 100 microlitros do tampão um do kit ALDEFLUOR.Em seguida, adicione cinco microlitros do inibidor de ALDH DEAB aos tubos ALDH e DEAB e ALDH DEAB e CD44-APC. Resuspenda as células no tubo ALDH e CD44-APC em quatro mililitros do reagente C contendo quatro mililitros do tampão um e 20 microlitros do reagente do kit e transfira imediatamente 100 microlitros dessas células para os tubos ALDH, ALDH e DEAB e ALDH DEAB e CD44-APC. Em seguida, coloque todos os tubos em banho-maria a 37 graus Celsius por 30 minutos, protegidos da luz, agitando as amostras após 15 minutos por meio de vortexagem suave.No final da incubação, centrifugue todas as amostras e descarte os sobrenadantes. Em seguida, coloque todos os tubos no gelo e re-suspenda o pellet de ALDH e CD44-APC em quatro mililitros do tampão A, um pellet de CD44-APC e ALDH DEAB e pellets de CD44-APC em 100 microlitros do mesmo. Re-suspenda o pellet de IGG1-APC em 100 microlitros do tampão B e os tubos não corados de ALDH e ALDH e DEAB em 100 microlitros do tampão um.Após 10 minutos, centrifugue novamente todas as amostras, seguido por uma lavagem com 1 mililitro de tampão um para todas as amostras, exceto a amostra de ALDH e CD44-APC, que é lavada com 4 mililitros de tampão um. Após a segunda centrifugação, re-suspenda todos os pellets em 1 mililitro de tampão um fresco, exceto a amostra de ALDH e CD44-APC, que é re-suspensa em 4 mililitros de tampão um. Agora, carregue o tubo de ALDH e CD44-APC no citômetro de fluxo e crie um gráfico de dispersão APC por fitsy para visualizar a população duplamente marcada.Em seguida, carregue o tubo ALDH para criar um gate para células com alto teor de ALDH. As células positivas devem desaparecer ao carregar o tubo ALDH e DEAB. No mesmo gráfico, crie um segundo gate utilizando os tubos CD44-APC e IGG1-APC para selecionar as células com alto teor de CD44.As células positivas desaparecerão quando o tubo IGG1-APC for carregado. Em seguida, carregue os tubos ALDH e CD44-APC e ALDH DEAB e CD44-APC para criar uma terceira porta que inclua as células CD44-alta/ALDH-alta. Utilize o tubo de dupla marcação ALDH-CD44 para posicionar a última porta sobre as células duplo-positivas.Em seguida, separe as células CD44-alta/ALDH-alta em um tubo cônico de 15 mililitros contendo um mililitro de meio completo para células semelhantes a células-tronco tumorais, coletando as células CD44-baixa/ALDH-baixa em um mililitro de meio completo de cultura celular conforme desejado. Após a segunda separação, plaque as células CD44-alta/ALDH-alta em um frasco de cultura celular apropriado com meio completo para células semelhantes a células-tronco tumorais no incubador de cultura celular por 18 a 24 horas. Quando as células tiverem aderido ao fundo do frasco, troque o meio de cultura e devolva o frasco ao incubador.Para confirmar o potencial tumoral das células CD44-alta/ALDH-alta, faça a tripsinização da monocamada de células semelhantes a células-tronco cancerígenas conforme demonstrado para obter uma suspensão unicelular e transfira um vezes 10 à sexta potência de células para um tubo cônico de 15 mililitros. Após centrifugar as células, ressuspender o pellet em meio com baixo teor de soro suplementado com fator de crescimento epidérmico humano recombinante, heparina e B27 e incubar as células em uma placa de Petri com baixa aderência na incubadora de cultura celular até que esferoides tumorais sejam observados por microscopia óptica. Quando a separação for realizada pela primeira vez em uma nova linhagem celular, é necessário confirmar o potencial tumoral da linhagem celular, evidenciado por sua capacidade de formar esferoides tumorais em meio livre de soro in vitro.Além disso, a PCR em tempo real (QPCR) deve demonstrar uma alta expressão de beta-catenina e de outros marcadores de células semelhantes a células-tronco nas células CD44-alta/ALDH-alta. As células CD44-alta/ALDH-alta também devem ser capazes de formar tumores in situ quando injetadas em quantidades reduzidas, em comparação com células CD44-baixa/ALDH-baixa. Uma vez dominada, cada separação celular deve poder ser concluída em cinco horas, se realizada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de proteger as amostras marcadas com fluorocromo da exposição direta à luz. Após este procedimento, outros métodos, como ensaios de invasão e migração, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre o envolvimento das células-tronco cancerígenas no processo metastático. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de oncologia explorassem os mecanismos de escape tumoral no câncer de Cabeça e Pescoço (HNSCC).Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células-tronco cancerígenas de linhagens celulares de CHCSC utilizando análise multiparamétrica por citometria de fluxo e separação celular. Não se esqueça de que trabalhar com células tumorais e agentes intercalantes de DNA pode ser extremamente perigoso e que precauções, como o uso de jaleco e luvas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

isolation-characterization-head-neck-squamous-cell-carcinoma

Research

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Os ensaios de esferas in vitro são comumente usados para identificar células-tronco cancerígenas. Aqui, comparamos ensaios de esferas únicas com multicélulas. Os ensaios baseados em células únicas mais trabalhosos ou a suplementação de metilcelulose fornecem resultados mais precisos, enquanto os ensaios baseados em várias células realizados em meio líquido podem ser altamente influenciados pela densidade celular.

Avaliação das Propriedades Stem Cell em carcinomas de células do ovário humano utilizar multi e individuais baseados em células Esferas Ensaios

As células-tronco do câncer de pâncreas (CSCs) podem ser expandidas in vitro usando a técnica de cultura de esfera independente de ancoragem, que representa uma ferramenta poderosa para estudar a biologia do CSC e pode servir como o primeiro passo para desenvolver novas terapias direcionadas ao CSC. Aqui é fornecida a metodologia para expansão, análise e direcionamento de CSCs pancreáticas.

Estudar o cancro do pâncreas Stem características celulares para desenvolver estratégias Novo tratamento

A presença de células-tronco cancerosas (CSCs) em sarcomas ósseos foi recentemente ligada à sua patogênese. Neste artigo, apresentamos o isolamento de CSCs de culturas de células primárias obtidas a partir de biópsias humanas de osteossarcoma convencional (OS) que utilizam a capacidade dos CSCs a crescer sob condições não aderentes.

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures de Human osteossarcoma convencional

Nós descrevemos um protocolo detalhado para a isolação de pilhas tumor-iniciando dos xenoenxertos paciente-derivados do sarcoma humano pela seleção fluorescência-ativada da pilha, usando o antígeno-1 humano da leucócito (HLA-1) como um marcador negativo, e para a validação mais adicional e caracterização destas pilhas tumor-iniciando HLA-1-Negative.

Isolamento e caracterização de células iniciantes tumorais de sarcoma de xenoenxertos derivados do paciente

Aqui nós apresentamos um método reprodutível para desenvolver um modelo murino ortotópico de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas. Tumores demonstram clinicamente relevantes características histopatológicas da doença, incluindo necrose, pobre diferenciação, metástases nodais e infiltração imune. Tumor-rolamento ratos desenvolvem sintomas clinicamente relevantes, incluindo disfagia, deslocamento da mandíbula e perda de peso.

Intramucosal inoculação de células de Carcinoma de células escamosas em ratos para perfil imune de Tumor e tratamento avaliação de resposta

Usando células epitelia de próstata primárias humanas, relatamos um novo método livre de biomarcadores de caracterização funcional de células semelhantes a troncos por um ensaio de retenção de rótulos à base de esferóides. Um protocolo passo a passo é descrito para a rotulagem de células BrdU, CFSE ou Far Red 2D; formação tridimensional de esferóides; identificação de células-tronco de retenção de rótulos por imunocitoquímica; e isolamento pela FACS.

Isolamento de células-tronco a partir de culturas esferóides tridimensionais

Este protocolo experimental descreve o isolamento de CBSCs de amostras de células e tecidos de câncer de mama, bem como os ensaios in vitro e in vivo que podem ser usados para avaliar o fenótipo e a função do CBSC.

Isolamento e Avaliação Funcional de Células-Tronco de Câncer de Mama Humano de Amostras de Células e Tecidos

Aprenda a isolar células-tronco cancerígenas de linhagens de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço usando citometria de fluxo multiparamétrica. Este método permite estudar resistência terapêutica e recorrência tumoral.

Isolamento e Caracterização de uma cabeça e pescoço carcinoma espinocelular subpopulação Tendo-tronco características celulares

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