Glicanos Análise Node: uma abordagem de baixo para cima para Glycomics

O objetivo geral deste procedimento é quebrar todos os glicanos em uma amostra biológica, conservando a composição do monossacarídeo e as informações de ligação. Facilitando a destilação de características interessantes do glicano, como cialação doente e bissetriz de N-acetilglucosamina em sinais analíticos únicos. Este método pode ajudar a responder diretamente a questões-chave no campo dos glicêmitos, como quais características únicas do glicano são alteradas em determinados estados de doença.

A principal vantagem dessa técnica é que as características dos glicanos que tendem a ser alteradas na doença, como ramificação beta 1-6 e corfulcossulação, são destiladas em sinais analíticos únicos, em vez de serem espalhadas por vários glicanos intactos. Geralmente, as pessoas que precisam fazer esse método realmente lutam com problemas de N-acetilcisteínas devido ao processamento inadequado de glicanos recém-permetilados. Prepare as amostras, transferindo primeiro nove microlitros de cada analito biológico para tubos de ensaio separados de 1,5 mililitro.

A cada amostra, adicione um microlitro de água deionizada e 270 microlitros de alta pureza de DMSO. E misture vigorosamente por vórtice. Após a preparação da amostra, monte as colunas de rotação carregadas com hidróxido de sódio conforme descrito no protocolo de texto.

Usando uma seringa analítica, adicione 105 microlitros de iodometano a cada analito e tampe imediatamente os tubos. Vortex completamente as amostras. Desconecte as colunas de centrifugação preparadas anteriormente e centrifugue-as por 15 segundos a 2.400 Gs. Depois de descartar os tubos do reservatório e afluentes, conecte novamente as colunas e coloque-as dentro de um novo conjunto de tubos, rotulados para cada analito.

Use uma cabeça de tubo de 1000 microlitros para transferir cada solução de analito para a coluna de rotação correspondente. Depois que a solução analita for adicionada, aperte cerca de dois mililitros da extremidade de uma ponta de cabeça de tubo de 200 microlitros e deixe a ponta na coluna para usar como agitador. Use as pontas da cabeça do tubo para mexer suavemente as colunas uma vez a cada dois a três minutos.

Após 11 minutos, desligue as colunas e centrifugue-as durante 15 segundos a 2.400 Gs.Retire imediatamente as colunas de centrifugação e coloque-as em novos tubos reservatórios, poupando a solução de escoamento, mas descartando os tampões. Às colunas, adicione 300 microlitros de acetononitrila e centrifugue-os por 30 segundos a 9.600 Gs.Agora transfira as primeiras soluções de fluxo permetilado para tubos de ensaio de vidro silanizados contendo 3,5 mililitros de tampão fosfato de sódio. Certifique-se de que o supernaned transferido esteja desobstruído e que nenhum material sólido seja transferido.

Uma pequena pelota branca terá se formado no fundo dos tubos de plástico. Evite transferir qualquer material sólido óbvio. Não fazer isso resultará em baixos rendimentos de notas de glicano de N-acetilcisteína-glucosamina.

Imediatamente vórtice cada amostra no lote uma vez que todas as amostras tenham sido transferidas. Em seguida, combine as soluções de fluxo de acetonenitrila com o resto do líquido nos respectivos tubos de ensaio. Novamente, evite transferir qualquer resíduo sólido e branco durante esta etapa.

Tampar, agitar e vortex as soluções combinadas imediatamente antes de passar para a próxima amostra. Após a permetilação, adicione 1,2 mililitros de clorofórmio a cada tubo de ensaio dentro de uma hotte. Em seguida, tampe os tubos e misture o conteúdo vigorosamente.

Para separar as camadas, centrifugue brevemente as soluções a 3.000 Gs.Use uma cabeça de tubo de pastagem para extrair e descartar a maior parte da camada aquosa superior, deixando cerca de três mililitros da camada para trás. Adicione 3,5 mililitros do tampão fosfato de sódio 0,2 molar e, em seguida, tampe, misture e centrifugue o tubo de ensaio. Execute esta etapa de extração de líquido/líquido um total de três vezes.

Deixando cerca de um mililitro da camada aquosa na extração final. Agora use uma cabeça de tubo de pastagem silanizada limpa para transferir cuidadosamente a camada de clorofórmio para um tubo de ensaio de vidro silanizado limpo e rotulado, conforme descrito no protocolo de texto. Em um coletor de evaporação pré-aquecido, ajustado para 75 graus Celsius, seque as amostras sob um fluxo suave de gás nitrogênio.

Certifique-se de que o fluxo de gás perturbe a superfície do líquido, mas sem respingá-lo. Uma vez que as amostras estejam secas, elas estão prontas para hidrólise. Adicione 325 microlitros de ácido trifluoroacético 2 molar ou TFA a cada amostra e misture bem.

Tampe bem cada sample tubo imediatamente após a adição a todas as amostras para evitar a evaporação do TFA e a perda de amostra durante a etapa de aquecimento subsequente. Incube as amostras a 121 graus Celsius por duas horas para hidrolizar os glicanos. Enquanto as amostras estão incubando, prepare novamente o coletor de evaporação a 75 graus Celsius.

Após a incubação, secar as amostras sob uma corrente constante de azoto no colector de evaporação. Verifique frequentemente as amostras para garantir que estejam secas usando o mínimo de tempo de secagem possível. A cada amostra, adicione 475 microlitros de 10 gramas por litro de borohidreto de sódio.

E, em seguida, misture bem as amostras para dissolver qualquer resíduo. Tampe os tubos de ensaio e deixe a reação de redução continuar por uma hora. Em seguida, adicione 63 microlitros de metanol a cada amostra.

Misture e seque as amostras a 75 graus Celsius sob nitrogênio. Adicione 125 microlitros de metanol à solução de ácido acético a cada amostra. Misture e seque novamente as amostras a 75 graus Celsius sob nitrogênio.

Certifique-se de que as amostras estejam completamente secas, colocando-as sob vácuo por 20 minutos. Após a secagem, adicione 18 microlitros de água deionizada a cada amostra. Em seguida, centrifugue as amostras brevemente e misture-as bem para dissolver um precipitado.

Em seguida, adicione 250 microlitros de anidrido acético a cada tubo. Tampe os tubos, vortex completo e sonice as amostras em banho-maria por dois minutos para garantir a dissolução completa de qualquer resíduo. Em seguida, incube as amostras a 50 graus Celsius por 10 minutos.

Agora adicione 230 microlitros de TFA concentrado a cada amostra. Depois de tampar e misturar as amostras, incube-as por 10 minutos a uma temperatura interna de 50 graus Celsius. Adicione 1,8 mililitros de diclorometano a cada amostra e misture bem.

Em seguida, adicione dois mililitros de água dionizada ao tubo e faça a extração líquido/líquido duas vezes. Recupere a camada de diclorometano com uma cabeça de tubo de pastagem silanizada. Transferir para um frasco para injetáveis com amostrador automático e, em seguida, secar a amostra com azoto a 74 graus Celsius.

Antes do GC-MS, reconstitua as amostras cada uma com 120 microlitros de acetona, tampando-as e misturando-as completamente. No modo dividido, use um amostrador automático para injetar um microlitro de cada amostra no revestimento de modo dividido GC. Para espectrômetros de massa de tempo de voo, recomenda-se uma proporção dividida de quarenta e gás hélio em modo de fluxo constante a 0,8 mililitros por minuto.

Analise a amostra usando um gradiente de duas etapas que atinge 325 graus Celsius. Sujeite os componentes da amostra à ionização de elétrons. Para um analisador de massa de tempo de voo, analise os fragmentos M sobre Z 40 a 800 com uma taxa de soma de pulso de 0,1 segundo.

Para demonstrar a sensibilidade deste protocolo, uma amostra biológica foi processada cuidadosamente. O cromatograma resultante fornece intensidade adequada entre os picos de produto desejados para facilitar a comparação e a análise. A mesma amostra biológica inicial foi então processada com o mesmo procedimento.

Mas o resíduo branco na solução de permetilação que foi girado através da coluna de NAOH foi transportado para a mistura subsequente para extração líquida / líquida. O cromatograma fornece uma proporção diferente de intensidade de pico dos mesmos produtos da amostra-chave. Quando comparado diretamente, a diferença é gritante.

A depressão clara do pico de N-acetilglucosamina ligado a 4 posições no segundo cromatograma é uma característica reconhecível de uma permetilação e extração malsucedidas. Para apreciar a utilidade dessa abordagem para detectar diferenças na composição do glicano em estados de doença, os cromatogramas de íons extraídos de uma amostra de plasma sanguíneo normal e de uma amostra de plasma sanguíneo de paciente com câncer são normalizados para manos de 2 ligações e sobrepostos. Diferenças quantitativas nas características únicas do glicano, como ramificação beta 1-6, bem como ciaalização doente, são prontamente aparentes.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a análise do nó glicano glicômico de baixo para cima. Facilitando a destilação de características interessantes do glicano, como corfulcossulação, ciaalação doente e bissetriz glicanita em sinais analíticos únicos.