Name: Glicanos Análise Node: uma abordagem de baixo para cima para Glycomics (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Aprenda uma técnica de glicômica bottom-up para analisar glicanos em biofluidos por GC-MS, identificando alterações em doenças como câncer. Este método destila características glicânicas em sinais analíticos únicos.

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Este trabalho foi apoiado pela Faculdade de Artes e Ciências Liberais da Arizona State University na forma de fundos iniciais de laboratório para o CRB. Também foi apoiado por uma doação da Fundação Flinn (Concessão nº 1977) e pelo Instituto Nacional do Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número R33CA191110. JA foi apoiado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais do Programa de Educação em Pesquisa Pós-Bacharelado dos Institutos Nacionais de Saúde (PREP) sob o número de prêmio R25GM071798. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

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Os autores não têm nada a divulgar.

Em geral, a produção bem sucedida de alditol acetatos parcialmente metilados (PMAAs) a partir de hexoses é cheio com menos dificuldades e é mais robusta do que a produção bem sucedida de N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. O mecanismo exato por trás desse fenômeno, uma vez que se desenrola em cada passo deste processo é desconhecida, mas devem estar relacionados com a química única do grupo acetil N (em vez de grupo hidroxila) que é exclusivo para HexNAc relação ao hexoses. O mecanismo subjacente a est...

Os glicolípidos, glicoproteínas, proteoglicanos e glicosaminoglicanos constituem as quatro classes principais de hidratos de carbono complexos, heterogéneos colectivamente conhecidas como glicanos. Como componentes omnipresentes e integral da membrana do plasma, glicocálice, e a matriz extracelular e fluidos, glicanos participar em tais processos bioquímicos diversos como a endocitose, o tráfico intracelular, motilidade celular, a transdução de sinal, reconhecimento molecular, a activação do receptor, a adesão celular, a interacção hospedeiro-patogénio , intercelular comunicação, vigilância imunológica, e iniciação resposta imune. 1 Presente em quase todos os domínios da vida, enzimas conhecidas como glicosiltransferases que constroem polímeros glicano agir em conjunto com glicosídeo hidrolases (também conhecido como glicosidases, que quebram glicanos) para a construção, remodelação, e finalmente produzir polímeros finalizado glicano 2. Embora cada glicosiltransferase pode operar em diferentes glicoconjugados, uma glicosiltransferasegeralmente forja uma ligação glicosídica e linkage--anómero específico através da transferência do radical monossacárido de um determinado nucleótido activado dador de açúcar (por exemplo, GDP-fucose) a uma certa categoria de aceitadores nucleofílicos (por exemplo, um lípido, polipéptido, ácido nucleico, ou o cultivo oligossacárido). Estima-se que mais de 50% de proteínas (especialmente de membrana e proteínas secretoras) são pós-tradução modificada por glicosilação 3 cálculos combinatórios rudimentares fornecer uma apreciação para a variabilidade considerável, versatilidade e especificidade reconhecida às glicoproteínas de glicosilação.; Por exemplo, se um substrato de polipéptido tem apenas 10 locais de glicosilação e de cada local pode formar uma ligação glicosídica com uma das extremidades redutoras apenas 3 de monossacárido diferentes, então, teoricamente, a glicoproteína final pode assumir 3 10 = 59049 identidades distintas. Em glicoproteínas, ligações glicosídicas geralmente formar com a cadeia lateral de azoto óf resíduos de asparagina na sequência Asn-X-Ser / Thr (X pode ser qualquer aminoácido excepto prolina) para se obter N-glicanos e 2-hidroxilos de cadeia lateral de resíduos de serina e treonina para se obter ó-glicanos 4. A composição da glycome de uma célula (ou seja, o seu complemento de produtos de glicosilação) é único e limitado, porque, com poucas exceções, glicosiltransferases exibem doador estrito, receptor, e especificidade de ligação. 5 glicoproteínas importante e abundante no plasma sanguíneo sofre glicosilação aberrante como consequência a jusante de expressão glycosyltransferase anormal e atividade devido a muitas condições patológicas, especialmente câncer e doenças inflamatórias 6-24. Principalmente devido a factores epigenética, o glycome é significativamente mais diverso, dinâmico e complexo do que o proteoma e transcriptoma 25,26. Enquanto cerca de 1% do genoma de mamífero codifica a formação, modificação, emontagem de glicanos, 27 de glicosilação procede de uma forma um contraste marcante-não-modelo orientado para polipéptido e biossíntese do ácido nucleico. A interação entre a quantidade relativa e atividade de enzimas de glicosilação e tais fatores ambientais como a disponibilidade de nutrientes e precursor em última instância, determina a natureza, taxa e extensão da glicosilação. 5,28 embriogênese (por exemplo, determinação e diferenciação), ativação celular e progressão através a expressão do gene influência do ciclo celular (isto é, transcrição e tradução) e alterar a identidade e quantidade de glicosiltransferases disponíveis, cuja actividade é o determinante a montante imediata do perfil de glicano da célula. Porque (algumas das) a proliferativa, adesivo e propriedades invasivas das células cancerosas se assemelham aos de células embrionárias normais, alterações específicas em vias biossintéticas glicano (por exemplo, a acumulação de precursor, expressão desregulada, aberranmodificação t, truncamento estrutural, ou formação de romance) servem biomarcadores de câncer como universais que indicam várias etapas da formação do tumor, progressão, migração e invasão de 29 Apesar de glicosilação é altamente complexo, é evidente que só algumas alterações na glicosilação pode habilitar carcinogênese e metástase.; Aparentemente, certos &quot;aberrantes&quot; produtos de glicosilação, de facto beneficiar células cancerosas, permitindo-lhes escapar reconhecimento imunológico e sobreviver às demandas de migração em ambientes intravascular e metastáticos inóspitas. 28,30,31 Não surpreendentemente, os experimentos revelaram que interromper ou prevenir padrões de alteração a expressão do gene e a formação de glicano aberrante pode interromper a tumorigénese. 29 no entanto, os glicanos aberrantes detectados numa amostra biofluid (por exemplo, urina, saliva, e o plasma sanguíneo ou no soro) pode não ser indicadores directos de cancro (ou outra doença), mas sim a jusante resultados de sutil, mas significativaalterações no sistema imunitário ou ramificações quantificáveis ​​de uma condição perniciosa num órgão imprevisível. 32 Embora eles fornecem informações universal sobre a glycome, muitas técnicas Glycomics baseada em interação molecular (por exemplo, a lectina / matrizes de anticorpos e metabólica / rotulagem covalente) dependem da detecção de estruturas de glicano inteiros e não fornecem informações estruturais detalhadas sobre glicanos individuais. Em contraste acentuado, de espectrometria de massa (MS) pode ajudar a identificar e quantificar as estruturas de glicano individuais e revelar a informação estrutural como os sítios de ligação para núcleos de polipéptido. expressão ou actividade de uma única glicosiltransferase desregulada pode iniciar uma cascata de eventos moleculares prejudiciais em múltiplas vias de glicosilação. Porque cada glicosiltransferase pode operar em mais de um substrato glicoconjugada e em diferentes polímeros glicano crescimento, cascatas biossintéticas desregulados deu disproporcionalmente aumento da quantidade de apenas um produto glicano mas várias classes heterogêneas de glicanos aberrantes em fluidos intra ou extracelulares. 33 No entanto, tais glicanos aberrantes originais são por vezes considerada impraticável como biomarcadores para o câncer ou outras patologias glicano-afetiva, porque, em comparação com o grande piscina de glicanos bem regulamentado, estes glicanos aberrantes representam uma fração muito pequena que pode muitas vezes permanecem indetectáveis ​​mesmo por técnicas tais altamente sensíveis como espectrometria de massa. Por exemplo, em fluidos corporais intra- e extracelulares, o amplo espectro de proteína de concentração (que abrange as oito ordens de grandeza) pode impedir a detecção de glicoproteínas escassos que são mascarados por as espécies mais abundantes. 32 Além disso, a determinação da actividade de glicosiltransferase continua a ser uma prática considerável e desafio teórico, porque muitas glicosiltransferases estão ausentes em fluidos biológicos clínicos ou se tornam inativos ex vivo. Apesar da dificuldade de consistenTLY detectar e quantificar quantidades ultra-pequenas de glicanos todo único, os praticantes de espectrometria de massa têm feito enormes progressos em direção a empregar glicanos intactas como marcadores clínicos. Desenvolvemos recentemente uma abordagem complementar à análise de glicanos intactos que, empregando GC-MS, facilita a detecção de todas as filiais-ponto constituinte e monossacarídeos específicos de ligação ( &quot;nós glicano&quot;) que em conjunto conferem especificidade para cada glicano e em muitos casos servem directamente substitutos como moleculares que quantificam a atividade relativa do glycosyltransferase culpado (s). Desde a sua primeira aplicação directa relatado para análise de glicano, em 1958, a cromatografia gasosa (GC) provou ser uma técnica poderosa para analisar per-metilada mono- e dissacáridos, 34 determinar a sua anomericity e a configuração absoluta, e separá-los por análise de espectrometria de massa subsequente. 35 entre 1984 e 2007, Ciucanu e colegasintroduzida e refinado uma técnica permetilação glicano à fase sólida que empregue o hidróxido de sódio e de iodometano, seguido por extracção líquido / líquido de glicanos permetilado utilizando água e clorofórmio. 35,36 Entre 2005 e 2008, Kang e co-trabalhadores integrado um spin-horário abordagem -column na etapa permetilação. 37,38 Em 2008, o grupo de pesquisa Goetz concebeu uma fase sólida quantitativa permetilação método glicano-profiling usando laser assistida por matriz dessorção de ionização (MALDI) espectrometria de massa para comparar e, eventualmente, caracterizar invasiva e não cancro da mama células -invasive; 39 em seguida, em 2009, a equipe Goetz combinada enzimática e técnicas de liberação químicos para clivar o glicanos de glicoproteínas intactas em um esquema de permetilação em fase sólida altamente alcalina 40 Embora o procedimento Goetz facilitado permetilação simultânea e liberação química. de glicanos S, foi aplicada apenas a glico pré-isoladoproteínas. Nós modificamos essa técnica em 2013 e adaptou-o para fluidos biológicos não fraccionadas inteiros e amostras de tecidos homogeneizados através da incorporação de ácido trifluoroacético (TFA) a hidrólise, redução e acetilação etapas. 33 Estes passos adicionais também liberam glicanos de glycolipids e N -ligada glicanos de glicoproteínas e convertê -los em acetatos parcialmente metilados alditol (PMAAs, Figura 1), cujos padrões de metilação-e-acetilação distintivo facilitar a análise por GC-MS e exclusivamente caracterizar os nós de glicano constituintes no polímero glicano intacta inicial 41 (Figura 2). 33 por fim, esta procedimento produz um retrato compósito de todos os glicanos de uma biofluid complexo baseado em quantificação directa, relativa de glicano características únicas, tais como &quot;fucosilação núcleo&quot;, &quot;6-sialilação&quot;, &quot;GlcNAc bissector&quot;, e &quot;beta 1-6 ramificação&quot; - cada um derivado a partir de um único chromatograp CG-eMpico hic. Este artigo apresenta uma maior optimização do permetilação, acetilação, isolamento, e fases de limpeza, juntamente com a melhoria do modo de quantificação relativa.

<table><tbody><tr><td>Contas de hidróxido de sódio&nbsp;</td><td>367176</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>malha 20-40, grau de reagente 97%</td></tr><tr><td>0.9 ml Coluna de rotação</td><td>69705</td><td>Divisão de perfuração da ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Inclui&nbsp; plugs e fritas de polietileno&nbsp;</td></tr><tr><td>Frasco de amostrador automático GC-MS (silanizado)*</td><td>C4000-9</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Target DP Frasco de Alta Recuperação, 1.5&nbsp; ml, 12&nbsp; mm x 32&nbsp; mm, inclui tampas perfuráveis revestidas de Teflon Tubos</td></tr> de <tr><td>ensaio de polipropileno de 1,5 ml</td><td>05-402-25</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Tampa de encaixe</td></tr><tr><td>Tubos de ensaio de polipropileno de 2 ml</td><td>05-408-138</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Tampa de encaixe</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>D8418</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>BioReagent para biologia molecular, grau de reagente >99,0%</td></tr><tr><td>Iodometano&nbsp;</td><td>I8507</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Contém cobre como estabilizador, ReagentPlus 99%</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>A955-4</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Optima LC/MS</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>75002436: Centrífuga Sorvall Legend Micro 17</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Rotor 24 x 1,5/2,0 com tampa de biocontenção ClickSeal. Número de catálogo do rotor: 75003424</td></tr><tr><td>Tubo de ensaio de vidro 13 x 100 (silanizado)*</td><td>53283-800</td><td>VWR</td><td>Tubos de ensaio de vidro borossilicato de 13 mm x 100 mm com acabamento em tampa de rosca</td></tr><tr><td>Tampas para tubos de ensaio de vidro</td><td>14-930-15D</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Kimble&trade; Tampas de Rosca Fenólica Preta; 13&nbsp; rosca mm-415 GPI; Revestimento de borracha com face de PTFE.</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio&nbsp;</td><td>S7653</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>>99,5% puro</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>4440-08</td><td>Macron Fine Chemicals&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>299537</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>99% purificado por redestilação para sequenciamento de proteínas&nbsp;</td></tr><tr><td>Borohidreto de sódio</td><td>71321</td><td>Fluka Analytical&nbsp;</td><td>99% de sucesso</td></tr><tr><td>Solução de hidróxido de amônio</td><td>320145</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Conteúdo de NH3: 28,0-30,0%</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>AH230-4</td><td>Honeywell Burdick & Ácido</td> acético <td>de grau HPLC</td>Jackson</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>320099</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>99,70%</td></tr><tr><td>Dessecador a vácuo de plástico&nbsp;</td><td>Qualquer modelo de tamanho adequado</td><td>FoodSaver</td><td></td></tr><tr><td>Anidrido acético&nbsp;</td><td>539996</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>99.50%</td></tr><tr><td>Diclorometano&nbsp;</td><td>D143SK-4</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Grau de HPLC estabilizado</td></tr><tr><td>Acetona&nbsp;</td><td>9006-03</td><td>J.T.Baker</td><td>Baker analisado&nbsp;</td></tr><tr><td>Coletor de evaporação aquecido (unidade principal)</td><td>pi18823</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Módulo de aquecimento e agitação Thermo Scientific* Reacti-Therm*; Modelo de bloco triplo com função de aquecimento e agitação</td></tr><tr><td>Coletor de evaporação aquecido (evaporador suspenso)</td> <td>pi18826</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Evaporador ThermoScientific* Reacti-Vap, 27 portas; Para uso com módulo de aquecimento Reacti-Therm de bloco triplo</td></tr><tr><td>Blocos porta-amostras de alumínio para coletor de evaporação</td><td>pi18816</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Bloco, Alumínio, Reacti-Block S-1, Suporta 13&nbsp; mm de diâmetro, 13 furos (14&nbsp; mm de diâmetro x 45&nbsp; mm de profundidade)</td></tr><tr><td>Cromatógrafo gasoso</td><td>Modelo A7890</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>Equipado com amostrador automático CTC PAL</td></tr><tr><td>Espectrômetro de massa&nbsp;</td><td>GCT Premier (Tempo de Voo)</td> <td>Águas&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Liner de modo dividido (desativado / silanizado)</td><td>5183-4647</td><td>Agilent</td><td>Contendo um pequeno plugue de lã de vidro silanizada</td></tr><tr><td>DB-5ms Coluna GC</td><td>122-5532</td><td>Agilent</td><td>30 m x 0.25 mm ID x 0.25 mícron de espessura de filme</td></tr><tr><td>Clorotrimetilsilano</td><td>95541</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dessecador a vácuo de vidro (para silanização de vidraria)</td><td>EW-06536-30</td><td>Cole-Parmer</td><td>12" de largura; tamanho</td></tr><tr> da placa de 230 mm<td colspan="4">*A silanização de vidraria é realizada internamente, durante a noite, usando vapor de clorotrimetilsilano em um grande dessecador a vácuo de vidro.</td></tr></tbody></table>

glicanos análise node: uma abordagem de baixo para cima para glycomics

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

Sintetizados em um processo não orientado por modelos por enzimas chamadas glicosiltransferases, os glicanos são atores-chave em vários eventos intra e extracelulares significativos. Muitas condições patológicas, notadamente o câncer, afetam a expressão gênica, que pode, por sua vez, desregular a abundância relativa e os níveis de atividade das enzimas glicosídeo hidrolase e glicosiltransferase. Glicanos inteiros aberrantes únicos resultantes de glicosiltransferase (s) desregulada (s) estão frequentemente presentes em pequenas quantidades dentro de biofluidos complexos, tornando sua detecção difícil e às vezes estocástica. No entanto, com a preparação adequada da amostra, uma das formas mais antigas de espectrometria de massa (cromatografia gasosa-espectrometria de massa, GC-MS) pode detectar rotineiramente a coleta de monossacarídeos específicos de ponto de ramificação e ligação ("nós glicanos") presentes em biofluidos complexos. Complementar às técnicas tradicionais de glicômica de cima para baixo, a abordagem discutida aqui envolve a coleta e condensação de cada nó de glicano constituinte em uma amostra em um único sinal analítico independente, que fornece informações estruturais e quantitativas detalhadas sobre mudanças no glicoma como um todo e revela glicosiltransferases potencialmente desreguladas. As melhorias na permetilação e nos estágios subsequentes de extração líquida/líquida aqui fornecidas aumentam a reprodutibilidade e o rendimento geral, facilitando a exposição mínima de glicanos permetilados a condições aquosas alcalinas. Modificações no estágio de acetilação aumentam ainda mais a extensão da reação e o rendimento geral. Apesar de sua reprodutibilidade, os rendimentos gerais de acetatos de alditol parcialmente permetilados (PMAAs) de N-acetillhexosamina (HexNAc) mostram-se inerentemente mais baixos do que seu valor teórico esperado em relação aos PMAAs de hexose. O cálculo da razão entre a área sob o cromatograma de íons extraídos (XIC) para cada PMAA de hexose individual (ou PMAA de HexNAc) e a soma dessas áreas de XIC para todas as hexoses (ou HexNAcs) fornece um novo método de normalização que facilita a quantificação relativa de nós de glicano individuais em uma amostra. Embora atualmente limitado em termos de seus limites absolutos de detecção, este método agiliza a análise de biofluidos clínicos e mostra uma promessa considerável como uma abordagem complementar à glicômica tradicional de cima para baixo.

Um cromatograma iónico total de corrente (TIC) que mostra permetilação bem sucedida, hidrólise, redução, e acetilação das amostras de plasma de sangue humano relativamente aos casos em que dois passos críticos permetilação foram incorrectamente executadas são mostrados na Figura 3. Rendimento absoluto do HexNAc Relativo ao Hexoses: N</e...

Este artigo apresenta uma forma aprimorada de uma nova técnica de glicômica de baixo para cima projetada para analisar o perfil de composição agrupado de glicanos em biofluidos não fracionados por meio da decomposição química de glicanos em seus monossacarídeos específicos de ligação constituinte para detecção por GC-MS. As aplicações potenciais incluem a detecção precoce de câncer e outros distúrbios afetivos glicanos.

Glicanos Análise Node: uma abordagem de baixo para cima para Glycomics

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and ...

O objetivo geral deste procedimento é degradar todos os glicanos em uma amostra biológica, conservando ao mesmo tempo a composição de monossacarídeos e as informações sobre as ligações. Isso facilita a identificação de características interessantes dos glicanos, como a sialilação do ácido siálico e a N-acetilglicosamina bifurcada, em sinais analíticos individuais. Este método pode ajudar a responder diretamente perguntas fundamentais na área dos glicômicos, como quais características únicas dos glicanos são alteradas em estados patológicos específicos.A principal vantagem dessa técnica é que características de glicanos que tendem a ser alteradas em doenças, como ramificação beta 1-6 e core fucosilação, são condensadas em sinais analíticos únicos, em vez de se distribuírem por múltiplos glicanos intactos. Geralmente, as pessoas que precisam realizar este método enfrentam dificuldades com baixos rendimentos de N-acetilcisteínas devido ao processamento inadequado de glicanos recém-permetilados. Prepare as amostras transferindo primeiramente nove microlitros de cada analito biológico para tubos de ensaio separados de 1,5 mililitro.A cada amostra, adicione um microlitro de água desionizada e 270 microlitros de DMSO de alta pureza. Em seguida, misture vigorosamente por vortexagem. Após o preparo das amostras, monte as colunas de centrifugação carregadas com hidróxido de sódio conforme descrito no protocolo textual.Usando uma seringa analítica, adicione 105 microlitros de iodometano a cada analito e tampe imediatamente os tubos. Vortexe as amostras completamente. Desconecte as colunas de centrifugação previamente preparadas e centrifugue-as por 15 segundos a 2.400 Gs. Após descartar os tubos coletores e o efluente, reconecte as colunas e coloque-as dentro de um novo conjunto de tubos, rotulados para cada analito.Utilize uma pipeta de 1000 microlitros para transferir cada solução de analito para a coluna de centrifugação correspondente. Após a adição da solução de analito, amasse cerca de dois mililitros a partir da extremidade de uma ponteira de pipeta de 200 microlitros e deixe a ponteira na coluna para utilizá-la como agitador. Use as ponteiras de pipeta para agitar suavemente as colunas a cada dois a três minutos.Após 11 minutos, desconecte as colunas e centrifugue-as por 15 segundos a 2.400 Gs. Remova imediatamente as colunas de centrifugação e coloque-as em novos tubos coletores, guardando a solução do fluxo passante, mas descartando as tampas. Às colunas, adicione 300 microlitros de acetonitrila e centrifugue por 30 segundos a 9.600 Gs. Agora transfira as primeiras soluções do fluxo passante permethyladas para tubos de ensaio de vidro silanizados contendo 3,5 mililitros de tampão de fosfato de sódio. Certifique-se de que o sobrenadante transferido esteja claro e de que nenhum material sólido seja transferido.Um pequeno pellet branco terá se formado no fundo dos tubos plásticos. Evite transferir qualquer material sólido aparente. A falha em fazê-lo resultará em baixos rendimentos de notas de glicano N-acetilcisteína-glucosamina.Vortex imediatamente cada amostra do lote assim que todas as amostras tiverem sido transferidas. Em seguida, combine as soluções do filtrado de acetonitrila com o restante do líquido nos tubos de ensaio respectivos. Novamente, evite transferir qualquer resíduo branco sólido nesta etapa.Cubra, agite e vortexe as soluções combinadas imediatamente antes de passar para a próxima amostra. Após a permetilação, adicione 1,2 mililitros de clorofórmio a cada tubo de ensaio dentro de uma capela. Em seguida, cubra os tubos e misture o conteúdo vigorosamente.Para separar as camadas, centrifugue brevemente as soluções a 3.000 Gs. Utilize uma pipeta Pasteur para extrair e descartar a maior parte da camada aquosa superior, deixando cerca de três mililitros da camada para trás. Adicione 3,5 mililitros do tampão de fosfato de sódio 0,2 molar e, em seguida, tampe, misture e centrifugue o tubo de ensaio. Execute esta etapa de extração líquido/líquido um total de três vezes.Deixando cerca de um mililitro da camada aquosa na extração final. Agora, use uma ponteira de pasteur silanizada limpa para transferir cuidadosamente a camada de clorofórmio para um tubo de ensaio de vidro silanizado, limpo e identificado, conforme descrito no protocolo textual. Em um sistema de evaporação pré-aquecido a 75 graus celsius, seque as amostras sob um fluxo suave de gás nitrogênio.Certifique-se de que o fluxo de gás perturbe a superfície do líquido, mas sem provocar salpicos. Uma vez que as amostras estejam secas, estão prontas para hidrólise. Adicione 325 micro-litros de ácido trifluoroacético 2 Molar ou TFA a cada amostra e misture bem.Tampe firmemente cada tubo de amostra imediatamente após a adição a todas as amostras para evitar a evaporação de TFA e a perda de amostra durante a etapa subsequente de aquecimento. Incube as amostras a 121 graus celsius por duas horas para hidrolisar os glicanos. Enquanto as amostras estão em incubação, prepare novamente o sistema de evaporação a 75 graus celsius.Após a incubação, seque as amostras sob um fluxo constante de nitrogênio no manifold de evaporação. Verifique frequentemente as amostras para garantir que sejam secas usando o tempo mínimo de secagem possível. Adicione a cada amostra 475 microlitros de borohidreto de sódio a 10 gramas por litro.Em seguida, misture bem as amostras para dissolver qualquer resíduo. Tampe os tubos de ensaio e deixe a reação de redução prosseguir por uma hora. A seguir, adicione 63 micro-litros de metanol a cada amostra.Misture e, em seguida, seque as amostras a 75 graus Celsius sob nitrogênio. Adicione 125 microlitros de solução de metanol em ácido acético a cada amostra. Misture e, em seguida, seque novamente as amostras a 75 graus Celsius sob nitrogênio.Certifique-se de que as amostras estejam completamente secas colocando-as sob vácuo por 20 minutos. Após a secagem, adicione 18 micro-litros de água desionizada a cada amostra. Em seguida, centrifugue brevemente as amostras e misture bem para dissolver qualquer precipitado.Em seguida, adicione 250 micro-litros de anidrido acético a cada tubo. Tampe os tubos, vortexe bem e sonique as amostras em banho-maria por dois minutos para garantir a dissolução completa de qualquer resíduo. Incube então as amostras a 50 graus celsius por 10 minutos.Agora, adicione 230 microlitros de TFA concentrado a cada amostra. Após fechar e misturar as amostras, incube-as por 10 minutos a uma temperatura interna de 50 graus Celsius. Adicione 1,8 mililitro de diclorometano a cada amostra e misture bem.Em seguida, adicione dois mililitros de água desionizada ao tubo e realize uma extração líquido/líquido duas vezes. Recupere a camada de diclorometano com uma pipeta de Pasteur silanizada. Transfira para um frasco de auto-amostragem e, em seguida, seque a amostra sob nitrogênio a 74 graus Celsius.Antes da GC-MS, reconstitua as amostras com 120 microlitros de acetona cada, tampando-as e misturando-as completamente. No modo dividido, utilize um amostrador automático para injetar um microlitro de cada amostra no revestimento do modo dividido do CG. Para espectrômetros de massa por tempo de voo, recomenda-se uma relação de divisão de quarenta e gás hélio em modo de fluxo constante a 0,8 mililitros por minuto.Analise a amostra utilizando um gradiente de dois passos que atinge 325 graus celsius. Submeta os componentes da amostra eluídos à ionização por elétrons. Para um analisador de massa por tempo de voo, analise os fragmentos M sobre Z de 40 a 800 com uma taxa de soma de pulsos de 0,1 segundo.Para demonstrar a sensibilidade deste protocolo, uma amostra biológica foi processada cuidadosamente. O cromatograma resultante apresenta intensidade adequada entre os picos dos produtos desejados, facilitando a comparação e a análise. A mesma amostra biológica inicial foi então processada com o mesmo procedimento.Mas o resíduo branco na solução de permetilação que foi centrifugado através da coluna de NaOH foi transferido para a mistura subsequente para extração líquido/líquido. O cromatograma apresenta uma proporção diferente de intensidade dos picos dos mesmos produtos principais da amostra. Quando comparado diretamente, a diferença é acentuada.A depressão acentuada do pico da N-acetilglicosamina ligada na posição 4 no segundo cromatograma é uma característica reconhecível de uma permetilação e extração mal-sucedidas. Para avaliar a utilidade desta abordagem na detecção de diferenças na composição de glicanos em estados patológicos, cromatogramas de íons extraídos de uma amostra de plasma sanguíneo normal e de uma amostra de plasma sanguíneo de um paciente com câncer são normalizados em relação aos manoses 2-ligados e sobrepostos. Diferenças quantitativas em características únicas de glicanos, como ramificação beta 1-6, bem como a sialilação deficiente, são claramente evidentes.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a análise de nós de glicanos em glicômica bottom up. Isso facilita a distinção de características interessantes de glicanos, como corfulcosilação, sick cialilação e glicanito bissesial, em sinais analíticos individuais.

glycan-node-analysis-a-bottom-up-approach-to-glycomics

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

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