Name: Administração intra-traqueal de Haemophilus influenzae No mouse modelos para o Estudo de inflamação das vias aéreas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Aprenda a técnica de inoculação intra-traqueal de Haemophilus influenzae em camundongos para estudar inflamação das vias aéreos. Este método reprodutível permite investigar respostas imunes e mecanismos regulatórios pulmonares.

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Agradecemos ao Dr. Carson Harrod pela leitura crítica do manuscrito. Também agradecemos ao Sr. Minghui Zeng e aos Drs. Mahesh Kathania e Prashant Khare por suas contribuições. Este trabalho foi apoiado por doações da American Cancer Society (bolsa Research Scholar, 122713-RSG-12-260-01-LIB) e do Sammons Cancer Center (bolsa do Projeto Piloto) para K. Venuprasad.

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes da Comissão Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC) do Instituto de Pesquisa Baylor. 1. A cultura não tipificável de Haemophilus influenzae (NTHi) e preparar o inóculo <ol><li> Placa de NTHi numa placa de agar de chocolate e manter a placa invertida numa atmosfera humidificada de CO 2 incubadora durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2. No dia seguinte, a cultura das bactérias em caldo de infusão cérebro coração. Em seguida, adicionar 1 ml de caldo num tubo esterilizado de 1,5 mL. </li><li> Centrifugar a 4.000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Em seguida, descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de solução estéril de PBS 1x. Repita este passo uma vez. </li><li> Transferir 100 ul da solução de re-suspensa em 900 ul de 1x PBS e medir a absorvência da cultura diluída a 600 nm comprimento de onda num espectrofotómetro. </li><li> Determinar a unidade de viabilidade e de formação de colóniass (CFUs) do inoculo de cultura de diluições em série 1:10 em placas de agar de chocolate e incubando durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Com base na viabilidade e CFU determinada a partir da etapa anterior, ajustar o inóculo até uma concentração final de 20 x 10 6 CFU / mL. </li></ol> 2. Intra-traqueal (IT) A instilação <ol><li> Injetar o mouse por via intraperitoneal (ip) com 0,1 ml / 10 g de peso corporal do rato com um + 20 mg solução de 150 mg / ml de cetamina / ml de xilazina. O procedimento deve ser feito na capa com uma fonte de luz para manter o animal aquecido. </li><li> Comprima o espaço interdigital do mouse para verificar se o mouse está devidamente anestesiados. </li><li> Posicione o mouse sobre as suas costas. Raspar a área ventral do pescoço e desinfectar com clorexidina e álcool etílico a 70%. </li><li> Levantar a pele da parte ventral superior do pescoço de ratos usando uma pinça dente. Fazer uma pequena incisão (0,5-1,0 cm) acima do timo utilizando um bisturie dissecar cuidadosamente o músculo para expor a traqueia. <ol><li> Usando uma seringa de 1 ml com uma agulha de 27 G, injectar lentamente 0,05 ml de ar, seguido por 0,05 ml de NTHi obtidos a partir de uma secção ou solução salina como controlo, seguida por outra de ar de 0,05 ml. Manter animais vertical por cerca de 1 min. </li></ol></li><li> Fechar a incisão com cola cirúrgica. Mantenha o mouse lateralmente reclinada e quente por cerca de 10 min. </li></ol> 3. Coleção LBA <ol><li> Sacrificar o mouse por cervical deslocamento de 24 horas após a infecção. </li><li> Abrir a cavidade abdominal do rato com uma tesoura anatômicas e cortou a aorta ventral a sangrar. Expor a parte ventral do pulmão. </li><li> Expor a traquéia e entubar com um cateter de calibre 20. Instilar 0,8 ml de tampão LBA (1x PBS, 0,1% de dextrose, 10 U / ml de heparina) e recolher a lavagem por aspiração suave. Repita este procedimento três vezes. </li><li> Contar o número total de células em 100 ul de suspensão de LBA utilizando um hemocytometros em 10x com Trypan Blue coloração. </li><li> Preparar lâminas para coloração Giemsa modificado. Alíquota de 100 uL de BALF nos poços apropriados da Cytospin e centrifugar a 500 xg durante 5 min. Secam-se as lâminas durante 10 minutos e corar as células com corante de Giemsa modificado de acordo com os protocolos do fabricante. </li><li> Use as restantes células para posterior análise, tal como células de fluorescência activada (FACS), microscopia confocal, a expressão do gene e western blot 11-13. </li></ol> 4. Preparação Histopatologia <ol><li> Para análise histopatológica, infectar ratos com NTHi como descrito no passo 2.4. Após 24 horas de infecção, sacrificar os animais por deslocação cervical. Cortar abrir a cavidade torácica, com uma tesoura anatômicas para expor os pulmões e a traqueia, como mencionado antes. Em seguida, insira o cateter calibre 20 na traqueia. </li><li> Encha os pulmões com 2% de solução de agarose quente preparado em formalina a 4%. Uma vez opulmões são totalmente inflado, gelo lugar no topo dos pulmões para solidificar a solução de agarose. </li><li> Em seguida, retire cuidadosamente a ficha torácica e colocá-lo em uma solução de 50 ml de formalina a 4% em 1x PBS até que seja processada para (H &amp; E) seções hematoxilina e eosina. </li></ol> 5. FACS coloração de células no LBA <ol><li> Colocar 1 x 10 5 células do fluido de LBA numa placa de micro titulação de fundo em V de 96 poços. </li><li> Lavar as células com 300 uL de PBS frio 1x e centrifugação a 4000 xg durante 3 minutos a 4 ° C. </li><li> Corar as células com solução de coloração de células em 100 ul de PBS 1x (1: 1000 de diluição) e manter à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Lavar as células com 300 uL de frio 1x PBS a 4000 xg durante 3 minutos a 4 ° C. </li><li> Manter as células em 100 ul de tampão de lavagem de FACS [tampão de lavagem (1x PBS, 2% de FBS, 1 mM de EDTA, 0,1% de azida de sódio] contendo 1: 100 diluído Fc-bloco durante 15 min a 4 ° C. </li><li> células centrifugar a 4000 xg por 3 min e descartar supernatant. </li><li> As células são coradas com 100 ul de coquetel de coloração da superfície (diluição 1: 100) em tampão de lavagem de FACS durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Lave as células três vezes com 300 ul de tampão de lavagem FACS a 4000 xg durante 3 minutos a 4 ° C. </li><li> Fixar as células em 100 uL de paraformaldeído a 4% durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as células duas vezes com 300 ul de 1x PBS a 400 xg durante 3 min a 4 ° C e re-suspensão em 300 ul de tampão de lavagem de FACS. </li><li> Tornar os controlos de coloração de cor única, utilizando citometria de fluxo esferas. <ol><li> Adicionar uma gota de grânulos para a placa de microlitro de 96 poços de fundo em V e lava-se com 200 ul de PBS 1x. </li><li> Adicionar 1 ml de anticorpo de coloração a 100 ul de PBS 1x e grânulos e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Lavar as pérolas duas vezes com 300 ul de PBS 1x. </li></ol></li><li> Analisar controles e células isoladas coradas por citometria de fluxo 14. </li></ol> 6. A homogeneização de tecido pulmonar para isolar RNA <ol><li> Após a infecção, recolhe um pequeno pedaço de pulmão (20-40 mg) e mantê-lo em RNA estabilizador reagente a 4 ° C durante a noite. Em seguida, armazená-lo a -80 ° C até ao passo seguinte. </li><li> Lavar os tecidos do pulmão em frio 1x PBS para se livrar do reagente de estabilização RNA. </li><li> Colocar o tecido em um tubo de 1,5 ml de centrífuga contendo tampão de lise (1 mL de tampão de lise + 10 ul β-mercaptoetanol). </li><li> Pique o tecido em pequenos pedaços com uma tesoura de pontas e homogeneizar utilizando um pilão pelota do motor sem fio para 20-40 seg. </li><li> Manter o lisado em gelo durante 5 minutos e continue com a etapa 7.1. </li></ol> 7. RNA isolamento do pulmão <ol><li> Centrifuga-se o lisado a 18.000 xg durante 3 min. Remover o sobrenadante por pipetagem e transferir cuidadosamente para um novo tubo de 1,5 mL. </li><li> Adicionar 1 volume de etanol a 70% ao lisado. Misturar imediatamente por pipetagem e esperar por 2-4 min. </li><li> Transferir para 700 ul de lisado a uma coluna de rotação colocadoem um tubo de recolha de 2 ml. </li><li> Centrifugar a 9.600 xg durante 15 seg e descartar o fluxo de passagem. </li><li> Adicionar 350 ul de tampão de lavagem rigorosa e centrifugar a 9600 xg por 15 s. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Adicionar 80 ul de ADNase I directamente para a membrana da coluna de spin e mantê-lo à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Adicionar 350 mL de buffer rigorosas de lavagem para a coluna de centrifugação e centrifugar a 9600 xg por 15 s. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão de lavagem de ARN e centrifugar a 9600 xg durante 15 seg. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Adicionar 500 mL de tampão de lavagem RNA e girar a 9.600 g durante 2 min. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 2 ml e centrifugar a 9600 x g durante 1 min. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Adicionar 30-50 mL água livre de ARNase directamente para a coluna de centrifugação e centrifugar a 9600 x g durante 1 min. ARN armazenar a -80 ° C. </li><li> Realizar a análise de RNA-Seq 14. </li></ol>

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<li>Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Chronic obstructive pulmonary disease.</a> Lancet. 379, 1341-1351 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, nós descrevemos um procedimento único e minimamente invasivo para inocular os pulmões de ratinhos com um agente patogénico bacteriano pulmão. Nós demonstramos que este procedimento pode ser utilizado para estudar a função de genes diferentes que utilizam ratinhos que são deficientes em genes de vias de sinalização inflamatórias. Este procedimento também pode ser usado para estudar as respostas inflamatória a infecções pulmonares virais e fúngicas. As vantagens deste processo em relação aos outros métodos, tais com...

A inflamação é um mecanismo de defesa imunitário fundamental da contra agentes infecciosos. Ela promove a erradicação do patógeno e reparação de tecidos danificados. Além disso, facilita a recuperação para um estado normal e saudável 1. No entanto, a inflamação desregulado muitas vezes leva a doenças inflamatórias crónicas 2. Inflamação das vias respiratórias é um gatilho inicial para diferentes doenças pulmonares tais como doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), asma e fibrose pulmonar 3. A influenzae não tipificável (não encapsulado) Haemophilus (NTHi) é associada com doenças inflamatórias superiores e inferiores do pulmão crónicas 4,5. É a espécie dominante isolados das vias aéreas inferiores de crianças e adultos com 4,6,7 doença pulmonar obstrutiva crónica. A resposta inflamatória após a infecção NTHi é caracterizado pela regulação positiva de citocinas pró-inflamatórias (tais como TNF e IL-1β), e é mediada by mitogen activated protein kinase (MAPK) e fator nuclear-kB (NF-kB) através de receptores toll-like (TLR) 8. modelos de rato são ferramentas muito úteis para analisar a patologia subjacente de doença inflamatória do pulmão, devido à disponibilidade de linhas diferentes de genes deficientes. Vários métodos têm sido utilizados para inocular / bactérias vivas atenuadas e produtos bacterianos, incluindo a instilação intranasal e 9,10 inalação na forma de aerossol. Aqui, nós demonstramos a instilação intra-traqueal. Embora seja utilizada menos frequentemente, esta abordagem é mais eficiente e altamente reprodutível devido à entrega directa do inoculo para o tracto respiratório inferior.

<table><tbody><tr><td>Prato de ágar chocolate</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose Anidra</td><td>Themo Scientific</td><td>R01300</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Hospira,Inc</td><td>RL-3010</td><td></td></tr><tr><td>Solução rápida e hábil</td><td>Sigma</td><td>GS500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de seringa 20/26G&nbsp;</td><td>Seringa BD(</td><td>REF305115/175)</td><td></td></tr><tr><td>Iml</td><td>BD</td><td>REF 309602</td><td></td></tr><tr><td>Cateter 20GA</td><td>BD</td><td>REF</td><td></td></tr> 381433 <tr><td>Tesoura de dissecação, reta, 10 cm de comprimento</td> pinça de íris <td>kentscientific</td><td>INS600393</td><td></td></tr><tr><td>, serrilhada, 10 cm de comprimento</td><td>kentscientific</td><td>INS650915</td><td></td></tr><tr><td>pinça #5 aço inoxidável, 11 cm de comprimento</td><td>kentscientific</td><td></td><td></td>INS600095</tr><tr><td>Formalina 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de poliestireno de 5ml com fundo redondo</td><td>BD</td><td>REF 352058</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tubos de microcentrífuga</td><td>Light Labs</td><td>A-7001-R</td><td></td></tr><tr><td>Reasy Mini&nbsp; kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Motor de pellets pestile (Homoginizador de tecido)</td>Placas de microtitulação de 96 <td>poços Sigma</td><td>Z359971-1EA</td><td></td></tr><tr><td>V bottom Thermo</td><td></td><td>2605</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads eBioscience</td><td></td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0454-81</td><td>Diluição de trabalho 1:100</td></tr><tr><td>Ly-6G-eFlor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>Diluição de trabalho 1:100</td></tr><tr><td>BSA</td><td>HyClone</td><td>SH30574.03</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer (10X)</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead fixable aqua kit de coloração de células mortas</td><td>Invitrogen</td><td>L-34957</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5M)</td><td>lifetechnologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>CD16/ CD32 FcBlock</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Facs tubos de poliestireno tubo inferior redondo</td><td>BD</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Polyscience</td><td>4018</td><td></td></tr></tbody></table>

administração intra-traqueal de<em&gt; haemophilus influenzae</em&gt; no mouse modelos para o estudo de inflamação das vias aéreas

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Aqui, descrevemos um procedimento detalhado de forma eficiente e entregar diretamente Haemophilus influenzae pelas vias respiratórias inferiores de ratos. Nós demonstramos o procedimento para a preparação H. influenzae inóculo, instilação intra-traqueal de H. influenzae para o pulmão, acúmulo de líquido bronco-alveolar lavagem (LBA), análise de células imunes no LBA, e isolamento de RNA para análise de expressão diferencial de genes. Este procedimento pode ser utilizado para estudar a resposta inflamatória do pulmão para qualquer bactérias, vírus ou fungos. A instilação traqueal directa é mais preferido mais de procedimentos de inalação de aerossóis intranasais ou porque mais eficiente proporciona o inoculo bacteriano para o tracto respiratório inferior com menos ambiguidade.

Instilação intra-traqueal resultou num marcadamente aumentada número de leucócitos no LBA (Figura 1A, painel esquerdo) do que a instalação com solução salina. A análise da contagem diferencial dos leucócitos mostrou claramente aumentou a infiltração de neutrófilos (Figura 1, painel da direita). A análise FACS das células no LBA confirmou ainda mais o aumento do número de neutrófilos (Figura 1B). A análise histológica de secções de H @ E-...

Demonstramos o procedimento para inoculação intratraqueal de Haemophilus influenzae no trato respiratório inferior de camundongos. Esta é uma ferramenta muito útil para estudar as vias de sinalização que regulam a inflamação das vias aéreas em modelos de camundongos.

Administração intra-traqueal de<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; No mouse modelos para o Estudo de inflamação das vias aéreas

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

O objetivo geral deste experimento é estudar as respostas imunes no pulmão durante infecção bacteriana. Este tema pode ajudar a responder algumas questões-chave na área da inflamação pulmonar, como quais são os principais mecanismos regulatórios e genes que inibem ou promovem a inflamação pulmonar. A principal vantagem desta técnica é que ela é muito eficiente e altamente reprodutível devido à administração direta do inóculo bacteriano nas vias respiratórias inferiores.Para começar, plaque a NTHi em uma placa de ágar chocolate. Incube a placa virada para baixo durante a noite, a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, cultive as bactérias em um caldo de infusão cérebro-corpo.Em seguida, em um tubo de microcentrífuga, adicione um mililitro do caldo. Centrifugue a mistura a 4.000 g por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet em um mililitro de PBS.Repita este passo de lavagem mais uma vez. Em seguida, dilua 100 microlitros da solução reconstituída em 900 microlitros de PBS e meça a absorbância do cultivo em 600 nanômetros. Utilize esta informação para ajustar o inóculo a 20 milhões de UFC por mililitro.E

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Venuprasad, K., et al. Administração intratraqueal de Haemophilus influenzae em modelos de camundongos para estudar a inflamação das vias aéreas. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a entrega intratraqueal de um inóculo bacteriano patogênico pulmonar em um camundongo anestesiado para modelar a infecção do trato respiratório inferior.

Realizando a entrega bacteriana intratraqueal em um modelo de camundongo

Fonte: Venuprasad, K., et al. Administração intratraqueal de Haemophilus influenzae em modelos de camundongos para estudar a inflamação das vias aéreas. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a coleta e o processamento do fluido de lavagem broncoalveolar de um camundongo sacrificado infectado com Haemophilus influenzae não tipável para análise a jusante.

Coleta de fluido de lavagem broncoalveolar de um modelo de camundongo infectado com Haemophilus influenzae não tipável

Fonte: Lenhard, A. et al. Um modelo camundongo para a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno após coinfecção viral recapitula a doença agravada pela idade. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra um modelo de co-infecção em camundongos no qual o vírus da gripe desencadeia a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno. Ele descreve as etapas envolvidas na colonização bacteriana, infecção viral e progressão da doença.

Um modelo de camundongo para estudar a transição patogênica de Streptococcus pneumoniae após coinfecção viral

Nós desenvolvemos um método simples, confiável e relativamente barata para a intubação traqueal em ratos através de laringoscopia direta utilizando um otoscópio com um espéculo 2,0 mm. Esta técnica é não traumático e pode ser usado para as medições repetidas em experiências crónicas. Achamos superior à traqueostomia ou relatado anteriormente técnicas não cirúrgicas.

Entubação endotraqueal em Ratos<em&gt; Via</em&gt; Laringoscopia direta Usando um otoscópio

A utilização de um modelo que simula a condição de doenças pulmonares em humanos é fundamental para o estudo da fisiopatologia e / ou etiologia de uma doença em particular e para o desenvolvimento da intervenção terapêutica. Aqui um método de intubação orotraqueal não invasivo que pode entregar diretamente materiais exógenos aos pulmões do rato é apresentado.

Não invasiva Intratraqueal intubação para estudar a Patologia e Fisiologia do Rato Lung

A resposta imune do hospedeiro à infecção do agente patogénico é um processo fortemente regulado. Utilizando um modelo de exposição do pulmão lipopolissacarídeo em ratos, é possível realizar avaliações de alta resolução dos complexos mecanismos associados à patogênese da doença.

A utilização de orofaringe Intratraqueal Administração PAMP e Lavagem Broncoalveolar para avaliar a resposta imune do hospedeiro em camundongos

A instilação intratraqueal mediada por intubação (IMIT) de reagentes é um método excelente e não invasivo para estudar doenças respiratórias, bem como um método para instilar reagentes terapêuticos diretamente no pulmão. É um método rápido e altamente reprodutível, adequado para testes pré-clínicos.

Intratraqueal (IMIT) instilação mediada por intubação: A não-invasiva, sistema de entrega Lung-specific

Há uma falta geral de conhecimento sobre como as vacinas funcionam. Aqui, propomos o uso combinado de genética reversa e camundongos quiméricos da medula óssea para obter informações sobre as respostas imunes iniciais do hospedeiro às vacinas, com foco especial nas células dendríticas e na imunidade das células T.

A administração intranasal de recombinantes Vacinas contra Influenza em quimérico rato Modelos para estudar a imunidade mucosal

Vários métodos foram descritos na literatura para a modelagem de pneumonia bacteriana em murganhos. Aqui, nós descrevemos um método de baixo custo, rápida não-invasiva para induzir pneumonia por aspiração (isto é, por inalação) de um inoculo bacteriano pipetados para a orofaringe. métodos a jusante para avaliação da resposta imune inata pulmonar também são detalhados.

Um método não-invasivo e tecnicamente não-intensivo para indução e fenotipagem of Experimental pneumonia bacteriana em ratos

Neste estudo, apresentamos um protocolo para executar dois fotões intravital imagem e célula interação análise na mucosa traqueal murino após infecção com vírus da gripe. O presente protocolo será relevante para pesquisadores estudando a dinâmica de células imunes durante infecções respiratórias.

Interação de célula de imagem latente na Mucosa traqueal durante a infecção de vírus de Influenza usando microscopia Intravital dois fotões

Este protocolo fornece instruções para administração intranasal de IAV e análise a jusante de danos pulmonares em camundongos e alterações transcricionais associadas aos tipos de células pulmonares.

Modelagem do Reparo Alveolar Pulmonar Displásico e Funcional após Infecção por Influenza

Aprenda a técnica de inoculação intra-traqueal de Haemophilus influenzae em camundongos para estudar inflamação das vias aéreos. Este método reprodutível permite investigar respostas imunes e mecanismos regulatórios pulmonares.

Administração intra-traqueal de

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