Name: A Monte Whole In Situ Método de hibridação para o molusco gastrópode stagnalis Lymnaea (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Aprenda a técnica de hibridização in situ em montagem total para visualizar padrões de expressão gênica em embriões e larvas de Lymnaea stagnalis. Este método permite estudar biologia do desenvolvimento e Evo-Devo com alta eficiência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelo financiamento para DJJ por meio de projeto DFG # JA2108 / 2-1.

NOTA: Os passos seguintes descrevem o nosso método para a realização de uma experiência in situ em estágios embrionários e larval de L. stagnalis. Quando uma etapa envolve o uso de um produto químico perigoso o facto é indicado pela palavra &quot;CUIDADO&quot; e todos os procedimentos de segurança adequados devem ser adoptadas. Links para folhas de MSDS representativos para os produtos químicos perigosos são fornecidos no Documento Suplementar 1. Receitas para todos os reagentes são fornecidos no Documento Suplementar 2. 1. Montagem de Decapsulation Apparatus <ol><li> Para fazer isso, ligar uma seringa descartável ml 20 a tubagem de silicone (com um diâmetro interior de 1 mm e um diâmetro externo de 3 mm) usando um corte de ponta P1,000 para um comprimento adequado, como mostrado na Figura 2A. </li><li> Tape uma lâmina de microscópio padrão a uma grande placa de Petri invertida. Tape o tubo de silicone imediatamente adjacente à lâmina de microscópio, como mostrado na figura60; 2C e 2D. </li><li> Descansar uma agulha de vidro puxado sobre a lâmina do microscópio e suavemente inseri-lo no tubo de silicone até que a ponta da agulha fica saliente cerca de 20% do caminho através do diâmetro interior do tubo (ver figura 2C e 2D). Uma vez que a agulha se encontra na posição de fita-o para baixo para a placa de Petri. </li><li> Permitir que a extremidade livre do tubo de silicone para descansar na outra placa de Petri que irá recolher o material desencapsulado. </li></ol> 2. Amostra Recolha, Fixação e Decapsulation NOTA: Todos os passos são realizados à TA, a menos que indicado de outra maneira. <ol><li> Recolher cuidadosamente cordas de ovos de as paredes de um aquário. Para fazer isso, use um pedaço de plástico flexível como uma espátula para raspar a cadeia de ovo fora do substrato, e usar um coador de chá de plástico para pescar a cadeia de ovo flutuando para fora da água. Fase e ordenar o material sob um microscópio usando o guia proporcionado na Figura1. </li><li> Coloque a cadeia de ovo em uma toalha de papel e fazer uma incisão longitudinal ao longo da massa de ovos usando a pinça pluma. Rolar as cápsulas de ovos para fora da cadeia de ovo e remover o máximo do material gelatinoso possível de cada cápsula, empurrando-os em torno da toalha de papel usando a pinça pluma. </li><li> Usando a pinça pluma, transferir as cápsulas de ovos em uma placa de Petri contendo 5 ml de água da torneira. Continuar a recolher cápsulas de ovos gelatinoso-de dos estágios de desenvolvimento desejados para este prato. Recolher cápsulas suficientes de todos os estágios de desenvolvimento para o experimento WMISH planejado seguida, avance para a próxima etapa. </li><li> Ao trabalhar com larvas mais desenvolvidas (5 dias após a primeira clivagem (CPFD) e mais velhos) anestesiar-los antes da fixação. NOTA: Isso vai evitar que os músculos se contraiam o que torna a interpretação dos em padrões de coloração in situ muito difíceis. <ol><li> Relaxe larvas (enquanto eles ainda estão em seu capsules) em uma solução a 2% w / v de MgCl2 • 6H 2 O durante 30 min antes da fixação. </li><li> Avaliar o grau de relaxamento após 30 min, submergindo várias larvas enquanto ainda em suas cápsulas de ovos na solução fixadora e monitorar a sua resposta sob um microscópio. Incompletamente larvas relaxado será recolhido em seus escudos, enquanto as larvas totalmente relaxado não vai responder. Uma vez que estas larvas foram relaxadas avançar para a próxima etapa. </li></ol></li><li> Transferir as cápsulas de ovo usando uma pipeta de orifício largo para um tubo de plástico selável que fornece 10 vezes o volume das cápsulas de ovo (por exemplo., 1 ml de cápsulas liquidados exigiria um tubo 10+ ml). </li><li> Aspirar o máximo de líquido possível do tubo e substitua com um volume de solução de fixação que é 10 vezes o volume das cápsulas de ovos liquidados. Gire gentilmente as cápsulas de ovos em fixador à TA, durante o tempo apropriado para cada estágio de desenvolvimento (veja a Figura 1). </li><li> Discontinrotação ue e permitir que as cápsulas para afundar e aspire a solução fixadora em um recipiente adequado de lixo. </li><li> Lavam-se as cápsulas de ovos, substituindo a solução fixadora com tampão fosfato com 0,1% de Tween-20 (PBTw) e rodando à TA durante 5 min. Aspirar o PBTw e repetir duas vezes. </li><li> Remover os embriões e larvas das suas cápsulas utilizando o aparelho (ver secção 1 para detalhes) mostrado na Figura 2. Desenhar as cápsulas para a seringa de 20 ml, conectar o tubo e depois dissipar as cápsulas através da tubagem e passado a agulha de vidro para fora o prato coleção. NOTA: Normalmente, a maioria (&gt; 90%) de todas as cápsulas devem precisar apenas uma passagem através do dispositivo. Em muitos casos, a membrana de cápsula é danificado mas embriões e larvas permanecem no interior da cápsula rompida. Reprocessar este material, simplesmente puxando-o para dentro da seringa e dissipando-lo novamente. </li><li> Coletar os embriões descapsulados e larvas em um tubo de 1,5 ml usando um microfoneropipette (a P20 para o 0 - 3 dias larvas de idade, e uma P200 para larvas mais velhas com a extremidade da ponta cortada). NOTA: Uma pausa (até vários meses) no protocolo podem ser feitas nesta fase. Se isso for necessário, o material decapsuled deve ser recolhido num tubo de 1,5 ml para armazenamento (continuar para o próximo passo). Caso contrário, continue imediatamente o Protocolo nº 3. </li><li> Permitir que os embriões e larvas de afundar para o fundo do tubo e aspirar o sobrenadante. Substitua com 33% de etanol (EtOH) em PBTw e deixe descansar por 5 - 10 min. Repita com 66% de EtOH em PBTw e 100% EtOH. Lavar as larvas duas vezes em 100% de EtOH à TA. Armazenar o material a -20 ° C em EtOH a 100%. </li><li> Quando estiver pronto para continuar, re-hidratar as amostras por remoção do EtOH 100% e substituindo com 66% de EtOH em PBTw, deixe descansar por 5 - 10 min. Repita com 33% EtOH em PBTw, deixe descansar por 5 - 10 min. Finalmente lava-se com 3 x 5 min lavagens de PBTw para garantir que todo o EtOH é removido. </li></ol> 3. Proteinase-K, TEA e Pós-fixation NOTA: Encontramos executando as seguintes etapas em pequenos cestos com um piso de malha o método mais eficiente e suave para a troca rápida de soluções críticas de tempo. Embora possa ser feito em casa, usamos cestas (tamanho médio) que são compatíveis com a manipulação de líquidos robô Intavis InSituPro -Vsi (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). Tais cestos podem ser rapidamente e facilmente movido entre as cavidades de uma placa de cultura de tecidos de 12 (TCD), a fim de soluções de troca, ou a solução pode ser aspirado do poço utilizando uma pipeta. Alternativamente, todas as trocas de solução pode ser realizada sem estes cestos simplesmente por aspiração do sobrenadante a partir das larvas. Neste caso, um movimento rotativo suave irá concentrar-se todos os embriões e larvas para o centro do prato, permitindo-se o sobrenadante para ser removida a partir da borda do poço. O seguinte assume que o usuário está empregando cestas para as trocas de solução. <ol><li> Usando uma pipeta, Transferência de embriões e larvas para um cesto de sentado num TCD 12 poços com 2 ml de PBTw. NOTA:. O número de embriões e / ou larvas que podem ser adicionados depende do estágio de desenvolvimento a ser investigado, no entanto, uma regra geral é manter pelo menos 25% do espaço livre de embriões / larvas (ou seja, não sobrecarregar o cesto). </li><li> Prepara-se uma adjacente bem com 2 ml de solução de proteinase-K apropriado (ver Figura 1), e mais 2 poços com 2 ml de 0,2% de glicina cada. Mover cada cesto para o poço contendo a concentração apropriada de proteinase-K e começar imediatamente a distribuição. </li><li> Após 10 min mover cada cesto dentro de um poço que continha 0,2% de glicina e incubar durante 5 min. Em seguida, mover cada cesto para o segundo poço com 0,2% de glicina e incubar durante 5 min. Lavar a Glycine com 3x 5 mínimo de trocas de 3 ml PBTw. </li><li> Remover a solução PBTw e tratar as amostras uma vez com recentemente preparada Trietanolamina (TEA) Solution por 5 min CUIDADO! Não agite. Substituir com 3 ml de solução de chã recentemente preparado, durante 5 min. Não agite. Aspirar a maioria da solução de chá a partir das amostras. Adicione o Triethanolamine preparada na hora com uma solução de anidrido acético (TEAAA) e incubar por 5 min. CUIDADO! Não agite. </li><li> OPCIONAL - Enquanto o passo acima é a incubação, preparar um outro novo lote de solução de TEAAA e repita o passo acima. NOTA: Este segundo tratamento com TEAAA é opcional, mas pode ajudar a eliminar completamente todo o fundo com sondas propensas a gerar fundo. </li><li> Remover a solução TEAAA, aspirando-o a partir do poço e substituir com 3 ml de PBTw. Não agite. Remover o PBTw e aplicar 3 ml de formaldeído a 3,7% em PBTw. Agite suavemente, ocasionalmente, durante uma incubação de 30 minutos. </li><li> Remover o fixador, aspirando-o a partir do poço e substituir com 3 ml de PBTw. Transferir o material para um tubo de 1,5 ml. REColoque PBTw o tampão de hibridação com e incubar durante 5 min à TA - CUIDADO. </li><li> Colocar os tubos em um bloco quente, à TA, e ajustar a temperatura para a temperatura de hibridização desejado. NOTA: A temperatura de hibridização é sonda específica e terá de ser empiricamente optimizadas, no entanto, achamos 55 ° C até ser uma boa temperatura para inicialmente ensaio. Permitir que o bloco de vir até à temperatura de hibridação, e permitir que as amostras de pré-hibridação durante aproximadamente 15 minutos (isto é, o tempo necessário para preparar as ribossondas, já não é necessária). Prepare os volumes adequados (geralmente 100? L) de ribossondas diluído. Nós concentrações de sonda tipicamente de teste de 100 e 500 ng / ml como uma primeira série. Nós preparamos riboprobes de acordo com a 12. </li><li> Remover o tampão de hibridação a partir das amostras e adicionar a sonda em tampão de hibridização para as amostras. Sobreposição com 100 ul (ou um volume adequado de modo a formar uma fase acima da-manhã de hibridaçãor), do óleo mineral. NOTA: O óleo mineral impede extensa condensação que formarão durante o passo de hibridização longa. Extensa condensação irá alterar de forma significativa tanto a composição química da solução de hibridação e a concentração da sonda. </li><li> Desnaturar a sonda e o alvo de ARN por aquecimento das amostras a 75 ° C durante 10 min, em seguida, reduzir o calor para a temperatura de hibridização desejado. Permitir a hibridação prosseguir durante um mínimo de 12 hr (S / N) ou mais longos (24 - 48 h). </li><li> Durante a hibridação remover um único tubo do bloco de calor, girá-lo rapidamente entre o polegar eo indicador para suspender as larvas sem perturbar a fase de óleo, e substituí-lo no bloco de calor. Repita este uma vez a cada 6-12 horas ou assim. </li></ol> 4. Hot Lava e imunodetecção NOTA: Enquanto nós usamos um robô de manipulação de líquido para as etapas seguintes, estes também podem ser facilmente feito manualmente. Neste caso, embriões e larvas should ser mantido nos tubos de 1,5 ml foram hibridizadas em. Todas as trocas de solução subsequentes são aspirado e adicionado com uma pipeta P1,000. Quando realizada manualmente cada um dos passos que se seguem devem empregar 1 ml de cada solução. <ol><li> os volumes adequados de calor (3 ml cada uma para cada amostra) do 4x, 2x e 1x soluções de lavagem à temperatura de hibridação. </li><li> Lavar todas as amostras três vezes em tampão de lavagem 4x durante 15 minutos cada à temperatura de hibridação. Lavar todas as amostras três vezes em tampão de lavagem 2x durante 15 minutos cada à temperatura de hibridação. Lavar todas as amostras três vezes em 1X tampão de lavagem durante 15 minutos cada à temperatura de hibridação. </li><li> Lavar uma vez com todas as amostras de tampão 1x Cloreto de sódio Citrato de sódio + 0,1% de Tween (SSC + 0,1% de Tween) à temperatura de hibridação. Deixar as amostras de arrefecer até à TA. </li><li> Lave todas as amostras duas vezes em 1x SSC + 0,1% Tween durante 15 min Substitua esta solução SSC 1x com tampão de ácido maleico (MAB) e deixe descansar por 10 min Repita o MAB wcinza. Substituir o MAB com solução de bloqueio e incubar durante 1,5 h. </li><li> Trocar a solução de bloqueio para solução de anticorpos (1: 10000 de anticorpo numa solução de bloqueio) e incubar durante 12 horas (O / N) à temperatura ambiente com agitação suave. </li></ol> 5. Desenvolvimento de cores e de montagem <ol><li> Aspirar a solução de anticorpos e lavagem 15 vezes com PBTw durante 10 min cada. Substituir PBTw com 1x tampão de fosfatase alcalina (AP) e incubar durante 10 min. </li><li> Enquanto o passo de incubação acima receitas, preparar a solução de coloração AP (ver Documento Suplementar 2) - CUIDADO. Transferir o material em um TCD poço e substitui a solução de AP 1x com solução de coloração de AP. Note-se a tempo de forma que o período de tempo a cor da reacção tem lugar durante pode ser gravada. Monitorar o desenvolvimento do padrão de coloração até que o sinal à relação de fundo é óptima. </li><li> Para parar o desenvolvimento da cor, remova a solução de coloração 1x AP (descarte na estavas apropriadae container), e aplicar 2 ml de PBTw e observe o tempo agora. Lavar mais duas vezes com PBTw durante 5 minutos cada. Usar um destes enxaguamentos para transferir o material para um tubo de 1,5 ml. </li><li> Remover o PBTw e aplicar 1 ml de 3,7% de formaldeído em PBTw e agita-se ou rodar em menos de 30 min à temperatura ambiente (isto pode também ser feito S / N). </li><li> Lavar o fixador com 3 lavagens de PBT (descartar o fixador de resíduos em um recipiente adequado de lixo). Lavam-se as amostras 3 vezes a 50 ° C em água desionizada. NOTA: Estas lavagens eliminar a precipitação de sais que podem tornar-se visível durante a limpeza e as etapas de visualização. </li><li> Decidir se as amostras devem ser montados em benzoato de benzilo: Álcool benzílico (BB: BA, também conhecido como clara de Murray) ou glicerol. NOTA: Nós preferimos o mais poderoso agente de compensação BB: BA como L. stagnalis embriões são um tanto opaca. As amostras a serem montados no BB: BA primeiro precisa ser desidratado através de uma série de etanol. As amostras a ser montada em 60%O glicerol pode ser montado imediatamente. </li><li> Transferir as amostras para dentro da solução de montagem (BB: BA ou 60% de glicerol) utilizando uma pipeta. NOTA: Ao montar no BB: BA isso deve ser feito em um copo bem (BB: BA vai derreter o plástico policarbonato). </li><li> Permitir que as amostras para limpar para 5 - 10 min, e depois montá-los sobre uma lâmina utilizando um número apropriado de lamelas empilhados como espaçadores (1 lamela para as amostras &lt;1 CPFD, 2 Lamelas para amostras&gt; 1 CPFD). NOTA: Whole montagens agora pode ser fotografada usando um microscópio composto com DIC óptica. </li></ol>

<ol><li>Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+evolutionary+relationships+of+molluscs+with+phylogenomic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools.</a> Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).</li>
<li>Brusca, R. C., Brusca, G. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrusca%2C+RC+%22Invertebrates%22">Invertebrates</a>. , Sinauer. Sunderland. (2002).</li>
<li>Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Global Aquaculture Production 1950-2013. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en">http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en</a> (2013).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%3A+number+of+people+treated+in+2011%5BTitle%5D)+AND+%22Week.+Epi.+Rec%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis: number of people treated in 2011.</a> Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).</li>
<li>Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slipper+snail%2C+Crepidula.%3A+an+emerging+lophotrochozoan+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system.</a> Biol. Bull. 218 (3), 211-229 (2010).</li>
<li>Perry, K. J., Henry, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+modification+in+the+mollusc%2C+Crepidula+fornicata%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata.</a> Genesis. 53 (2), 237-244 (2015).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+memory+storage%3A+a+dialog+between+genes+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Bio.+Rep%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses.</a> Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).</li>
<li>Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+gene+expression+with+larval+competence%2C+and+the+effect+of+age+and+parentage+on+metamorphosis+in+the+tropical+abalone+Haliotis+asinina%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina.</a> Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).</li>
<li>Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+a+molluscan+RXR+and+evidence+for+its+novel%2C+nongenomic+role+in+growth+cone+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance.</a> Dev. Biol. 343 (1-2), 124-137 (2010).</li>
<li>Rittschof, D., McClellan-Green, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molluscs+as+multidisciplinary+models+in+environment+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Pollut.+Bull%22%5BJournal%5D)">Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology.</a> Mar. Pollut. Bull. 50 (4), 369-373 (2005).</li>
<li>Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+set+of+maternal+genes%3F+Insights+from+a+molluscan+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome.</a> Int. J. Dev. Biol. 58 (6-8), 501-511 (2014).</li>
<li>Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+whole+mount+in+situ.+hybridisation+protocol+for+the+mollusc+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis.</a> BMC Dev. Biol. 15 (1), 19(2015).</li>
<li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+egg+of+Limnaea+stagnalis.+L.+from+oviposition+till+first+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neth.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage.</a> Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 91-121 (1946).</li>
<li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+egg+of+Limnaea+Stagnalis.+L.+from+the+first+cleavage+till+the+troghophore+stage%2C+with+special+reference+to+its%27+chemical+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neth.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology.</a> Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 353-434 (1946).</li>
<li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+in+Limnaea+stagnalis.+and+its+disturbance+by+lithium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium.</a> J. Exp. Zool. 121 (1), 1-77 (1952).</li>
<li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+and+origin+of+the+cortical+morphogenetic+field+in+Limnaea%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea.</a> Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).</li>
<li>Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulative+development+in+the+pulmonate+gastropod%2C+Lymnaea+palustris.%2C+as+determined+by+blastomere+deletion+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments.</a> J Exp Zool. 183 (1), (1973).</li>
<li>Van Den Biggelaar, J. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+the+phases+of+the+cell+cycle+during+the+period+of+asynchronous+division+up+to+the+49-cell+stage+in+Lymnaea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Emb.+Exp.+Morph%22%5BJournal%5D)">Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea.</a> J. Emb. Exp. Morph. 26 (3), 367-391 (1971).</li>
<li>Verdonk, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+early+development+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis.</a> Dev. Biol. 35 (1), 29(1973).</li>
<li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+Detection+of+Rna-Dna+Hybrid+Molecules+in+Cytological+Preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+National+Academy+Of+Sciences+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63 (2), 378-383 (1969).</li>
<li>Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+engrailed+and+dpp+in+the+gastropod+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis.</a> Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).</li>
<li>Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+functions+of+Dpp+in+gastropod+shell+formation+and+shell+coiling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling.</a> Dev Genes Evol. 221 (2), 59-68 (2011).</li>
<li>Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+MAPK+signaling+in+patterning+and+establishing+axial+symmetry+in+the+gastropod+Haliotis+asinina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina.</a> Dev. Biol. 311 (1), 200-212 (2007).</li>
<li>Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+Brachyury+in+the+mollusc+Patella+vulgata+suggests+a+conserved+role+in+the+establishment+of+the+AP+axis+in+Bilateria%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria.</a> Development. 129 (6), 1411-1421 (2002).</li>
<li>Jackson, D. J., Wörheide, G., Degnan, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+ancient+and+novel+molluscan+shell+genes+during+ecological+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions.</a> BMC Evol. Biol. 7 (1), 160(2007).</li>
<li>Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+COE.+across+the+Metazoa+supports+a+conserved+role+in+neuronal+cell-type+specification+and+mesodermal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development.</a> Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).</li>
<li>Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deployment+of+regulatory+genes+during+gastrulation+and+germ+layer+specification+in+a+model+spiralian+mollusc%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc.</a> Dev. Dyn. , (2015).</li>
<li>Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+engrailed+and+dpp+in+the+gastropod+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis.</a> Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).</li>
<li>Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+asymmetric+expression+of+dpp+in+the+mantle+of+gastropods+correlates+with+asymmetric+shell+coiling%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling.</a> EvoDevo. 4 (1), 15(2013).</li>
<li>Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+animal+microRNAs+and+the+evolution+of+tissue+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity.</a> Nature. 463, (2010).</li>
<li>Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+triple+staining+method+for+double+in+situ+hybridization+in+combination+with+cell+lineage+tracing+in+whole-mount+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos.</a> Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).</li>
<li>Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev. Biol. 11 (1), 43(2011).</li>
<li>Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+behaviour+in+Lymnaea+stagnalis.+pond+snails+is+a+maternally+inherited%2C+lateralized+trait%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait.</a> Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).</li>
<li>Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+blastomere+arrangement+dictates+zygotic+left-right+asymmetry+pathway+in+snails%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails.</a> Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).</li>
<li>Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+handedness+is+directed+by+genetically+determined+cytoskeletal+dynamics+in+the+early+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo.</a> Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).</li>
<li>Lu, T. Z., Feng, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sodium+leak+current+regulates+pacemaker+activity+of+adult+central+pattern+generator+neurons+in+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis.</a> PLoS One. 6 (4), e18745(2011).</li>
<li>Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Splicing+of+an+Invertebrate+Beta+Subunit+%28LCav-beta%29+in+the+N-Terminal+and+HOOK+Domains+and+Its+Regulation+of+LCav1+and+LCav2+Calcium+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels.</a> PLoS ONE. 9 (4), e92941(2014).</li>
<li>Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+evolutionary+relationships+of+molluscs+with+phylogenomic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools.</a> Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).</li>
<li>Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+genome+size+databases%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic genome size databases.</a> Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método descrito aqui permite a visualização eficiente de transcrições de RNA com presumivelmente diferentes níveis de expressão dentro de todos os estágios de desenvolvimento de Lymnaea stagnalis. Para remover embriões e larvas de suas cápsulas que trialed uma variedade de produtos químicos, choque osmótico e tratamentos físicos relatados para outra encapsulated- desenvolvimento de organismos-modelo. No entanto, nas nossas mãos o método aqui descrito, é a única técnica de alto rendimento que remove a membrana...

Os moluscos são um grupo de animais que mantêm o interesse de uma ampla diversidade de disciplinas científicas. Apesar da sua diversidade morfológica 1, riqueza de espécies (perdendo apenas para os artrópodes em termos de número de espécies 2) e relevância para uma ampla gama de comerciais 3, médicos e científicos 4 questões 5-8, há relativamente poucas espécies de moluscos que podem reivindicar a ser ambos os modelos científicos bem equipados e fácil de manter em um ambiente de laboratório. Um molusco que é muito usado por disciplinas como a neurobiologia 9, ecotoxicologia 10 e, mais recentemente, a biologia evolutiva 11,12, é Lymnaea stagnalis, principalmente devido à sua ampla distribuição e extrema facilidade de manutenção. Apesar de sua popularidade como um organismo &quot;modelo&quot; e sua longa história de uso por biólogos do desenvolvimento 13-19, o alcance e poder de ferramentas moleculares disponíveis para a L. stagnalis comunidade científica encontra-se muito atrás da de modelos mais tradicionais de origem animal (Drosophila, rato, ouriço do mar, nemátodos). O nosso desejo de desenvolver Lymnaea como um modelo molecular surge do interesse nos mecanismos moleculares que orientam a formação de shell. Isso nos motivou a refinar um conjunto de técnicas que permitam a visualização eficiente, consistente e sensível da expressão de genes durante o desenvolvimento de Lymnaea. Montagem inteira de hibridização in situ (WMISH) é amplamente utilizado para uma variedade de organismos-modelo e tem sido usado por mais de 40 anos 20. Nas suas diferentes formas, ISH pode ser empregue para localizar espacialmente loci específicos nos cromossomas, ARNr, ARNm e micro-ARN. Um dos desafios que precisávamos para resolver antes da refinação um método WMISH para L. stagnalis foi a questão do cuidado e de forma eficiente extração embriões e larvas de diferentes estágios de tele cápsulas de ovos em que são depositadas. Esta extracção, ou &#39;desencapsulamento&#39;, tem de ser conseguida de forma eficiente, a fim de recolher o material adequado para uma determinada experiência in situ, enquanto, ao mesmo tempo mantendo a integridade morfológica e celular. Enquanto outros organismos modelo também submetidos a um desenvolvimento encapsulado, em nossas mãos nenhum dos métodos descritos para as espécies poderia ser empregada com sucesso em L. stagnalis. Os objetivos gerais deste método são, portanto: para extrair L. stagnalis embriões e larvas de suas cápsulas em uma forma de alto rendimento, para aplicar tratamentos pré-hibridação que optimizam o sinal WMISH, para preparar embriões e larvas com WMISHsignals satisfatórios para a imagem latente.

<table><tbody><tr><td>Pinça Featherweight</td><td>Ehlert & Parceiro</td><td>#4181119</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação de silicone</td><td>Glasger&auml; tebau OCHS GmbH</td><td>760070</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro</td><td>Hilgenberg</td><td>1403547</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultura de tecidos de 12 poços</td><td>Carl Roth</td><td>CE55.1</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldeído</td><td>Carl Roth</td><td>P733.1</td><td>CUIDADO - Pode causar câncer. Tóxico por inalação, em contacto com a pele e por ingestão. Tóxico: perigo de efeitos irreversíveis muito graves por inalação, em contacto com a pele e por ingestão.</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiamina tetracético</td><td>Carl Roth</td><td>CN06.3</td><td>CUIDADO - CAUSA IRRITAÇÃO NOS OLHOS. PODE CAUSAR IRRITAÇÃO DO TRATO RESPIRATÓRIO E DA PELE. Evite respirar poeira. Evite o contato com os olhos, pele e roupas. Use apenas com ventilação adequada</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td>CUIDADO - Pode ser prejudicial se inalado. Pode causar irritação do trato respiratório. Pode ser prejudicial se absorvido pela pele. Pode causar irritação na pele. Pode causar irritação nos olhos. Pode ser prejudicial se ingerido.</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll tipo 400</td><td>Carl Roth</td><td>CN90.1</td><td></td></tr><tr><td>polivinilpirrolidona K30 (MW 40)</td><td>Carl Roth</td><td>4607.1</td><td>CUIDADO - Pode ser prejudicial se inalado. Pode causar irritação do trato respiratório. Pode ser prejudicial se absorvido pela pele. Pode causar irritação na pele. Pode causar irritação nos olhos. Pode ser prejudicial se ingerido.</td></tr><tr><td>Nuclease livreAlbumina sérica bovina</td><td>Carl Roth</td><td>8895.1</td><td></td></tr><tr><td>Esperma de salmão</td><td>Carl Roth</td><td>5434.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Carl Roth</td><td>7692.1</td><td>CUIDADO - OS EFEITOS ADVERSOS INCLUEM HEMORRAGIA, IRRITAÇÃO LOCAL. POSSÍVEL REAÇÃO ALÉRGICA SE INALADO, INGERIDO/CONTATADO. IRRITANTE PARA OS OLHOS/PELE/TRATO RESPIRATÓRIO. POSSÍVEL HIPERSENSIBILIZAÇÃO. DURANTE A GRAVIDEZ FOI RELATADO PARA AUMENTAR O RISCO DE NATIMORTO</td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Carl Roth</td><td>7528.1</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Carl Roth</td><td>3790.2</td><td></td></tr><tr><td>Formamida deionizada</td><td>Carl Roth</td><td>P040.1</td><td>CUIDADO - Irritante para os olhos e a pele. Pode ser prejudicial por inalação, em contacto com a pele e se ingerido. Pode causar danos ao feto. Higroscópico.</td></tr><tr><td>Formamida padrão</td><td>Carl Roth</td><td>6749.3</td><td>CUIDADO - Irritante para os olhos e a pele. Pode ser prejudicial por inalação, em contacto com a pele e se ingerido. Pode causar danos ao feto. Higroscópico.</td></tr><tr><td>Trietanolamina</td><td>Carl Roth</td><td>6300.1</td><td>CUIDADO - Evite respirar vapor ou névoa. Evite o contato com os olhos. Evite o contato prolongado ou repetido com a pele. Lave bem após o manuseio.</td></tr><tr><td>Anidrido acético</td><td>Carl Roth</td><td>4483.1</td><td>CUIDADO - CAUSA QUEIMADURAS GRAVES NA PELE E NOS OLHOS. REAGE VIOLENTAMENTE COM A ÁGUA. PREJUDICIAL SE INGERIDO. VAPOR IRRITANTE PARA OS OLHOS E TRATO RESPIRATÓRIO</td></tr><tr><td>Ácido maleico</td><td>Carl Roth</td><td>K304.2</td><td>CUIDADO - Muito perigoso em caso de contato com os olhos (irritante), de ingestão, . Perigoso em caso de contato com a pele (irritante), de inalação (irritante pulmonar). Ligeiramente perigoso em caso de contato com a pele (permeador). Corrosivo para os olhos e a pele.</td></tr><tr><td>Benzoato de benzila</td><td>Sigma</td><td>B6630-250ML</td><td>CUIDADO - Pode ser prejudicial se inalado. Pode causar irritação do trato respiratório. Pode ser prejudicial se absorvido pela pele. Pode causar irritação na pele. Pode causar irritação nos olhos. Nocivo se ingerido.</td></tr><tr><td>Álcool benzílico</td><td>Sigma</td><td>10,800-6</td><td>CUIDADO - Nocivo por ingestão. Nocivo se inalado. Causa irritação ocular grave.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Pó bloqueador</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti DIG Fragmentos de Fab conjugados AP</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitro cloreto de tetrazólio azul em dimetilformamida&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>4421.3</td><td>CUIDADO - Pode causar danos ao feto. Nocivo por inalação e em contato com a pele. Irritante para os olhos.</td></tr><tr><td>5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato</td><td>Carl Roth</td><td>A155.3</td><td>CUIDADO - Potencialmente prejudicial se ingerido. Não entre em contato com a pele, os olhos ou a roupa. Potencial irritante para a pele e os olhos.&nbsp;</td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Carl Roth</td><td>4126.1</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Carl Roth</td><td>6908.1</td><td>CUIDADO - Pode causar irritação nos olhos e na pele. Pode causar irritação do trato respiratório e digestivo. As propriedades toxicológicas deste material não foram totalmente investigadas.</td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S</td><td>CUIDADO - Pode ser prejudicial se inalado. Pode causar irritação do trato respiratório. Pode ser prejudicial se absorvido pela pele. Pode causar irritação na pele. Pode causar irritação nos olhos. Pode ser prejudicial se ingerido.</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.3</td><td>CUIDADO - Nocivo por ingestão. Tóxico em contato com a pele. Causa irritação na pele. Causa sérios danos aos olhos. Pode causar irritação respiratória.</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>hidrogenofosfato dissódico di-hidratado (Na2HPO4&#8226; 2H2O)</td><td>Carl Roth</td><td>4984.1</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrogenofosfato de potássio (KH2PO4)</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de trissódio di-hidratado (C6H5Na3O7&#8226; 2H2O)</td><td>Carl Roth</td><td>3580.1</td><td>CUIDADO - Pode causar irritação nos olhos, pele e trato respiratório. As propriedades toxicológicas deste material não foram totalmente investigadas.</td></tr><tr><td>Óleo mineral&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>HP50.2</td><td></td></tr><tr><td>InSituPro-Vsi&nbsp;</td><td>Intavis</td><td></td><td>www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc</td></tr></tbody></table>

a monte whole<em&gt; in situ</em&gt; método de hibridação para o molusco gastrópode<em&gt; stagnalis lymnaea</em

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Montagem inteira de hibridização in situ (WMISH) é uma técnica que permite a resolução espacial das moléculas de ácidos nucleicos (ARNs mensageiros) muitas vezes dentro de uma preparação de tecido &#39;todo de montagem &quot;, ou fase de desenvolvimento (tais como um embrião ou larva) de interesse. WMISH é extremamente poderoso, pois pode contribuir significativamente para a caracterização funcional de genomas metazoários complexos, um desafio que está se tornando mais um gargalo com o dilúvio de dados de sequências de próxima geração. Apesar da simplicidade conceptual da técnica muito tempo é muitas vezes necessária para optimizar os vários parâmetros inerentes às experiências WMISH para novos sistemas de modelo; diferenças subtis nas propriedades celulares e bioquímicas entre tipos de tecidos e estágios de desenvolvimento significa que um único método WMISH pode não ser apropriada para todas as situações. Temos desenvolvido um conjunto de métodos WMISH para o modelo de gastrópode Lymnaea stagnalis reemergentes que geram consistente esinais WMISH claras para uma variedade de genes, e em todos os estágios de desenvolvimento. Estes métodos incluem a atribuição de larvas de idade cronológica desconhecido para uma janela ontogênica, a remoção eficaz dos embriões e larvas das suas cápsulas de ovos, a aplicação de um tratamento de proteinase-K apropriado para cada janela ontogênica, e hibridação, de pós-hibridação e imunodetecção passos. Estes métodos proporcionam uma base a partir da qual o sinal resultante para um dado transcrito de ARN pode ser adicionalmente refinado com ajustes específicos de sonda (sonda principalmente a concentração e a temperatura de hibridação).

Os padrões de coloração WMISH representante mostrados na Figura 3 foram geradas utilizando a técnica acima descrita, e refletem uma variedade de padrões de expressão espacial para genes envolvidos em uma variedade de processos moleculares que variam de formação de concha (novo gene 1, 2, 3 e 4), à sinalização célula-célula (DPP) para regulação da transcrição (Brachyury) através de uma série de estágios de desenvolvimento. Embora não te...

O objetivo deste protocolo é fornecer aos usuários um conjunto de métodos para a descapsulação de alto rendimento de embriões e larvas de Lymnaea stagnalis em preparação para hibridização in situ de montagem inteira e para tratamentos subsequentes de pré e pós-hibridização.

A Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Método de hibridação para o molusco gastrópode<em&gt; stagnalis Lymnaea</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

O objetivo geral deste protocolo é visualizar de forma eficiente os padrões espaciais de expressão de genes individuais em preparações inteiras de embriões e larvas do gastrópode de água doce Lymnaea stagnalis. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de Evo-Devo e biologia do desenvolvimento, como onde e quando os genes são expressos, como interagem entre si e quais podem ser suas funções preditivas. A principal vantagem desta técnica é que a remoção de material embrionário e larval de suas cápsulas de ovo é rápida, fácil e eficaz.Esse material é então categorizado de acordo com um mapa de desenvolvimento que fornecemos no material suplementar e, em seguida, processado por etapas pré-hibridização específicas para cada estágio. Para iniciar este procedimento, conecte uma seringa descartável de 20 mililitros a uma tubulação de silicone. Em seguida, fixe com fita uma lâmina de microscópio padrão a uma grande placa de Petri invertida.Em seguida, fixe o tubo de silicone imediatamente ao lado da lâmina de microscópio com fita adesiva. Depois disso, coloque uma agulha de vidro puxada sobre a lâmina de microscópio. E insira-a suavemente no tubo de silicone até que a ponta da agulha protruda aproximadamente 20% do diâmetro interno do tubo.Uma vez que a agulha esteja na posição, fixe-a com fita ao recipiente de Petri. Deixe a extremidade livre do tubo de silicone repousar em outro recipiente de Petri que coletará o material desencapsulado. Para coletar as linhagens de ovos das paredes de um aquário, utilize um pedaço de plástico plano e flexível como espátula para raspar a linhagem de ovos do substrato.E utilize um escorredor de plástico para retirar a linhagem de ovos flutuante da água. Em seguida, classifique e separe o material sob o microscópio de acordo com este guia. Coloque a linhagem de ovos sobre uma toalha de papel e faça uma incisão longitudinal ao longo da massa de ovos usando pinças leves.Em seguida, retire as cápsulas dos ovos da camada de ovos e remova o máximo possível do material gelatinoso de cada cápsula, movendo-a sobre o papel toalha. Depois, utilizando a pinça de precisão, transfira as cápsulas de ovos para uma placa de Petri contendo 5 mililitros de água da torneira. Continue a coletar as cápsulas de ovos despeliculadas dos estágios de desenvolvimento desejados nesta placa.Colete cápsulas suficientes de todos os estágios de desenvolvimento para o experimento de WMISH planejado antes de prosseguir para o próximo passo. Agora, relaxe larvas com mais de cinco dias após a primeira clivagem em uma solução de cloreto de magnésio hexaidratado a 2% peso por volume durante 30 minutos antes da fixação. Após 30 minutos, avalie o grau de relaxamento submergindo várias larvas ainda em suas cápsulas de ovo na solução fixadora e monitorando sua resposta sob microscópio.Larvas relaxadas de forma incompleta retrair-se-ão para dentro de suas conchas. Enquanto larvas totalmente relaxadas não responderão. Uma vez que essas larvas tenham sido relaxadas, transfira as cápsulas ovígeras utilizando uma pipeta plástica de grande orifício para um tubo selável que ofereça um volume dez vezes maior que o das cápsulas ovígeras.Em seguida, aspire o máximo de líquido possível do tubo e substitua-o pela solução fixadora, que deve ser 10 vezes o volume dos cistos de ovos sedimentados. Gire suavemente os cistos de ovos na solução fixadora à temperatura ambiente pelo tempo apropriado para cada estágio de desenvolvimento. Em seguida, interrompa a rotação e deixe os cistos sedimentarem.Aspire a solução fixadora para um recipiente apropriado de resíduos. Lave as cápsulas ovulares substituindo a solução fixadora por PBTw e girando-as à temperatura ambiente durante cinco minutos.Aspire o PBTw e lave mais duas vezes. Depois disso, remova os embriões e larvas de suas cápsulas utilizando o aparelho. Recolha as cápsulas em uma seringa de 20 mililitros.Em seguida, acople a seringa ao tubo. Expulse as cápsulas através do tubo e da agulha de vidro para o recipiente de coleta. Posteriormente, colete os embriões e larvas desencapsulados em um tubo de 1,5 mililitro utilizando uma pipeta micrométrica.Posteriormente, desidrate e armazene o material fixado ou realize os passos de Proteinase K, TEA e pós-fixação. Após a conclusão desses passos, pré-hibridize brevemente o material e adicione os riboprobes. A importância de um tratamento adequado com Pro K para os resultados finais de um experimento in situ é fundamental para Lymnaea stagnalis.Isso se reflete em uma ampla faixa de concentrações de Pro K necessárias para diferentes estágios de desenvolvimento, variando de 0 a 500 microgramas por mil. Durante a hibridização, retire um único tubo do bloco de aquecimento. Gire-o rapidamente entre o polegar e o indicador para suspender as larvas sem perturbar a fase oleosa, e retorne-o ao bloco de aquecimento.Repita este procedimento a cada seis a 12 horas. Os padrões de expressão gênica mostrados aqui foram gerados usando larvas de diversas fases de desenvolvimento. E todas as amostras foram montadas e imagiadas em Murray's Clear.As idades aproximadas são indicadas no canto superior direito de cada imagem. A orientação da vista é indicada no canto inferior direito, e a ortologia gênica é indicada no canto inferior esquerdo. Esses resultados ilustram os padrões de expressão de genes envolvidos em uma variedade de processos moleculares, que vão desde a formação da concha até a transcrição e a sinalização entre células.Em todos os casos, é visível um padrão de coloração celular único e claro, e os resultados são altamente consistentes entre larvas individuais dentro de um experimento e altamente reprodutíveis entre experimentos. Uma vez dominada, a técnica exige menos de dois dias de tempo total de manipulação. A maior parte do tempo é gasta na coleta e preparação de material embrionário e larval para hibridização e na obtenção das imagens dos resultados.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que cada riboproba provavelmente exigirá ajustes sutis em parâmetros importantes, como a temperatura de hibridização, a concentração da sonda e a duração da hibridização. Após seu desenvolvimento, esta técnica permitiu-nos caracterizar de forma razoável um conjunto de genes envolvidos na formação da concha, que haviam sido identificados por triagens transcriptômicas e proteômicas anteriores.

a-whole-mount-situ-hybridization-method-for-gastropod-mollusc-lymnaea

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo de hibridização in situ em preparação inteira discute etapas críticas que garantem resultados de alta qualidade e reprodutíveis para estudos de expressão gênica em embriões de camundongo com idade entre E8,5 e E11,5 dias.

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

Neste vídeo, mostramos um método de produção de uma população sincronizada com o desenvolvimento de C. elegans adultos estéreis. O protocolo de exemplo sincroniza vermes para estudar as taxas de consumo de oxigênio em animais vivos.

Sincronização de nematóides: um método para obter populações de vermes em estágios idênticos de desenvolvimento

Através da combinação de métodos para a montagem de toda...

RNA<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridação em embriões de Mount inteiros e histologia de células Adaptado para Elasmobrânquios Marinhos

Mudanças induzidas pela pesca para a pesca de crustáceos explorados, tais como a pesca de lagosta americano, poderia influenciar a sua dinâmica reprodutiva, levando a uma redução no sucesso de acasalamento. O objetivo deste estudo foi desenvolver um método não invasivo para determinar o sucesso de acasalamento de lagostas fêmeas que podem ser fisiologicamente ou funcionalmente maduro.

Um método não invasivo para<em&gt; Em situ</em&gt; Determinação do sucesso de acasalamento em fêmeas lagostas americanas (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

Este protocolo de vídeo demonstra um método para estudar os efeitos do fluido seminal em gastrópodes, usando o caracol hermafrodita de água doce Lymnaea stagnalis.

Efeito do Masculino Acessório Gland produtos em postura de ovos em gastrópode

O diagnóstico de infecção por Eimeria em galinhas continua exigente. As abordagens baseadas na morfologia do parasita e na patologia do hospedeiro são comumente inconclusivas, enquanto as abordagens moleculares baseadas em PCR provaram ser exigentes em custo e experiência. O objetivo deste protocolo é estabelecer a amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP) como um diagnóstico molecular direto para infecção eimeriana.

Isothermal amplificação (lâmpada), Ensaios mediada por loop para detecção específica da espécie os de<em&gt; Eimeria</em&gt; Que infectam Galinhas

Este protocolo permite a visualização da expressão gênica em embrionárias Astyanax cavefish. Esta abordagem foi desenvolvida com o objetivo de maximizar o sinal de expressão do gene, minimizando a coloração de fundo específico.

Hibridização In Situ de Embriões Inteiros de Astyanax

O objetivo deste protocolo é genótipo o vectensis do nematostella do Anemone de mar durante o gastrulação sem sacrificar o embrião.

Genotyping de Anemone de mar durante o desenvolvimento adiantado

A conservação do mexilhão de água doce depende do monitoramento de padrões reprodutivos e processos de espécies. Este estudo padroniza um protocolo não letal para amostragem de conteúdo de brânquias, caracterizando o desenvolvimento larval e fornecendo um repositório digital para os dados coletados. Este pacote de protocolo-banco de dados será uma ferramenta importante para pesquisadores de mexilhão na recuperação de espécies imperadas.

Padronizar um método não letal para caracterizar o estado reprodutivo e o desenvolvimento larval de mexilhões de água doce (Bivalvia: Unionida)

O artigo apresenta métodos para cultura larval do gastrópode Crepidula fornicata em um sistema de pequeno volume em escala laboratorial e em um sistema de mesocosmo ambiente-água do mar que pode ser implantado no campo.

Cultura de Laboratório e de Campo de Larvas de Lapa Chinelo ( Crepidula fornicata

Aprenda a técnica de hibridização in situ em montagem total para visualizar padrões de expressão gênica em embriões e larvas de Lymnaea stagnalis. Este método permite estudar biologia do desenvolvimento e Evo-Devo com alta eficiência.

A Monte Whole

Explorar mais vídeos