Investigando a função de Coronin A no Precoce fome resposta de

O objetivo geral deste procedimento experimental é investigar a resposta precoce à privação de nutrientes dependente da Coronina-A em Dictyostelium discoideum. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da Biologia do Desenvolvimento, como a identificação de vias de sinalização e fatores envolvidos no desenvolvimento inicial de Dictyostelium discoideum. A principal vantagem desta técnica é que ela tem o potencial de fornecer uma ferramenta para triagem automatizada e em alto rendimento de fatores indutores de desenvolvimento e proteínas envolvidas na sinalização do desenvolvimento inicial.

Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido às múltiplas variáveis inerentes ao ensaio, como densidades celulares, tempo de aderência e tempo de desenvolvimento. Para iniciar este procedimento, cultive células DH1.10 ou células deficientes em corA em um frasco Erlenmeyer contendo meio HL-5, a 22 graus Celsius, em um incubador agitador a 160 rpm. Mantenha as células numa densidade entre 1 × 10⁴ e 2 × 10⁶ células por mililitro.

Para analisar a agregação celular, colete de 10 a 50 mililitros de células DH1.10 em fase logarítmica de crescimento ou células deficientes em corA geradas no background DH1.10. Centrifugue-as por três minutos a 400 ×g. Em seguida, lave as células duas vezes em BSS.

Posteriormente, conte as células utilizando um hemocitômetro. Em seguida, plaque as células em uma placa de 24 poços. Deixe-as aderirem por uma hora a 22 graus Celsius em BSS.

Em seguida, visualize a agregação celular por microscopia de lapso de tempo e capture imagens a cada 135 segundos. Para examinar o efeito dos pulsos de AMP cíclico aplicados externamente no desenvolvimento de células DH1.10 ou células deficientes em corA DH1.10, colete 10 a 50 mililitros das células e centrifugue-as por três minutos a 400 ×g. Depois disso, lave-as duas vezes em BSS.

Conte as células utilizando um hemocitômetro. Em seguida, re-suspenda as células em uma densidade de um vezes 10 elevado a sete células por mililitro em BSS. Então, agite os cultivos a 22 graus Celsius por duas horas a 160 rpm antes de aplicar os pulsos.

Em seguida, aplique pulsos de AMP cíclico utilizando uma bomba peristáltica controlada por temporizador. Configure a bomba para fornecer um pulso de cinco segundos de AMP cíclico a cada seis minutos e meio, durante um período de cinco horas. Um passo crítico é garantir que a ponta da injeção de AMP cíclico não permaneça continuamente submersa na solução, mas apenas submersa periodicamente nas ondas geradas pelo agitador.

Após a aplicação de AMP cíclico, conte novamente as células usando um hemocitômetro. Em seguida, plaque as células em uma placa de 24 poços e deixe-as aderirem por uma hora em BSS. Após 16 horas, visualize a agregação celular a 22 graus Celsius, utilizando microscopia de campo claro com uma objetiva de cinco x.

Neste procedimento, prepare meio condicionado fresco coletando células DH1.10 em fase logarítmica ou células deficientes em corA DH1.10 a partir de culturas agitadas em meio HL5, a 22 graus Celsius. Centrifugue as células por três minutos a 400 vezes g. Em seguida, lave-as três vezes em PBM.

Posteriormente, conte as células utilizando um hemocitômetro. Em seguida, re-suspenda-as em PBM numa densidade de um vezes 10 elevado a sete células por mililitro e agite-as por 20 horas a 22 graus Celsius e 110 rpm. A seguir, centrifugue as células a 400 vezes g durante três minutos, seguido pela coleta do meio condicionado. Posteriormente, clarifique o meio por centrifugação a 8.000 vezes g durante 15 minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, filtre o meio condicionado através de um filtro de 0,45 micrômetro e dilua-o três vezes em PBM. Conte as células utilizando um hemocitômetro, plaque-as em uma placa de 24 poços e deixe-as aderir por uma hora a 22 graus Celsius. Em seguida, substitua o sobrenadante das células por um meio condicionado previamente preparado.

Após 16 horas, visualize a agregação celular por microscopia de campo claro utilizando uma objetiva de cinco x. Aqui, as células deficientes em Coronina-A apresentam um defeito no desenvolvimento inicial e são incapazes de formar agregados multicelulares, que é a etapa inicial do ciclo de desenvolvimento de Dictyostelium discoideum. Nesta figura, as células selvagens vegetativas e as células deficientes em corA foram lavadas e submetidas à privação de nutrientes por duas horas antes de serem pulsadas, com ou sem 15 animal ou AMP cíclico, a cada seis minutos e meio durante cinco horas em suspensão.

A aplicação de pulsos exógenos de AMP cíclico restaurou completamente o fenótipo Selvagem. Nesta figura, células Selvagem e deficientes em corA em crescimento exponencial foram lavadas em PBM, semeadas em placas de múltiplos poços e incubadas em meio condicionado obtido de células Selvagem ou deficientes em corA em estado de privação. As imagens foram obtidas 16 horas após a semeadura das células.

Dictyostelium discoideum deficientes em corA foram capazes de produzir todos os fatores necessários para a indução do desenvolvimento, mas não conseguiram responder a eles. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 20 horas, incluindo o tempo de incubação, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que, para diferentes cepas, será necessário ajustar múltiplas variáveis do ensaio, como densidades celulares, tempo de aderência e tempo de desenvolvimento.

Após este procedimento, pode-se realizar a fracionamento bioquímico e subsequente análise proteômica para identificar fatores envolvidos na resposta inicial à privação de nutrientes em Dictyostelium discoideum. Após assistir a este vídeo, deve-se ter uma boa compreensão de como induzir o desenvolvimento inicial em Dictyostelium discoideum em condições submersas, utilizando meios condicionados ou pulsos de adenosina monofosfato cíclico.