Investigando a função de Coronin A no Precoce fome resposta de Dictyostelium discoideum Por agregação Ensaios

O objetivo geral deste procedimento experimental é investigar a resposta de fome precoce dependente de Coronina-A de Dictyostelium discoideum. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da Biologia do Desenvolvimento, como a identificação de vias de sinalização e fatores envolvidos no desenvolvimento inicial de Dictyostelium discoideum. A principal vantagem dessa técnica é que ela tem o potencial de fornecer uma ferramenta para triagem automatizada e de alto rendimento de fatores indutores de desenvolvimento e proteínas envolvidas na sinalização inicial do desenvolvimento.

Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades devido a múltiplas variáveis inerentes ao ensaio, como densidades celulares, tempo de adesão e tempo de desenvolvimento. Para iniciar este procedimento, cultive células DH1.10 ou células deficientes em corA em um frasco Erlenmeyer contendo meio HL-5, a 22 graus Celsius, em uma incubadora agitada a 160 rpm. Mantenha as células em uma densidade entre 10 a quatro e duas vezes 10 a seis células por mililitro.

Para examinar a agregação celular, colha de 10 a 50 mililitros de células DH1.10 de crescimento em fase logarítmica ou células deficientes em corA geradas no fundo DH1.10. Centrifugue-os por três minutos a 400 vezes g. Em seguida, as células duas vezes estavam em BSS.

Em seguida, conte as células usando um hemocitômetro. Posteriormente, coloque as células em uma placa de 24 poços. Deixe-os aderir por uma hora a 22 graus Celsius em BSS.

Em seguida, visualize a agregação celular com microscopia de lapso de tempo e tire imagens a cada 135 segundos. Para examinar o efeito dos pulsos de AMP cíclico aplicados externamente no desenvolvimento de células DH1.10, ou células deficientes em corA DH1.10, colha de 10 a 50 mililitros das células e centrifugue-as por três minutos a 400 vezes g. Depois disso, lave-os duas vezes em BSS.

Conte as células usando um hemocitômetro. Posteriormente, ressuspenda as células a uma densidade de uma vez 10 elevado a sete células por mililitro em BSS. Em seguida, agite as culturas a 22 graus Celsius por duas horas a 160 rpm antes de aplicar os pulsos.

Em seguida, aplique pulsos cíclicos de AMP usando uma bomba peristáltica controlada por temporizador. Programe a bomba para fornecer um pulso de cinco segundos de AMP cíclico a cada seis minutos e meio durante um período de cinco horas. Uma etapa crítica é garantir que a ponta da injeção cíclica de AMP não seja continuamente submersa na solução, mas apenas submersa periodicamente nas ondas geradas pelo agitador.

Após a aplicação do AMP cíclico, conte as células novamente usando um hemocitômetro. Em seguida, coloque as células em uma placa de 24 poços e deixe-as aderir por uma hora em BSS. Após 16 horas, visualize a agregação celular a 22 graus Celsius, com microscopia de campo claro usando um subjetivo de cinco x.

Neste procedimento, preparar meio fresco condicionado, recolhendo células DH1.10 em fase logarítmica ou células deficientes em DH1.10 corA das culturas agitadas com meio HL5, a 22 graus Celsius. Centrifugue as células por três minutos a 400 vezes g. Depois disso, lave-os três vezes em PBM.

Posteriormente, conte as células usando um hemocitômetro, Em seguida, ressuspenda-as em PBM a uma densidade de uma vezes 10 elevado a sete células por mililitro e agite-as por 20 horas a 22 graus Celsius a 110 rpm. Em seguida, centrifugue as células a 400 vezes g por três minutos, seguido da coleta do meio condicionado. Em seguida, clareie o meio por centrifugação a 8.000 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, filtre o meio condicionado através de um filtro de 0,45 micrômetro e dilua-o três vezes em PBM. Conte as células usando um hemocitômetro, coloque-as em uma placa de 24 poços e deixe-as aderir por uma hora a 22 graus Celsius. Em seguida, troque o sobrenadante das células por um meio condicionado previamente preparado.

Após 16 horas, visualize a agregação celular com microscopia de campo claro usando um subjetivo de cinco x. Aqui, as células deficientes em Coronina-A mostram um defeito no desenvolvimento inicial e foram incapazes de formar agregados multicelulares, que é o passo inicial durante o ciclo de desenvolvimento de Dictyostelium discoideum. Nesta figura, o tipo selvagem vegetativo e as células deficientes em corA foram lavadas e morreram de fome por duas horas antes de serem pulsadas com ou sem 15 AMP animal ou cíclico, a cada seis minutos e meio por cinco horas em suspensão.

A aplicação de pulsos de AMP cíclico exógeno restaurou totalmente o fenótipo do tipo Wild. Nesta figura, células do tipo selvagem e deficientes em corA de crescimento exponencial foram lavadas em PBM, semeadas em placas de poços múltiplos e incubadas em meio condicionado obtido do tipo selvagem ou células famintas com deficiência de corA. As imagens foram tiradas 16 horas após a semeadura das células.

Dictyostelium discoideum deficiente em corA, foram capazes de produzir todos os fatores necessários para a indução do desenvolvimento, mas foram incapazes de responder a eles. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 20 horas, incluindo o tempo de incubação, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que, para diferentes cepas, será necessário um ajuste de múltiplas variáveis do ensaio, como densidades celulares, tempo de adesão, tempo de desenvolvimento.

Após este procedimento, o fracionamento bioquímico e a subsequente análise proteômica podem ser realizados para identificar fatores envolvidos na resposta precoce à fome de Dictyostelium discoideum. Depois de assistir a este vídeo, deve-se ter uma boa compreensão de como induzir o desenvolvimento inicial em Dictyostelium discoideum sob condições submersas, usando meios condicionados, bem como pulsos de AMP cíclicos.