Name: Investigando a função de Coronin A no Precoce fome resposta de Dictyostelium discoideum Por agregação Ensaios (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprenda ensaios de agregação para investigar a função da coronina A na resposta à fome precoce de Dictyostelium discoideum. Este método permite identificar vias de sinalização no desenvolvimento multicelular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos ao Dictyostelium Stock Center pelas cepas e reagentes. Este estudo foi financiado por doações da Fundação Nacional de Ciências da Suíça e do Cantão de Basileia.

<ol><li> Observe a resposta de fome precoce de Dictyostelium discoideum por microscopia de lapso de tempo. <ol><li> Cultivar células DH1.10 ou células cora -deficient num balão de Erlenmayer contendo HL-5 meio (para 1 L: 5 g de proteose peptona, 5 g thiotone E peptona, 10 g de glicose, 5 g de extracto de levedura, 0,35 g de Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, 0,35 g de KH 2 PO 4, 0,05 g de sulfato de di-hidroestreptomicina-, pH 6,6) a 22 ° C numa incubadora com agitação com uma rotação de 160 rpm. Manter as células a uma densidade entre 0.01 x 10 6 células / ml e 2 x 10 6 culas / ml. </li><li> Examinar a agregação de células, por meio da colheita de log-fase de cultivo de células DH1.10 21 ou cora as células -deficient 10 gerado no fundo DH1.10, crescidas em cultura com agitação com HL-5 forma a 22 ° C. Para fazer isso, tomar uma quantidade apropriada de células (normalmente entre 10 e 50 ml), centrifuga-se durante 3 min a 400 xg e lavar as células duas vezes em BSS (10 mM de NaCl, 10 mM de KCl, CaCl 2 2,5 mM, pH 6,5). </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Subsequentemente, as células em placas a uma densidade de (5, 10, 20, ou 40) 4 x 10 células / cm2 numa placa de 24 poços. Permitir-lhes a aderir durante 1 hora a 22 ° C no BSS. </li><li> Visualize a agregação por microscopia de lapso de tempo, tal como descrito antes de 10, a tomada de imagens a cada 135 segundos. utilizando uma imagem de células vivas configurar equipada com objectiva 5X e uma câmara de dispositivo de carga acoplada de multiplicação de electrões automatizado pelo software adequado (ver Materiais Tabela). </li></ol></li><li> pulsante AMPc das células Dictyostelium discoideum durante inanição. <ol><li> Examinar o efeito de impulsos de cAMP aplicados externamente sobre o desenvolvimento de células DH1.10 21 ou DH1.10 Cora -deficient células 10, por colheita de células. Para fazer isso, tomar uma quantidade apropriada de células (normalmente entre 10 e 50 ml), centrifuga-se durante 3 min a 400 xg e lavar duas vezes em BSS. </li><li> Count células utilizando um hemocitómetro e ressuspender as células a uma densidade de 1 x 10 7 células / mL em BSS. Agitar as culturas (160 rpm) a 22 ° C durante 2 h antes de aplicar pulsos. Adicionar pulsos de cAMP utilizando uma bomba peristáltica controlado temporizador. Programar a bomba para fornecer um impulso de 5 segundos a cada 6,5 ​​min de 15 uL de 50 nM de cAMP (concentração final) durante um período de 5 horas. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Subsequentemente, a chapa células a uma densidade de (5, 10, 20, ou 40) 4 x 10 células / cm2 numa placa de 24 poços. Permitir a aderir durante 1 h em BSS. </li><li> Visualizar a agregação após 16 horas a 22 ° C por microscopia de campo brilhante utilizando uma objectiva de 5x. </li></ol></li><li> Indução de Dictyostelium discoideum desenvolvimento através da exposição ao meio condicionado. <ol><li> Prepare meio condicionado fresco como descrito 22. Coletar células DH1.10 de fase log 21 ou DH1.10 Cora -deficient células 10, de tremer cultmentos com HL-5 forma a 22 ° C, utilizando uma pipeta, centrifuga-se durante 3 min a 400 xg e lavar as células três vezes em PBM (fosfato de potássio 0,02 M, 10 mM de CaCl2, e 1 mM de MgCl2, pH 6,1). </li><li> Células utilizando um hemocitómetro Contagem, ressuspender estas em PBM a uma densidade de 1 x 10 7 células / ml e agita-se durante 20 h a 110 rpm / 22 ° C. </li><li> Recolhe meio condicionado após a centrifugação a 400 x g durante 3 min e clarificar por centrifugação a 8000 × g durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Filtrar o meio condicionado através de um filtro de 0,45 um (ver Tabela Materiais) e dilui-se três vezes em PBM. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro e placa a uma densidade de (5, 10, 20, ou 40) 4 x 10 células / cm2 numa placa de 24 poços. Lhes permitem aderir durante 1 hora a 22 ° C. </li><li> Troca de sobrenadante das células com o meio condicionado previamente preparada. </li><li> Visualize a agregação de umepois de 16 horas por microscopia de campo brilhante usando uma objetiva de 5X. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Weijer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenetic+cell+movement+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphogenetic cell movement in Dictyostelium.</a> Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).</li>
<li>Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictyostelium+discoideum%3A+a+model+system+for+cell-cell+interactions+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development.</a> Science. 245, 1054-1058 (1989).</li>
<li>Kimmel, A. R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+signal+transduction+pathways+regulating+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum.</a> Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).</li>
<li>Clarke, M., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSF+and+CMF%2C+autocrine+factors+that+regulate+gene+expression+during+growth+and+early+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium.</a> Experientia. 51, 1124-1134 (1995).</li>
<li>Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Aggregation+in+Dictyostelium+discoideum+by+an+External+Periodic+Pulse+of+Cyclic+Adenosine+Monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate.</a> Science. 175, 333-335 (1972).</li>
<li>Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cyclic+AMP+in+Dictyostelium+discoideum+and+Polysphondylium+pallidum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum.</a> Nature. 224, 1211-1212 (1969).</li>
<li>Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analyses+of+gene+regulation+during+early+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum.</a> Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).</li>
<li>Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+signals+induce+cell+differentiation+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).</li>
<li>Mann, S. K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+regulation+of+early+gene+expression+in+Dictyostelium+discoideum%3A+mediation+via+the+cell+surface+cyclic+AMP+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor.</a> Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).</li>
<li>Vinet, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+multicellular+differentiation+in+Dictyostelium+discoideum+is+regulated+by+coronin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A.</a> Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).</li>
<li>Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+holistic+phylogeny+of+the+coronin+gene+family+reveals+an+ancient+origin+of+the+tandem-coronin%2C+defines+a+new+subfamily%2C+and+predicts+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function.</a> BMC Evol Biol. 11, 268(2011).</li>
<li>Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+guard%3A+coronin+proteins+in+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity.</a> Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).</li>
<li>Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+Leukocyte+Plasma+Membrane+with+the+Actin+Cytoskeleton+through+Coiled+Coil-mediated+Trimeric+Coronin+1+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules.</a> Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).</li>
<li>Kammerer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+trimerization+motif+controls+the+topology+of+short+coiled+coils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).</li>
<li>Uetrecht, A. C., Bear, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronins%3A+the+return+of+the+crown%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coronins: the return of the crown.</a> Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).</li>
<li>Jayachandran, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin+1+Regulates+Cognition+and+Behavior+through+Modulation+of+cAMP%2FProtein+Kinase+A+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling.</a> PLoS Biol. 12, e1001820(2014).</li>
<li>Suo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin-1+is+a+neurotrophin+endosomal+effector+that+is+required+for+developmental+competition+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival.</a> Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).</li>
<li>Mueller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cell+survival+through+coronin-1-mediated+generation+of+inositol-1%2C4%2C5-trisphosphate+and+calcium+mobilization+after+T+cell+receptor+triggering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering.</a> Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).</li>
<li>de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin%2C+an+actin+binding+protein+of+Dictyostelium+discoideum+localized+to+cell+surface+projections%2C+has+sequence+similarities+to+G+protein+beta+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits.</a> EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).</li>
<li>Shina, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+and+unique+roles+of+coronin+proteins+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium.</a> Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).</li>
<li>Cornillon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phg1p+is+a+nine-transmembrane+protein+superfamily+member+involved+in+dictyostelium+adhesion+and+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).</li>
<li>Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+80+x+10%283%29+Mr+protein+mediates+sensing+of+cell+density+and+the+onset+of+development+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium.</a> Development. (112), 269-278 (1991).</li>
<li>Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteinous+factor+mediating+intercellular+communication+during+the+transition+of+Dictyostelium+cells+from+growth+to+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+science%22%5BJournal%5D)">A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation.</a> Zoological science. 12, 61-69 (1995).</li>
<li>Mehdy, M. C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+factor+and+cyclic+AMP+jointly+regulate+cell-type-specific+gene+expression+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum.</a> Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).</li>
<li>Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+density-sensing+factor+controls+development+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A density-sensing factor controls development in Dictyostelium.</a> Genes Dev. 6, 390-400 (1992).</li>
<li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Dev Biol. 391, 1-16 (2014).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

As proteínas coronin são encontrados na maioria dos taxa do clado eucariótica. Dictyostelium discoideum coronin A, o homólogo de coronin mamíferos 1, está envolvida na resposta de fome precoce, uma vez que coronin Um deficiente em células não são capazes de formar centros de agregação durante o início do desenvolvimento ciclo 10. Para ser capaz de avaliar quantitativamente e com precisão o atraso no desenvolvimento entre as cepas, um microscópio imagens de células vivas set-up com o controlador de es...

A família de proteínas coronin é altamente conservada durante toda eucariotas. Estas proteínas são caracterizadas pela presença de um triptofano-aspartato amino-terminal (WD) região seguido por uma região única ligado a um domínio em espiral espiralada carboxi-terminal contendo 13,14 repetir-(Figura 1). Coronins têm sido implicados numa variedade de funções celulares, incluindo a regulação do citoesqueleto e transdução de sinal 12. Nos mamíferos, até seis moléculas curtas coronin coronin (1-6), bem como um &quot;conjunto&quot; coronin 7, pode ser co-expressa 12,15. Coronin um membro da família é o mais extensivamente estudado, e foi mostrado para ser envolvido na destruição de agentes patogénicos, a sobrevivência das células T e sinalização neuronal. Como, exatamente, coronin 1 realiza estas actividades ainda não está claro. Enquanto coronin 1 foi mostrado para regular Ca 2+ e de sinalização dependente de cAMP, bem como de F-actina do citoesqueleto modulação 16-18, o potencial de co-expression de até 7 membros da família em mamíferos tornou-se um desafio para estudar a função molecular de coronins nesses sistemas, devido a potenciais despedimentos. Ao contrário de organismos de mamíferos, o discoideum eucariota Dictyostelium inferior expressa apenas dois membros coronin familiares (coronin A, o ortólogo de mamífero coronin 1 e coronin B, ortï¿½logo de coronin mamíferos 7) com funções aparentemente não redundantes 15,19,20. Este fato faz com Dictyostelium discoideum um modelo potente para estudar a função dos coronins. Para estudar o papel de coronin A em Dictyostelium discoideum, que induziu o ciclo de desenvolvimento pela inanição em placas de cultura de tecidos contendo solução de sal equilibrada tampão (BSS) usando quer células do tipo selvagem ou de células sem coronin Um 10. Descobrimos que as células sem coronin A foram incapazes de formar agregados multicelulares sobre fome. Para uma avaliação quantitativa exacta deste fenótipoimagens de células vivas automatizado descrito neste protocolo é uma ferramenta vital. O defeito na iniciação da resposta de fome no início de células sem coronin A pode ser resgatado por fornecimento de impulsos de AMPc, o que sugere que coronin A actua a montante da cascata do AMPc. A aplicação exógena de impulsos de campo para simular a iniciação do desenvolvimento tem sido utilizado por vários laboratórios no passado 8,9. No entanto, este procedimento é também conhecido por ser altamente dependente da densidade das células e de temporização. Portanto, o protocolo aqui descrito destina-se a reduzir estes variabilidades, a fim de garantir um elevado grau de reprodutibilidade. Tomadas em conjunto, as técnicas utilizadas nestes estudos fornecem ferramentas robustas para investigar as funções das proteínas durante as fases iniciais do ciclo de desenvolvimento de Dictyostelium discoideum e tem o potencial para identificar para cima, bem como efectores a jusante de coronin uma função.

<table><tbody><tr><td>Meio HL-5 (para 1 L: 5 g de peptona de proteose, 5 g de peptona de tiotona E, 10 g de glicose, 5 g de extrato de levedura, 0,35 g de Na2HPO4*2H2O, 0,35 g de KH2PO4, 0,05 g de diidroestreptomicina-sulfato, pH 6,6)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Peptona de proteose</td><td>BD Bioscience</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>Peptona de tiotona E</td><td>BD Bioscience</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>BD Bioscience</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>AppliChem</td><td>A3666</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4*2H2O</td><td>Fluka</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A1043</td><td></td></tr><tr><td>dihidroestreptomicina-sulfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1954000</td><td></td></tr><tr><td>PBM (fosfato de potássio 0,02 M, 10 &mu; M CaCl2 e l mM MgCl2, pH 6,1)</td><td></td><td></td><td>BSS (</td></tr><tr><td>10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, pH 6,5)</td><td></td><td></td><td>auto-fabricado</td></tr><tr><td>0,45-&mu; m Filtro S Filtropure</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Placa de cultura de tecidos de 24 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1H</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Cellobserver</td> Software <td>AxioVision personalizado Zeiss</td><td></td><td></td></tr> Microprocessador <tr><td></td> IPC <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&ndash; bomba de distribuição controlada</td><td>ISMATEC</td><td>ISM 931</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 135M microscópio</td><td>Zeiss</td><td>491237-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de incubação</td><td>Inforst HT Minitron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

investigando a função de coronin a no precoce fome resposta de<em&gt; dictyostelium discoideum</em&gt; por agregação ensaios

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Dictyostelium discoideum ameba são encontrados no solo, alimentando-se de bactérias. Quando as fontes de alimentos se tornam escassos, eles secretam fatores para iniciar um programa de desenvolvimento multicelular, durante o qual células individuais chemotax para os centros de agregação 1-4. Este processo é dependente da libertação de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) 5. O AMPc é produzido em ondas através da acção concertada de adenilato-ciclase e fosfodiesterase, e liga-se a receptores de G cAMP acoplados à proteína 6,7. Um ensaio amplamente utilizado para analisar os mecanismos envolvidos no ciclo de desenvolvimento do Dictyostelium discoideum eucariota inferior é baseado na observação de agregação de células em condições submersas 8,9. Este protocolo descreve a análise do papel de coronin A no ciclo de desenvolvimento pela inanição em placas de cultura de tecidos imersos em solução salina equilibrada (BSS) 10. Coronin A é um membro da PR amplamente conservadaotein família de coronins que têm sido implicados numa grande variedade de actividades 11,12. Dictyostelium células que carecem coronin A são incapazes de formar agregados multicelulares, e este defeito pode ser resgatado por fornecimento de impulsos de AMPc, o que sugere que coronin A actua a montante do cAMP cascata 10. As técnicas descritas nestes estudos fornecem ferramentas robustas para investigar as funções das proteínas durante as fases iniciais do ciclo de desenvolvimento de Dictyostelium discoideum a montante da cascata do AMPc. Assim, a utilização deste ensaio de agregação pode permitir a um estudo mais aprofundado da coronin Uma função e fazer avançar nossa compreensão da biologia coronin.

As células deficientes em coronin Um show de um defeito no desenvolvimento inicial (Figura 2). Na ausência de um coronin células são incapazes de formar agregados multicelulares, que é o passo inicial durante o ciclo de desenvolvimento de Dictyostelium discoideum. Portanto, coronin Um parece desempenhar um papel durante a resposta precoce fome e / ou a sinalização de cAMP. Com efeito, a falta de formação de agregados multicelulares na ausência de coronin A é aco...

A ameba social Dictyostelium discoideum sofre uma transição de desenvolvimento para um organismo multicelular quando morre de fome. A proteína evolutivamente conservada coronina A desempenha um papel crucial no início do desenvolvimento. Usando ensaios de agregação como nosso principal método, pretendemos elucidar o papel da coronina A no desenvolvimento inicial.

Investigando a função de Coronin A no Precoce fome resposta de<em&gt; Dictyostelium discoideum</em&gt; Por agregação Ensaios

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

O objetivo geral deste procedimento experimental é investigar a resposta precoce à privação de nutrientes dependente da Coronina-A em Dictyostelium discoideum. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da Biologia do Desenvolvimento, como a identificação de vias de sinalização e fatores envolvidos no desenvolvimento inicial de Dictyostelium discoideum. A principal vantagem desta técnica é que ela tem o potencial de fornecer uma ferramenta para triagem automatizada e em alto rendimento de fatores indutores de desenvolvimento e proteínas envolvidas na sinalização do desenvolvimento inicial.Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido às múltiplas variáveis inerentes ao ensaio, como densidades celulares, tempo de aderência e tempo de desenvolvimento. Para iniciar este procedimento, cultive células DH1.10 ou células deficientes em corA em um frasco Erlenmeyer contendo meio HL-5, a 22 graus Celsius, em um incubador agitador a 160 rpm. Mantenha as células numa densidade entre 1 × 10⁴ e 2 × 10⁶ células por mililitro.Para analisar a agregação celular, colete de 10 a 50 mililitros de células DH1.10 em fase logarítmica de crescimento ou células deficientes em corA geradas no background DH1.10. Centrifugue-as por três minutos a 400 ×g. Em seguida, lave as células duas vezes em BSS.Posteriormente, conte as células utilizando um hemocitômetro. Em seguida, plaque as células em uma placa de 24 poços. Deixe-as aderirem por uma hora a 22 graus Celsius em BSS.Em seguida, visualize a agregação celular por microscopia de lapso de tempo e capture imagens a cada 135 segundos. Para examinar o efeito dos pulsos de AMP cíclico aplicados externamente no desenvolvimento de células DH1.10 ou células deficientes em corA DH1.10, colete 10 a 50 mililitros das células e centrifugue-as por três minutos a 400 ×g. Depois disso, lave-as duas vezes em BSS.Conte as células utilizando um hemocitômetro. Em seguida, re-suspenda as células em uma densidade de um vezes 10 elevado a sete células por mililitro em BSS. Então, agite os cultivos a 22 graus Celsius por duas horas a 160 rpm antes de aplicar os pulsos.Em seguida, aplique pulsos de AMP cíclico utilizando uma bomba peristáltica controlada por temporizador. Configure a bomba para fornecer um pulso de cinco segundos de AMP cíclico a cada seis minutos e meio, durante um período de cinco horas. Um passo crítico é garantir que a ponta da injeção de AMP cíclico não permaneça continuamente submersa na solução, mas apenas submersa periodicamente nas ondas geradas pelo agitador.Após a aplicação de AMP cíclico, conte novamente as células usando um hemocitômetro. Em seguida, plaque as células em uma placa de 24 poços e deixe-as aderirem por uma hora em BSS. Após 16 horas, visualize a agregação celular a 22 graus Celsius, utilizando microscopia de campo claro com uma objetiva de cinco x.Neste procedimento, prepare meio condicionado fresco coletando células DH1.10 em fase logarítmica ou células deficientes em corA DH1.10 a partir de culturas agitadas em meio HL5, a 22 graus Celsius. Centrifugue as células por três minutos a 400 vezes g. Em seguida, lave-as três vezes em PBM.Posteriormente, conte as células utilizando um hemocitômetro. Em seguida, re-suspenda-as em PBM numa densidade de um vezes 10 elevado a sete células por mililitro e agite-as por 20 horas a 22 graus Celsius e 110 rpm. A seguir, centrifugue as células a 400 vezes g durante três minutos, seguido pela coleta do meio condicionado. Posteriormente, clarifique o meio por centrifugação a 8.000 vezes g durante 15 minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, filtre o meio condicionado através de um filtro de 0,45 micrômetro e dilua-o três vezes em PBM. Conte as células utilizando um hemocitômetro, plaque-as em uma placa de 24 poços e deixe-as aderir por uma hora a 22 graus Celsius. Em seguida, substitua o sobrenadante das células por um meio condicionado previamente preparado.Após 16 horas, visualize a agregação celular por microscopia de campo claro utilizando uma objetiva de cinco x. Aqui, as células deficientes em Coronina-A apresentam um defeito no desenvolvimento inicial e são incapazes de formar agregados multicelulares, que é a etapa inicial do ciclo de desenvolvimento de Dictyostelium discoideum. Nesta figura, as células selvagens vegetativas e as células deficientes em corA foram lavadas e submetidas à privação de nutrientes por duas horas antes de serem pulsadas, com ou sem 15 animal ou AMP cíclico, a cada seis minutos e meio durante cinco horas em suspensão.A aplicação de pulsos exógenos de AMP cíclico restaurou completamente o fenótipo Selvagem. Nesta figura, células Selvagem e deficientes em corA em crescimento exponencial foram lavadas em PBM, semeadas em placas de múltiplos poços e incubadas em meio condicionado obtido de células Selvagem ou deficientes em corA em estado de privação. As imagens foram obtidas 16 horas após a semeadura das células.Dictyostelium discoideum deficientes em corA foram capazes de produzir todos os fatores necessários para a indução do desenvolvimento, mas não conseguiram responder a eles. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 20 horas, incluindo o tempo de incubação, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que, para diferentes cepas, será necessário ajustar múltiplas variáveis do ensaio, como densidades celulares, tempo de aderência e tempo de desenvolvimento.Após este procedimento, pode-se realizar a fracionamento bioquímico e subsequente análise proteômica para identificar fatores envolvidos na resposta inicial à privação de nutrientes em Dictyostelium discoideum. Após assistir a este vídeo, deve-se ter uma boa compreensão de como induzir o desenvolvimento inicial em Dictyostelium discoideum em condições submersas, utilizando meios condicionados ou pulsos de adenosina monofosfato cíclico.

investigating-function-coronin-early-starvation-response

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Para estudar a relação entre homeostase proteica, estresse e envelhecimento, monitoramos as mudanças no dobramento proteico acompanhando a disfunção proteica, a localização da proteína na célula e a estabilidade proteica nos níveis organismo, celular e proteico, usando o metazoário geneticamente tratável Caenorhabditis elegans como sistema modelo.

Usando Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para estudar a homeostase de proteínas em um organismo multicelular

Este artigo descreve um ensaio baseado no crescimento de leveduras para a determinação dos requisitos genéticos para a degradação de proteínas. Ele também demonstra um método para extração rápida de proteínas de levedura, adequado para western blotting para confirmar bioquimicamente os requisitos de degradação. Essas técnicas podem ser adaptadas para monitorar a degradação de uma variedade de proteínas.

Determinação baseado no crescimento e confirmação bioquímica de Requisitos Genéticos para a degradação de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Este estudo descreve técnicas biofísicas, bioquímicos e moleculares que caracterizam a actividade acompanhante de Escherichia coli HdeB sob condições de pH ácido. Estes métodos têm sido aplicados com sucesso para outras chaperonas ácido-protectores, tais como HdeA e pode ser modificado para funcionar com os outros acompanhantes e condições de stress.

Detecção da actividade de dependente do pH<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

As amebas sociais Dictyostelium discoideum foram recentemente estabelecidas como um sistema para estudar o desdobramento de proteínas e a proteostase. Aqui, descrevemos uma nova metodologia baseada em imagens para estudar a agregação de proteínas induzida pela temperatura e a resposta ao estresse celular em D. discoideum.

Estudando a Proteína de Qualidade Sistema de Controle de<em&gt; D. discoideum</em&gt; Usando temperatura controlada Imagens ao vivo celular

Aqui descrevemos os métodos para avaliar a resposta celular à estimulação mecânica aguda. No ensaio baseado em microscopia, examinamos a localização de biosensores fluorescente-etiquetadas após estimulação breve com fluxo de cisalhamento. Também testamos a ativação de várias proteínas de interesse em resposta à estimulação mecânica aguda bioquimicamente.

Avaliação de Dictyostelium discoideum resposta à estimulação mecânica aguda

O objetivo do método apresentado aqui é explorar a agregação da proteína durante o envelhecimento normal no organismo modelo c. elegans. O protocolo representa uma poderosa ferramenta para estudar os agregados grandes altamente insolúveis que formam com a idade e para determinar como as alterações em proteostasis impactam agregação da proteína.

Métodos de estudo mudanças na agregação de proteínas inerente com a idade em Caenorhabditis elegans

Macropinocitose, em grande escala absorção de fluido não-específica, é importante em muitas áreas da patologia clínica, incluindo Imunologia, infecção, câncer e doenças neurodegenerativas. Aqui, as técnicas existentes foram adaptadas para permitir a resolução alta produtividade, célula única medição de macropinocitose no macropinocitose modelo organismo Dictyostelium discoideum utilizando citometria de fluxo.

Medição do elevado-throughput de Dictyostelium discoideum macropinocitose por citometria de fluxo

Para estudar as interações acompanhante-acompanhante e acompanhante-substrato, realizamos telas de interação sintética em elegans caenorhabditis usando interferência de RNA em combinação com mutações leves ou sobre-expressão de acompanhantes e monitorar disfunção proteica específica do tecido no nível do organismo.

Usando elegans caenorhabditis para tela para interações de acompanhantes específicas de tecido

Este protocolo descreve a extração e visualização de proteínas agregadas e solúveis de Escherichia coli após o tratamento com um antimicrobiano proteotóxico. Após este procedimento permite uma comparação qualitativa da formação de agregado de proteínas in vivo em diferentes cepas bacterianas e/ou entre os tratamentos.

Extração e Visualização de Agregados proteicos após tratamento de Escherichia coli com um Estressor Proteotóxico

O protocolo a seguir descreve o desenvolvimento e otimização de um fluxo de trabalho de alto rendimento para cultivo de vermes, imagens de fluorescência e processamento automatizado de imagens para quantificar agregados de poliglutamina como uma avaliação de mudanças na proteostase.

Automatizando quantificação agregada em caenorhabditis elegans

Aqui, é apresentado um método para a análise da cinética de agregação de proteínas no nematode Caenorhabditis elegans. Animais de uma população sincronizada por idade são imagens em diferentes momentos, seguidos pela contagem de inclusão semiatomada no CellProfiler e adaptação a um modelo matemático em Amilafit.

Monitorando Cinética de Agregação de Proteínas In Vivo usando Contagem Automatizada de Inclusão em Elegans Caenorhabditis

Aprenda ensaios de agregação para investigar a função da coronina A na resposta à fome precoce de Dictyostelium discoideum. Este método permite identificar vias de sinalização no desenvolvimento multicelular.

Investigando a função de Coronin A no Precoce fome resposta de

Explorar mais vídeos