Avaliação simultânea de Cardiomyocyte DNA Síntese e Ploidia: Um Método de Assistência Quantificação dos cardiomiócitos Regeneração e volume de negócios

O objetivo geral deste protocolo é quantificar a renovação dos cardiomiócitos usando marcação de nucleosídeos de longo prazo e citometria de fluxo para quantificar os núcleos de neocardiomiócitos enquanto contabiliza a poliploidização dos núcleos. Este método pode ser usado para abordar questões-chave no campo da regeneração de cardiomiócitos e pode ser usado como uma ferramenta de triagem para quantificar mudanças na dinâmica da geração de cardiomiócitos. A principal vantagem deste protocolo é que ele permite uma quantificação sensível e precisa da geração de neocardiomiócitos, independentemente da fonte celular e controlando a poliploidação.

24 horas após a sexta injeção de EdU, coloque o animal tratado em decúbito dorsal e use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão na pele do abdômen médio ao diafragma. Em seguida, mantendo o esterno afastado da cavidade corporal, corte bilateralmente o diafragma para expor o coração. Em seguida, levante ligeiramente o coração e corte os principais vasos sanguíneos da via de saída para dissecar o coração da cavidade torácica.

Imediatamente após a colheita, coloque os corações em tubos de centrífuga individuais de 15 mL contendo 10 mL de PBS resfriados a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira as amostras para placas de Petri individuais de 10 cm e use um bisturi para cortar cada coração em dois pedaços na orientação sagital. Em seguida, aperte suavemente os pedaços de coração com uma pinça.

Remova os dois pedaços de coração e coloque-os em uma placa de Petri contendo 20 mL de PBS fresco. Repita mais uma vez com uma nova placa de Petri e 20 mL de PBS fresco. Coloque ambas as partes dos corações no mesmo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e use uma agulha de calibre 25 para fazer um pequeno orifício na tampa de cada tubo para evitar que a tampa se abra quando o coração for processado.

Em seguida, rotule cada tubo e congele os tecidos cardíacos em um recipiente com nitrogênio líquido. Para cada coração a ser analisado, incube 36 mL de um por cento de BSA e PBS em um tubo de ultracentrífuga. Eliminar a solução após 30 minutos.

Quando os tubos estiverem secos ao ar, adicione 10 mL de solução de gradiente de sacarose a cada tubo. Depois de picar individualmente as amostras de coração congeladas com nitrogênio líquido com o bisturi, transfira os fragmentos de tecido de cada coração para tubos cônicos individuais de 50 mL contendo 15 mL de tampão de lise celular. Homogeneizar as amostras por 15 segundos a 25.000 rpm com um homogeneizador de sonda à temperatura ambiente.

Em seguida, adicione mais 15 mL de tampão de lise a cada tubo e transfira as amostras uma de cada vez para uma dose de 40 mL com um pilão grande. Execute 10 golpes com o pilão e filtre as pastas celulares através de um filtro de 100 mícrons seguido por um filtro de células de 40 mícrons em tubos de centrífuga individuais de 50 mL. Em seguida, colete os grânulos cardíacos nucleares por centrifugação e ressuspenda as células em 25 mL de solução de gradiente de sacarose cada.

Coloque as células em camadas sobre o gradiente de sacarose livre dos núcleos nos tubos de ultracentrífuga preparados e centrifugue as camadas usando um rotor de tubo oscilante. Após a centrifugação, ressuspenda os grânulos de núcleos em 1.300 microlitros de tampão de armazenamento de núcleos e transfira os núcleos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL rotulado como PCM1. Transfira 300 microlitros de cada suspensão dos tubos PCM1 para um novo tubo de microcentrífuga e adicione 700 microlitros de tampão de armazenamento de núcleos frescos e controle ISO de etiqueta.

Em seguida, rotule os núcleos PCM1 com anticorpo anti-PCM1 e os núcleos de controle ISO com anticorpo de controle rápido de isotipo IGG durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, gire as amostras e ressuspenda os pellets em um mL de tampão de armazenamento de núcleos frescos para uma segunda centrifugação nas mesmas condições. Após a segunda centrifugação, ressuspenda os pellets em um mL de tampão de armazenamento de núcleos frescos e incube os núcleos com um microlitro de um fragmento F(ab'2 conjugado fitzy de um anticorpo IGG anti-raivoso de cabra por uma hora a quatro graus Celsius no escuro.

Para avaliar o grau de incorporação de EdU, centrifugue as suspensões de núcleos marcados com controle PCM1 e ISO e ressuspenda os pellets em um mL de PBS 1% BSA duas vezes por duas lavagens consecutivas. Após a segunda lavagem, substitua o sobrenadante por 100 microlitros de fixador EdU e incube as amostras por 15 minutos em temperatura ambiente no escuro. Ao final da fixação, lavar os núcleos mais duas vezes em um mL de PBS BSA e incubar as amostras com 100 microlitros de solução de permeablização à base de saponina à temperatura ambiente.

Após 15 minutos, adicione 500 microlitros de coquetel de rotulagem EdU recém-preparado a cada tubo para uma incubação de 30 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, girar as amostras três vezes lavando os núcleos em um mL de PBS BSA durante as duas segundas centrifugações. Por fim, rotule as amostras com 400 microlitros de solução de coloração de DNA.

A análise imunohistológica dos corações pulsados demonstra a presença de cardiomiócitos expressando PCM1 que incorporaram EdU. No entanto, os dados obtidos por métodos imunohistológicos podem ser mal interpretados, pois outros tipos celulares que incorporaram EdU podem ser erroneamente identificados como cardiomiócitos. Em um estudo de camundongos mdx e controle, a análise de citometria de fluxo detalhada neste protocolo permite uma rápida quantificação da geração nuclear de neocardiomiócitos, ao mesmo tempo em que exclui as células que incorporaram EdU à despoliploidização.

Semelhante aos dados publicados anteriormente, neste experimento representativo foi observado um aumento nas taxas de geração de núcleos de neocardiomiócitos nos corações de camundongos mdx em comparação com controles pareados por idade. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em quatro horas no espaço de dois dias. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar os controles negativos EdU e PCM1 para que as portas possam ser definidas com precisão durante a análise.

Esta técnica também é compatível com uma série de técnicas imunohistológicas adicionais a jusante, permitindo que a incorporação de nucleócitos seja quantificada em vários tipos diferentes de células cardíacas. Esta técnica tem sido utilizada no campo da pesquisa cardiovascular para estudar alterações na regeneração de cardiomiócitos no modelo mdx de cardiomiopatia não isquêmica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar rapidamente os núcleos de neocardiomiócitos, assista à contagem de poliploidação para rastrear alterações na regeneração e renovação de cardiomiócitos.