Forrageamento Protocolo Caminho de comprimento para Drosophila melanogaster Larvas

O objetivo geral deste ensaio é quantificar o componente locomotor do comportamento larval de Drosophila. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da genética comportamental sobre contribuições genéticas e ambientais para as diferenças individuais no comportamento larval. As principais vantagens dessa técnica são que ela é rápida, reprodutível e permite a coleta de amostras grandes.

Geralmente, as pessoas novas neste método podem ter dificuldades porque o sucesso do ensaio depende do tempo de desenvolvimento e do manuseio consistente e cuidadoso dos animais de teste. Demonstrando o procedimento estarão Ina Anreiter e Oscar Vasquez, alunos de pós-graduação em meu laboratório. Prepare a garrafa de retenção cortando furos em um lado de uma garrafa plástica de cultura de moscas de seis onças.

Em seguida, use uma seringa para encher as tampas das placas de Petri com meio de suco de uva previamente preparado até que a superfície do meio de suco de uva faça uma cúpula acima da borda da tampa. Armazene os pratos de uva em um recipiente úmido e hermético a quatro graus Celsius por até duas semanas. Despeje 40 mililitros de comida para moscas previamente preparada em placas de Petri de 100 por 15 milímetros.

Obtenha três placas de acrílico preto com dez poços circulares de dez centímetros de diâmetro e dispostos em um desenho de dois por cinco para testar as larvas, e um espalhador de acrílico preto usado para espalhar a pasta de fermento nas placas de acrílico. Em seguida, separe as tampas do fundo das placas de Petri. Colete de 100 a 150 fêmeas e 50 a 75 machos.

Permita que fêmeas e machos acasalem durante a noite em uma garrafa de cultura de moscas de seis onças com comida padrão para moscas. Transfira as moscas para uma garrafa de retenção e use fita adesiva para prender um prato de uva com uma pequena quantidade de pasta de fermento fresco por cima da garrafa. Deixe a garrafa de cabeça para baixo com o prato de uva na parte inferior para permitir que os adultos ponham ovos no prato de uva.

Descarte o primeiro prato de uva após 24 horas e coloque um novo prato de uva na garrafa de retenção. Após 22 horas, retire as placas de uva das garrafas e coloque-as em uma placa de Petri de 60 por 15 milímetros. Em seguida, coloque um novo prato de uva com pasta de fermento fresco na garrafa de retenção.

Limpe e descarte todas as larvas do prato de uva semeado usando uma sonda de dissecação. Incubar as placas de uva limpas durante quatro horas em condições normais. Após quatro horas, pegue 100 larvas L1, ou de primeiro ínstar, por cepa dos pratos de uva e coloque-as nos pratos de comida.

Coloque as larvas sobre o alimento com cuidado, sem perfurar o alimento e sem enterrar as larvas. Grupos de dez larvas podem ser colhidos e colocados de cada vez. Evite aglomeração distribuindo as larvas pelo prato de comida.

Incube os pratos de comida até que os animais de teste estejam dez horas antes do início da peregrinação, quando as larvas deixam a comida em busca de um local de pupação. Se as larvas começaram a vagar e estão se movendo na tampa da placa de Petri, como você pode ver aqui, os animais são velhos demais para serem testados e seu tempo de desenvolvimento precisa ser reavaliado. Dissolva o fermento em água na proporção de um para dois.

Certifique-se de que a pasta acabada goteje e deixe fitas na superfície da pasta que derretam rapidamente. Avaliar a consistência correta da pasta de levedura é mais importante do que usar a proporção exata devido à variabilidade entre marcas, lotes de levedura e meio ambiente. Com um pincel, retire delicadamente as larvas do prato de comida da primeira cepa.

Colete as larvas em uma placa de Petri e lave suavemente as larvas com água para remover toda a comida. Lave rapidamente as larvas com dois mililitros de água e seque suavemente as larvas com um lenço umedecido de laboratório. Mantenha as larvas em um ambiente úmido, mas não submersas em água para evitar estresse.

Disponha três placas de teste lado a lado e defina um cronômetro de cinco minutos para cada placa de teste. Aplique pasta de fermento no topo das placas de teste e use o espalhador para distribuir uma fina camada de pasta de fermento em cada placa de teste para que todos os poços tenham uma camada uniforme de fermento. Coloque delicadamente uma larva no centro de cada poço.

Inicie o cronômetro de cinco minutos imediatamente após colocar as primeiras larvas em cada placa. Em seguida, coloque o resto das larvas nos poços restantes. Coloque uma tampa de placa de Petri em cima de cada poço.

Quando o tempo acabar, comece a traçar os comprimentos de caminho deixados para trás na levedura usando um marcador permanente sem remover as larvas da placa. Traçar comprimentos de caminho na mesma ordem e velocidade das larvas foram colocados nas placas. Finalmente, repita as etapas do teste de comprimento do caminho larval para cada cepa.

Os dados coletados ao longo de três dias consecutivos de testes revelaram um efeito de tensão significativo, com os rovers viajando mais longe do que os assistentes. Além do efeito de cepa, as larvas que foram privadas de comida por quatro horas antes do teste tiveram comprimentos de caminho significativamente menores do que as larvas alimentadas. No geral, os comprimentos dos caminhos foram mais longos quando ambas as cepas foram criadas com alimentos ricos em nutrientes em comparação com alimentos com baixo teor de nutrientes.

Se realizado corretamente, este ensaio permite que uma única pessoa teste até 500 larvas com facilidade em quatro horas, tornando-o valioso para fenotipagem em larga escala. Seguindo o procedimento que acabamos de mostrar, outras variáveis, como sexo, privação de alimentos ou qualidade dos alimentos, podem ser testadas para mostrar o efeito dessas variáveis nos padrões de movimento relacionados aos alimentos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a locomoção relacionada à alimentação de larvas de Drosophila para a avaliação das contribuições genéticas e ambientais para as diferenças individuais de comportamento.