Construção de Modelos de Previsão Nondestructive de Conteúdos ingrediente em mirtilos por espectroscopia no infravermelho próximo com base em medições de HPLC

O objetivo geral deste procedimento é construir e validar modelos para previsão não destrutiva do teor de açúcar total, ácido orgânico total e anticianina total em mirtilos individuais por espectroscopia de infravermelho próximo. Este método responderá aos principais problemas no campo da avaliação de produtos agrícolas, como frutas e vegetais. Para mim, uma vantagem dessa técnica é que muitos de nossos produtos podem ser verificados de forma não destrutiva por espectroscopia.

E os modelos construídos através do procedimento mostrado aqui. A espectroscopia de infravermelho próximo é uma ferramenta poderosa para a avaliação não destrutiva de produtos agrícolas. Os modelos de previsão são construídos examinando a correlação entre o espectro e os conteúdos determinados pela análise química de cada alvo.

Demonstrando o procedimento estarão Yusuke Kimura, um estudante graduado do meu laboratório e Jingai Che, da universidade e um dos autores deste protocolo. Colete um número suficiente e vários tipos de amostras de mirtilos das cultivares alvo. Colete preferencialmente 100 mirtilos para a construção do modelo de calibração.

E pelo menos 10 para a validação do modelo construído. Para construir modelos robustos, colete amostras de vários tipos, como com várias cores, tamanhos e em várias condições de amadurecimento. Pese cada mirtilo.

Os pesos medidos são usados posteriormente para o cálculo da porcentagem de conteúdo dos ingredientes de cada mirtilo. Em seguida, coloque uma amostra de mirtilo no centro da janela do espectrofotomoter de infravermelho próximo para medições de refletância difusa. Usando o comando sample single channel, meça os espectros de cada mirtilo.

De preferência em vários pontos da fruta. Mantenha os mirtilos em um freezer, abaixo de 30 graus Celsius negativos, se não forem analisados logo após as medições do espectro. Para iniciar o pré-tratamento, corte um mirtilo em vários pedaços para que possa ser facilmente homogeneizado.

Cortar o mirtilo sem descongelar quando estiver congelado. Coloque os pedaços em um copo de 50 mililitros. Adicione aproximadamente 10 mililitros de água ultra pura ao copo.

Aqueça o mirtilo cortado em água ultrapura em forno de micro-ondas por 20 segundos para desativar as enzimas que podem decompor os açúcares durante as análises. Adicione aproximadamente 10 mililitros de água ultra pura ao copo. Homogeneizar a mistura por cinco minutos a 12.000 RPM com um homogeneizador equipado com um eixo padrão e gerador.

Centrifugar a mistura homogeneizada durante 10 minutos a 3 000 RPM. Em seguida, colete o filtrado por filtração a vácuo da amostra centrifugada usando um filtro de papel cinco B. Depois de repetir duas vezes as etapas de homogeneização, medir o pH do filtrado e ajustá-lo a sete com ácido clorídrico diluído e soluções aquosas diluídas de hidróxido de sódio.

Dilua o filtrado a 50 mililitros com água ultrapura. Divida a amostra em duas. Um para a análise de açúcares e outro para a análise de ácidos orgânicos.

Passe a primeira solução de amostra pelas colunas conectadas em série para excluir pigmentos, cátions e ânions. Jogue fora o primeiro mililitro da solução de amostra das colunas. Em seguida, utilizar a solução da amostra das colunas para a análise dos açúcares por cromatografia líquida de alta resolução ou HPLC.

Centrifugar a solução a 6 600 RPM durante 10 minutos num microtubo equipado com um filtro de 0,445 mícrons com uma mini-centrífuga antes da análise por HPLC. Disponha o sistema de HPLC usando uma coluna de permeação de gel no forno de coluna a 40 graus Celsius. Use água ultrapura desgaseificada com uma vazão de 0.1 mililitros por minuto como eluente.

Use também um detector de índice de refração. Medir os espectrogramas de HPLC das soluções-padrão injectando uma alíquota de 20 microlitros para cada medição. Aqui, o software de solução embalada é usado para a medição.

Obtenha a intensidade da área da banda de açúcar no cromatograma de cada solução padrão clicando em reanálise com o botão direito do mouse. Em seguida, substitua as intensidades da área pelas concentrações correspondentes para obter a curva de trabalho para cada açúcar por regressão linear. A partir da curva, obtém-se a equação que representa a relação entre a intensidade da área e a concentração para cada açúcar.

Após a obtenção da curva-padrão, medir os espectrogramas de HPLC das soluções das amostras injectando uma alíquota de 20 microlitros para cada medição. Obter as intensidades de área das bandas de açúcares no cromatograma de cada solução de amostra como antes. Consulte o protocolo de texto para obter as etapas sobre a realização de medições de HPLC de ácidos orgânicos.

Mantenha os mirtilos em um freezer abaixo de 80 graus Celsius negativos se não forem analisados quanto a antocianinas logo após as medições do espectro. Para realizar o pré-tratamento para medições de anocianinas por HPLC, seque cada fruta congelada com um liofalizador a vácuo por 12 horas. Extraia a antocianina do mirtilo seco em uma solução de metanol a um por cento de ácido trifluruocético, deixando a mistura na geladeira a quatro graus Celsius por 12 horas.

Centrifugar o extracto durante 15 minutos num microtubo de dois mililitros utilizando uma ultracentrifugadora a oito graus Celsius negativos e 15 000 RPM. Em seguida, filtre o extrato através de um filtro de 0,45 mícron para obter a amostra para medições por HPLC. Dispor o sistema de HPLC utilizando uma coluna de fase inversa C18 num forno de coluna a 40 graus Celsius.

Aplique o método de gradiente usando um ácido trifluroacético aquoso a 0,1% como LUNA. E 0,5 por cento de ácido trifluroacético em acetonitrila como LUNB. Use uma taxa de fluxo de 0,1 mililitros por minuto, onde a proporção de LUNB aumenta de oito por cento para 15% durante zero a 50 minutos após a injeção.

E de 15% a 75% durante 50 a 60 minutos após a injeção. Use um detector de matriz de diodos fotográficos monitorando a 520 nanômetros. Medir os espectrogramas de HPLC das soluções-padrão injectando uma alíquota de 10 microlitros através do amostrador automático para cada medição.

Use o software da solução LC para a medição. Por fim, medir os espectrogramas de HPLC das soluções de amostra injetando uma alíquota de 10 microlitros através do amostrador automático para cada medição. Neste ponto, é realizada a construção de modelos de calibração para predição de teores de ingredientes, seguida da validação desses modelos construídos, conforme descrito no protocolo de texto.

Os modelos de previsão são construídos usando os espectros observados e o conteúdo dos ingredientes determinado através do procedimento mostrado aqui. Um exemplo do resultado da validação cruzada do modelo construído para a previsão do teor total de açúcar é mostrado aqui. A correlação entre os valores previstos pela espectroscopia de infravermelho próximo e os determinados por HPLC é satisfatória.

Um resultado semelhante é observado para a validação cruzada do modelo para o teor de antocianinas totais. Novamente, a correlação entre os valores previstos e os observados é satisfatória. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter valores anteriores de conteúdo de mirtilos com HPLC.

A avaliação diferente só é possível usando os modelos construídos adequadamente com base no conteúdo predefinido medido por análise química destrutiva. Isso significa que a análise química prévia de um alvo é um mistério para construir modelos de previsão de alto desempenho. Consulte o protocolo de texto para o procedimento de construção de modelos de previsão que não são mostrados neste vídeo.

Uma vez construídos corretamente, os modelos de previsão são aplicáveis para a previsão de açúcar, ácidos orgânicos e qualquer conteúdo de mirtilos. Espera-se que a espectroscopia de infravermelho próximo, como mostrado aqui, seja aplicável para a correlação de muitos tipos de produtos agrícolas. Não se esqueça que é necessário obter barreiras predefinidas de conteúdo por meio de análises químicas para a construção de um bom modelo ao aplicar espectroscopia de infravermelho próximo para avaliação de qualquer produto agrícola.