Name: Construção de Modelos de Previsão Nondestructive de Conteúdos ingrediente em mirtilos por espectroscopia no infravermelho próximo com base em medições de HPLC (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprenda a construir modelos preditivos não destrutivos para análise de açúcares, ácidos orgânicos e antocianinas em mirtilos usando espectroscopia no infravermelho próximo calibrada com HPLC.

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Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo projeto "Um Esquema para Revitalizar a Agricultura e a Pesca em Área de Desastre por meio da Implantação de Tecnologia Altamente Avançada" do Ministério da Agricultura, Silvicultura e Pesca, Japão.

1. Coleta de Amostras <ol><li> Decidir qual cultivares serão incluídos no alvo do modelo de calibração. </li><li> Recolhe número suficiente e vários tipos de amoras de amostra dos cultivares alvo. <ol><li> Recolha de um modo preferido 100 mirtilos para a construção do modelo de calibração, e, pelo menos, 10 para a validação do modelo construído. A fim de construir modelos robustos, recolher amostras de vários tipos, ou seja, com várias cores, tamanhos e em diferentes condições de maturação. </li></ol></li><li> Pesar cada mirtilo. Nota: Os pesos medidos são utilizados mais tarde para o cálculo da percentagem de conteúdo de ingredientes de cada mirtilo. </li></ol> 2. As medições de espectros <ol><li> Warm-up o espectrofotômetro suficiente (mais de 1 hora) antes das medições para obter espectros de confiança. </li><li> Ajuste o espectrofotômetro. Certifique-se de que as condições são constantes durante todo as medições. Aexemplo de condições típicas para as medições é dada abaixo. <ol><li> Definir a gama de medições para 12,500-3,600 cm -1. </li><li> Defina a resolução espectral para 16 cm -1. </li><li> Defina o acúmulo de até 32 vezes. </li></ol></li><li> Escolha reflectância difusa como o modo de medição. </li><li> Coloque o refletor padrão na janela do espectrofotômetro para medidas de reflectância difusa. Ao usar o comando &quot;fundo único canal&quot;, medir o espectro de fundo que é automaticamente usada para o cálculo dos espectros de reflectância relativa a partir dos espectros de mirtilos amostra medida mais tarde. </li><li> Coloque uma amostra de mirtilo no centro da janela do espectrofotômetro para medidas de reflectância difusa. Ao usar o comando &quot;amostra único canal&quot;, medir espectros de cada blueberry de preferência em vários pontos da fruta. Nota: Kubelka-Munk 6,7 transformação também será realizada autocamente para a espectros observados de mirtilos amostra, se a condição de aquisição espectral é configurado para fazer isso. transformação de Kubelka-Munk altera o espectro medido no modo de reflectância difusa para os espectros equivalente àqueles medidos no modo de transmissão e é necessária para a análise dos espectros com alta precisão. Spectra na escala de absorção são usados ​​para análises. </li><li> Calcula-se a média do espectro dos espectros de cada amostra utilizando um programa de processamento de dados, tais como o Microsoft Excel se os espectros de uma amostra de mirtilo são medidas em vários pontos. Utilizar o espectro em média para as análises. </li></ol> 3. Pré-tratamento para medições de HPLC de açúcares e ácidos orgânicos 8 Nota: Extracto açúcares e ácidos orgânicos de cada mirtilo, que são solúveis em água, com água ultrapura como se segue. A totalidade de cada blueberry é utilizado para análises. <ol><li> Mantenha os mirtilos em um congelador abaixo de -30 ° C pronto foanalisa r química se não forem analisados ​​logo após as medidas espectrais. </li><li> Cortar uma mirtilo em vários pedaços de modo que pode ser facilmente homogeneizado nos seguintes passos. Corte o blueberry sem descongelar quando ele está congelado. </li><li> Coloque os pedaços em um copo de 50 ml. </li><li> Adicionar ca. 10 ml de água ultrapura (água destilada cuja condutividade eléctrica é inferior a 0,1 mS / cm) para o copo. </li><li> Aquece-se a mirtilo corte em água ultrapura num forno de microondas durante 20 seg para desactivar as enzimas que podem decompor-se açúcares durante as análises. </li><li> Adicionar cerca de 10 ml de água ultrapura ao balão. </li><li> Homogeneizar a mistura durante 5 minutos a 12.000 rpm com um homogeneizador equipado com um eixo padrão e gerador. </li><li> Centrifugar a mistura homogeneizada durante 10 min a 3000 rpm (2000 x g). </li><li> Recolhe filtrado por filtração sob vácuo da amostra centrifugada utilizando um filtro de papel 5B. </li><li> Repetir a 3,6-3,9 passos duas vezes em the resíduo de filtração para recolher todos os açúcares e os ácidos orgânicos, e combinar todos os filtrados. </li><li> Medir o pH do filtrado e ajustá-lo para 7 com ácido clorídrico diluído (0,1 e 0,01 mol L -1) e soluções aquosas diluídas de hidróxido de sódio (0,1 e 0,01 mol L -1). </li><li> Dilui-se o filtrado até 50 ml com água ultrapura. </li><li> Dividir a amostra em dois; uma para a análise de açúcares e a outra para a análise de ácidos orgânicos. </li><li> Passar a primeira solução de amostra através de colunas (duas C18, CM e QMA) ligados em série, para excluir pigmentos, catiões e aniões. Jogue fora os primeiros 1 ml da solução da amostra a partir das colunas. Em seguida, utilizar a solução da amostra a partir das colunas para a análise de açúcares por HPLC. </li><li> Passar a segunda solução de amostra através de colunas (duas C18 e CM) ligados em série para excluir pigmentos e catiões. Jogue fora os primeiros 1 ml da solução da amostra a partir das colunas. Em seguida, use a solução de amostra a partir da columns para a análise de ácidos orgânicos por HPLC. </li><li> Centrifugar cada solução de passos 3.14 e 3.15 a 6600 rpm (5800 x g), durante 10 min num microtubo equipado com um filtro de 0,45 um, com um mini-centrífuga antes da análise por HPLC. </li></ol> 4. Medições de açúcares por HPLC Nota: Neste estudo, o teor total de sacarose, glicose e frutose de cada mirtilo é considerado como o teor total de açúcar. Portanto, a curva de trabalho para cada um dos três açúcares é obtido em primeiro lugar, e, em seguida, o conteúdo é obtido soma dos açúcares em cada mirtilo. O conteúdo padrão são relatadas como 0,3-0,4% em peso de (sacarose), 3,8-4,8% em peso (glicose), e 4,2-5,3% em peso (frutose) 9. <ol><li> Medir cerca de 200 mg de sacarose com precisão, e dissolvê-lo em 50 ml de água ultrapura para preparar uma solução-padrão. Dilui-se 5 ml da solução para 50 ml com água ultrapura para preparar a segunda soluções-padrão. Prepare de forma semelhante a terceira posiçãoard solução a partir da segunda solução padrão. </li><li> Preparar as soluções padrão de glucose e frutose, de forma semelhante. </li><li> Dispor o sistema de HPLC como segue: <ol><li> Utilizar uma coluna de permeação em gel na coluna forno a 40 ° C. </li><li> Use água ultrapura desgaseificada com a taxa de fluxo de 0,1 ml / min como o eluato. </li><li> Usar um detector de índice de refracção. </li></ol></li><li> Medir os espectrogramas de HPLC de soluções padrão por injecção de uma alíquota de 20 uL para cada medição. Nota: Aqui, o PAC solução é utilizada como o software para a medição. </li><li> Obter a intensidade da banda do açúcar no cromatograma de cada solução padrão área clicando &#39;re-análise &quot;com o botão direito do mouse. </li><li> Traçar as intensidades área contra as concentrações correspondentes para obter a curva de trabalho para cada açúcar pela regressão linear, em que a equação que representa a relação entre a intensidade e a área de concentração é obtido for cada açúcar. </li><li> Medir os espectrogramas de HPLC das soluções de amostra por injecção de uma alíquota de 20 uL para cada medição. </li><li> Obter as intensidades das bandas de açúcares no cromatograma da solução de amostra a cada área, como descrito anteriormente no passo 4.5. </li><li> Obter as concentrações dos açúcares nas soluções que utilizam as equações correspondentes para as curvas de trabalho obtidos no passo 4.6. </li><li> Obter a quantidade de cada açúcar em cada mirtilo a partir das concentrações da solução de amostra obtida na etapa anterior e o volume total da solução da amostra (50 ml, ver passo 3.12). </li><li> Obter as quantidades totais de açúcar de cada fruta somando-se o conteúdo de três açúcares. </li><li> Obter a percentagem de conteúdo de açúcar total de cada blueberry usando o peso medido no passo 1.3. </li></ol> 5. As medições de HPLC dos ácidos orgânicos Nota: Neste estudo, o teor total de ácido cítrico, ácido quínico, ácido málicoácido, e ácido succínico são considerados como o conteúdo de ácido orgânico total. Portanto, a curva de trabalho para cada um dos quatro ácidos orgânicos é obtido em primeiro lugar, e, em seguida, o conteúdo de ácido orgânico em cada mirtilo é medido. O conteúdo padrão são relatadas como 0,42-0,62% em peso (ácido cítrico), 0-0,15% em peso (ácido quínico), 0,08-0,23% em peso (ácido málico), e 0,06-0,25% em peso (ácido succínico) 9. <ol><li> Medir cerca de 5 mg de ácido cítrico com precisão, e dissolvê-lo em 50 ml de água ultrapura para preparar uma solução-padrão. Dilui-se 5 ml da solução para 50 ml com água ultrapura para preparar a segunda soluções-padrão. Prepare de forma semelhante a terceira solução padrão a partir da segunda solução padrão. </li><li> Preparar as soluções padrão de ácido quínico, ácido málico, ácido succínico e, de forma semelhante. </li><li> Dispor o sistema de HPLC como segue: <ol><li> Use duas colunas de permuta aniónica ligadas em série no forno de coluna a 40 ° C. </li><li> Uso desgaseificada solução aquosa a 0,1% de fosfóricoácido com a taxa de fluxo de 0,02 ml / min como o eluato. </li><li> Use um conjunto detector ultravioleta-visível a 210 nm. </li></ol></li><li> Medir os espectrogramas de HPLC de soluções padrão por injecção de uma alíquota de 20 ul da solução padrão de cada medição. </li><li> Obter a intensidade da banda de ácido orgânico no cromatograma de cada solução padrão área clicando &#39;re-análise &quot;com o botão direito do mouse. </li><li> Traçar as intensidades área contra as concentrações correspondentes para obter a curva de trabalho para cada ácido orgânico pela regressão linear, em que a equação que representa a relação entre a intensidade de área e a concentração é obtido para cada ácido orgânico. </li><li> Medir os espectrogramas de HPLC das soluções de amostra por injecção de uma alíquota de 20 ul da amostra para cada medição. </li><li> Obter as intensidades das bandas de ácidos orgânicos no cromatograma da solução de amostra a cada área, tal como descrito anteriormente no passo 5.5. </li><li> Obter as concentrações dos ácidos orgânicos nas soluções que utilizam as equações correspondentes para as curvas de trabalho obtidos no passo 5.6. </li><li> Obter a quantidade de cada ácido orgânico em cada mirtilo a partir das concentrações da solução de amostra obtida na etapa anterior e o volume total da solução da amostra (50 ml, ver passo 3.12). </li><li> Obter a quantidade de ácido orgânico total em cada mirtilo pela soma-se os conteúdos dos quatro ácidos orgânicos. </li><li> Obter a percentagem do conteúdo de ácido orgânico total de cada mirtilo usando o peso medido no passo 1.3. </li></ol> 6. Pré-tratamento para medições de HPLC de antocianinas <ol><li> Mantenha os mirtilos no congelador a menos de -80 ° C pronto para análises químicas, se eles não são analisados ​​logo após as medidas espectrais. </li><li> Seque cada fruta congelada com um liofilizador vácuo durante 12 h. </li><li> Extrair antocianina do mirtilo secou-se em 1% de solução de metanol óácido trifluoroacético f [peso de mirtilo (g) / volume da solução (ml) = 10/01], deixando a mistura no frigorífico a 4 ° C durante 12 h. </li><li> Centrifugar o extracto durante 15 min num microtubo de 2 ml usando uma ultracentrífuga a -8 ° C e 15.000 rpm (21.900 x g). </li><li> Filtra-se o extracto através de um filtro de 0,45 um para obter a amostra para medições de HPLC. </li></ol> 7. As medições por HPLC de antocianinas Nota: Cerca de 13 antocianinas tipo estão incluídas na mirtilos. Uma vez que é difícil obter curvas de trabalho para todas as antocianinas, a curva de trabalho para o cloreto O -glucoside única cianidina-3-, uma das antocianinas mais populares em blueberries, é obtido. A curva de trabalho é aplicado por quantificações aproximadas de outros antocianinas. <ol><li> Medir cerca de 1,5 mg de cloreto de -glucoside cianidina-3-O com precisão, e dissolvê-lo em 10 ml de solução de metanol a 1% de ácido trifluoroacético a Prepare uma solução padrão. Dilui-se 5 ml da solução para 10 ml com solução de metanol a 1% de ácido trif luoroacético para preparar a segunda soluções-padrão. Do mesmo modo, preparar o terceiro eo quarto soluções padrão sequencialmente. </li><li> Dispor o sistema de HPLC como segue: <ol><li> Usar uma coluna de fase inversa C18 num forno de coluna a 40 ° C. </li><li> Aplicar o método do gradiente utilizando eluatos de 0,1% de ácido trifluoroacético aquoso (eluir A) e 0,5% de ácido trifluoroacético em acetonitrilo (eluir B) com a taxa de fluxo de 0,1 ml / min, em que a razão de aumento eluir B de 8% a 15% durante 0-50 min após a injecção, e de 15% para 75% durante 50-60 minutos após a injecção. </li><li> Use um fotodiodo matriz monitoramento detector a 520 nm. </li></ol></li><li> Medir os espectrogramas de HPLC de soluções padrão injectando uma alíquota de 10 uL para cada medição. &quot;Solução LC&quot; é utilizado como o software para a medição. </li><li> Obter a intensidade da banda de áreacloreto de O -glucoside cianidina-3- no cromatograma de cada solução padrão, clicando em &quot;re-análise&quot; com o botão direito do mouse. </li><li> Traçar as intensidades área contra as concentrações correspondentes para obter a curva de trabalho para cianidina-3- cloreto de o -glucoside pela regressão linear, em que a equação que representa a relação entre a intensidade e a área de concentração é obtido para cianidina-3- cloreto de o -glucoside. </li><li> Medir os espectrogramas de HPLC das soluções de amostra por injecção de uma alíquota de 10 uL para cada medição. </li><li> Obter a intensidade da banda de cada antocianina no cromatograma da solução de amostra a cada área, como descrito anteriormente no passo 7.4. </li><li> Obter as concentrações das antocianinas nas soluções utilizando a equação correspondente à curva de trabalho, obtido no passo 7.5. </li><li> Obter as quantidades de cada antocianina em cada mirtilo da concentração obtida na precedentepasso e o volume total da solução da amostra utilizada no passo 6.3. </li><li> Obter a quantidade total de antocianina em cada blueberry somando-se os conteúdos dos treze antocianinas. </li><li> Obter a percentagem do teor de antocianina total de cada mirtilo usando o peso medido no passo 1.3. </li></ol> 8. Construção de modelos de calibração para predição dos conteúdos Ingrediente Nota: regressão PLS 4,5, que é um tipo de técnica de regressão múltipla usando variantes latentes, é usado para a construção de modelos de calibração para cada um dos ingredientes a partir dos espectros observados e o conteúdo de ingrediente determinada por análises químicas. PLS de regressão é realizada tanto com os programas comerciais ou com os programas caseiros. Ver referências 5,10 para os processos detalhados da construção de modelos. <ol><li> Analisará os pré-tratamentos para espectros observados são mais eficazes para precisas epredição robusta. <ol><li> Construir modelos de calibração através da aplicação de um ou dois dos seguintes pré-tratamentos: MSC (multiplicativo Scatter Correction), 1,2,5 SNV (Standard normal variate), 1,2,5 MMN (Min-Max Normalização), COE (Constant offset Eliminação ), e o primeiro ou o segundo cálculo derivado por SG (Savitzky-Golay) método. 1,2,5 Prever o conteúdo de ingrediente a validação definido a partir de seus espectros com os modelos construídos. Nota: Em MMN, um espectro é normalizada de modo a que os valores máximos e mínimos e tornar-se 0 e 1, respectivamente. Em COE, a ordenada de um espectro é deslocado de modo a que o valor mínimo torna-se zero. </li><li> Calcular coeficiente de determinação, R2, e desvio de previsão residual, RPD, entre os valores observados e estimados de validação definido para examinar que pré-tratamentos para espectros observados são mais eficazes. Escolha a combinação de pré-tratamentos dando maiorR2 e RPD. </li></ol></li><li> Examinar quais regiões número de onda são eficazes para a previsão precisa e robusta, aplicando, por exemplo,-mover janelas PLS técnica de 11 para procurar as regiões eficazes. Nota: O procedimento corresponde a remover as regiões número de onda, onde espectros não contêm nenhuma informação eficaz para previsões ou que contenham informações que interfere com as previsões. </li></ol> 9. validação dos modelos de calibração construída Nota: Ver referências 5,10 para os processos detalhados da validação de modelos construídos. <ol><li> Prever conteúdo ingrediente da validação definido a partir de seus espectros com os modelos de calibração construídas com a melhor combinação de pré-tratamentos e para as regiões wavenumber eficazes para a predição 5,10. </li><li> Calcular R 2 e RPD entre o observado e previstovalores do conjunto de validação 5,10. </li><li> Examinar se os critérios gerais para a realização prática dos modelos de calibração, 12,13 R 2&gt; 0,85 e RPD&gt; 2,5, estão satisfeitos. Considere a reconstrução do modelo, se os critérios não são satisfeitos. </li></ol>

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</ol>

Não temos nada a divulgar.

Alguns comentários adicionais sobre o protocolo são descritos aqui. Em primeiro lugar, no passo 1.1, menciona-se para decidir as cultivares incluídos no alvo. Embora seja possível construir modelos que cobrem blueberries de muitos cultivares ou sem especificar cultivares, as precisões de previsão com os modelos são, por vezes, muito mais baixa do que aqueles com os modelos para um único cultivar e para as cultivares limitados. Deve também notar-se que os modelos de calibração deve ser construído para mirtilos de cada lo...

Infravermelho próximo (NIR) é amplamente aplicada como uma técnica não destrutiva para analisar o conteúdo de frutas e vegetais de vários tipos. Analisa 1,2 Nondestructive por espectroscopia NIR habilitar o envio de apenas deliciosas frutas e vegetais com qualidades garantidas. espectroscopia NIR já foi aplicada ao laranja, maçã, melancia, cereja, fruta de kiwi, manga, papaia, pêssego e assim por diante para saber o seu Brix que corresponde ao teor total de açúcar, acidez, TSC (teor de sólidos totais), e assim por diante . Recentemente, relatou a aplicação da espectroscopia NIR para a avaliação de mirtilos qualidade. 3 Medimos não só o teor de açúcares totais e o teor de ácido orgânico total correspondente à acidez, mas também o conteúdo de antocianina total. A antocianina é um componente bioactivo que se crê melhorar a saúde humana. É conveniente para os consumidores se eles podem comprar deliciosos blueberries com uma garantia de seu teor de açúcar, acidity e teor de antocianinas. Em NIR espectro de absorção de frutas e legumes, apenas largas bandas de absorção são observados. Eles são principalmente as bandas devido à fibra e à humidade. Embora muitas bandas fracas devido a vários ingredientes de o alvo não-destruído são observados simultaneamente, as bandas observadas não podem ser atribuídos a modos de vibração específicos de componentes específicos do alvo, na maioria dos casos. Portanto, a técnica tradicional para determinar o teor de um componente específico utilizando a lei de Lambert-Beer não é eficaz para espectros NIR. Em vez disso, modelos de calibração para prever o conteúdo dos componentes alvo a partir dos espectros observados são construídos utilizando quimiometria por examinar a correlação entre o espectro observado e o conteúdo de ingrediente correspondentes aos espectros de 4,5. Aqui, um protocolo para a construção e validar os modelos para a previsão de teor de açúcares totais, teor de ácido orgânico total correspondente ao ACIDIty, e teores de antocianinas totais de mirtilos de espectros NIR é apresentado. A Figura 1 mostra o fluxograma geral para a construção de modelos de calibração confiáveis ​​e robustas. Amostras de número suficiente são coletados. Alguns deles são utilizados para a construção de modelos enquanto os outros são utilizados para a validação dos modelos construídos. Para cada uma das amostras recolhidas, um espectro de NIR é medida, e em seguida, os componentes alvo são analisados ​​quantitativamente com os métodos de análise química destrutivas tradicionais. Aqui, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é utilizada para as análises químicas de açúcares, ácidos orgânicos, e antocianinas. mínimos quadrados parciais (PLS) A regressão é usada para a construção de modelos de calibração em que a correlação entre o espectro observado e o conteúdo de ingrediente determinado por análise química é examinada. A fim de construir modelos robustos com a melhor capacidade de previsão, os pré-tratamentos de observed espectros e os comprimentos de onda utilizados para a predição são também examinados. Por fim, os modelos construídos são validados para confirmar a sua capacidade de previsão suficiente. Na validação, o conteúdo previsto a partir do espectro observado pelo modelo construído (valores previstos) são comparados com o conteúdo determinado pelas análises químicos (valores observados). Se a correlação suficiente não pode ser encontrada entre os valores previstos e observados, o modelo de calibração deve ser re-construída até que seja obtida a correlação suficiente. Embora seja preferível utilizar diferentes grupos de amostras para a construção e a validação de um modelo, como mostrado nesta figura (validação externa), amostras em um mesmo grupo são usados ​​tanto para a construção e a validação (validação cruzada) quando o número de amostras não é grande o suficiente. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53981/53981fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxograma para a construção e validação do modelo de calibração. Os procedimentos cercado por linhas azuis e verdes correspondem, respectivamente, para a construção de um modelo de calibração e sua validação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53981/53981fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Espectrofotômetro FT-NIR</td><td>Bruker Optics GmbH</td><td>MPA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cromatografia Líquida de Alta Performance</td><td>Shimadzu Corporation</td><td>228-45041-91, 228-45000-31, 228-45018-31</td><td>Para análise</td></tr><tr><td></td><td></td><td>de açúcar 223-04500-31, 228-45010-31, 228-45095-31 Detector de</td><td>Índice de Refração</td></tr><tr><td>Cromatografia Líquida de Alta Performance</td><td>Shimadzu Corporation</td><td>228-45041-91, 228-45003-31, 228-45000-31</td><td>Para análise</td></tr><tr><td></td> de ácidos orgânicos<td></td><td>228-45018-31, 228-45010-31, 223-04500-31</td> cromatografia líquida de alto desempenho <td>do detector ultravioleta-visível</td></tr><tr><td></td><td>Shimadzu Corporation</td><td>228-45041-91, 228-45018-31, 228-45000-31</td><td>para a análise</td></tr><tr><td></td><td></td><td>228-45012-31, 228-45119-31, 228-45005-31</td> medidor do pH <td></td></tr><tr><td></td> do detector<td></td><td></td> 228-45009-31 <td></td></tr> da disposição do fotodiodo <tr><td></td><td>Mettler-Toledo</td><td>30019028</td><td>S220, Compensação automática</td></tr><tr><td>de temperatura Equipamento de tratamento de água ultrapura</td><td>ORGANO Corporation</td><td>ORG-ULXXXM1; PRA-0015-0V0</td><td>PURELAB ultra; Freezers Biomédicos PURELITE</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>SANYO</td><td>2-6780-01</td><td>MDF-U338</td></tr><tr><td>Freezer de temperatura ultrabaixa</td><td>Panasonic Healthcare Co., Ltd.</td><td>KM-DU73Y1-80</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>Liofilizador a vácuo</td><td>IWAKI GLASS Co., Ltd</td><td>119770</td><td>DRC-3L; FRD-82M</td></tr><tr><td>Homoginizador</td><td>Microtec Co., Ltd.&nbsp;</td><td>Ultracentrífuga Physcotron</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hitachi Koki Co., Ltd</td><td>S204567</td><td>CF15RXII</td></tr><tr><td>Mini-centrífuga</td><td>LMS CO., LTD.</td><td>KN3136572</td><td>MCF-2360</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Kokusan Co.,Ltd</td><td>2-5534-01</td><td>H-103N</td></tr><tr><td>Papel de Filtro&nbsp;</td><td>Advantec</td><td>1521070</td><td>5B, Eqivalent to Whatman 40</td></tr><tr><td>Sep-Pak C18 coluna</td><td>Waters Corporation Milford</td><td>WAT020515</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak CM coluna</td><td>Waters Corporation Milford</td><td>WAT020550</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak QMA coluna</td><td>Waters Corporation Milford</td><td>WAT020545</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Filtro Centrífugo</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>R2SA18503</td><td>PVDF, 0,45 &mu; m</td></tr><tr><td>Microtube</td><td>As One Corporation</td><td>1-1600-02</td><td>PP,</td></tr><tr><td>filtro de seringa</td> de 2 ml <td>GE Healthcare CO., LTD.</td><td>6788-1304</td><td>PP, 0,45 &mu; m</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Wako Pure Chemical Industries,Ltd</td><td>194-00011</td> Glicose de <td>grau reagente</td></tr><tr><td></td><td>Wako Pure Chemical Industries,Ltd</td><td>049-31165</td><td>Frutose de grau reagente</td></tr><tr><td></td><td>Wako Pure Chemical Industries,Ltd</td><td>123-02762</td><td>Ácido</td></tr><tr><td>cítrico</td> de grau reagente <td>Wako Pure Chemical Industries,Ltd</td><td>036-05522</td><td>Ácido</td></tr><tr><td>málico de grau reagente</td><td>Wako Pure Chemical Industries,Ltd</td><td>355-17971</td> Ácido succínico <td>de grau reagente</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>190-04332</td> Ácido quínico de <td>grau reagente</td></tr><tr><td></td><td>Alfa Aesar, A Johnson Matthey Company</td><td>10176328</td> Ácido fosfórico <td>de grau reagente</td></tr><tr><td></td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>162-20492</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td> de grau HPLC <td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>208-02746</td> Metanol <td>de grau reagente</td></tr><tr><td></td><td>Wako Pure Chemical Industries,Ltd</td><td>131-01826</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td> de grau reagente <td>Wako Pure Chemical Industries,Ltd</td><td>015-08633</td> Grau <td>de HPLC</td></tr><tr><td>cianidina-3- O-cloreto de glicosídeo</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>306-37661</td> Software <td>de grau HPLC</td></tr><tr><td>para análises</td><td>Bruker Optics GmbH</td><td>OPUS ver. 6.5</td><td></td></tr><tr><td>Softoware para pré-processamento</td><td>Microsoft</td><td>Excel powered by Visual Basic for Applications</td><td></td></tr><tr><td>Software para construção de modelos</td><td></td><td>Freemat 4.0</td><td>http://freemat.sourceforge.net/</td></tr></tbody></table>

construção de modelos de previsão nondestructive de conteúdos ingrediente em mirtilos por espectroscopia no infravermelho próximo com base em medições de hplc

Construction of Models for Nondestructive Prediction of Ingredient Contents in Blueberries by Near-infrared Spectroscopy Based on HPLC Measurements

A previsão não destrutiva do conteúdo de ingredientes de produtos agrícolas é útil para enviar e vender os produtos com qualidades garantidas. Aqui, a espectroscopia de infravermelho próximo é usada para prever de forma não destrutiva o teor de açúcar total, ácido orgânico total e antocianina total em cada mirtilo. Espera-se que a técnica permita a seleção de apenas mirtilos deliciosos de todos os colhidos. Os espectros de absorção do infravermelho próximo dos mirtilos são medidos com o modo de refletância difusa nas posições que não estão no cálice. O conteúdo do ingrediente de um mirtilo determinado por cromatografia líquida de alta eficiência é usado para construir modelos para prever o conteúdo do ingrediente a partir dos espectros observados. A regressão de mínimos quadrados parciais é usada para a construção dos modelos. É necessário selecionar adequadamente os pré-tratamentos para os espectros observados e as regiões de comprimento de onda dos espectros usados para análises. As validações são necessárias para que os modelos construídos confirmem que o conteúdo do ingrediente é previsto com precisão prática. Aqui apresentamos um protocolo para construir e validar os modelos para previsão não destrutiva do conteúdo de ingredientes em mirtilos por espectroscopia de infravermelho próximo.

A Figura 2 mostra como um exemplo de um conjunto de NIR espectro de absorção de mirtilos, onde os espectros de 70 blueberries são mostrados simultaneamente. Uma vez que as bandas definitivamente atribuíveis aos açúcares, ácidos orgânicos, ou antocianinas não são observados no espectro de NIR, a lei de Lambert-Beer tradicional não é aplicável para quantificar os teores de ingredientes. Portanto, a construção de modelos para a predição de conteúdo de ingrediente é necessár...

Apresentamos aqui um protocolo para construir e validar modelos para previsão não destrutiva de açúcar total, ácido orgânico total e teor total de antocianinas em mirtilos individuais por espectroscopia de infravermelho próximo.

Construção de Modelos de Previsão Nondestructive de Conteúdos ingrediente em mirtilos por espectroscopia no infravermelho próximo com base em medições de HPLC

Nondestructive prediction of ingredient contents of farm products is useful to ship and sell the products with guaranteed qualities. Here, near-infrared ...

O objetivo geral deste procedimento é construir e validar modelos para a predição não destrutiva do teor de açúcares totais, ácidos orgânicos totais e antocianinas totais em mirtilos individuais por espectroscopia no infravermelho próximo. Este método responderá a problemas fundamentais na área de avaliação de produtos agrícolas, como frutas e legumes. Para mim, uma vantagem dessa técnica é que grande parte dos nossos produtos pode ser analisada de forma não destrutiva por espectroscopia.E os modelos construídos por meio do procedimento apresentado aqui. A espectroscopia no infravermelho próximo é uma ferramenta poderosa para a avaliação não destrutiva de produtos agrícolas. Modelos de predição são construídos mediante a análise da correlação entre o espectro e os teores determinados por meio de análise química de cada alvo.Quem demonstrará o procedimento será Yusuke Kimura, aluno formado do meu laboratório, e Jingai Che, da universidade e um dos autores deste protocolo. Colete um número suficiente e diversos tipos de amostras de mirtilos das cultivares-alvo. Preferencialmente, colete 100 mirtilos para a construção do modelo de calibração.E pelo menos 10 para a validação do modelo construído. Para construir modelos robustos, colete amostras de vários tipos, como com diferentes cores, tamanhos e em diversas condições de amadurecimento. Pese cada mirtilo.Os pesos medidos são utilizados posteriormente para o cálculo da porcentagem de conteúdo dos ingredientes de cada mirtilo. Em seguida, coloque uma amostra de mirtilo no centro da janela do espectrofotômetro de infravermelho próximo para medições de refletância difusa. Utilizando o comando de canal único da amostra, meça os espectros de cada mirtilo.De preferência em vários pontos do fruto. Mantenha os mirtilos em um congelador, abaixo de trinta graus Celsius negativos, caso não sejam analisados logo após as medições espectrais. Para iniciar o pré-tratamento, corte um mirtilo em vários pedaços para que possa ser facilmente homogeneizado.Cortar o mirtilo sem descongelar quando estiver congelado. Colocar os pedaços em um béquer de 50 mililitros. Adicionar aproximadamente 10 mililitros de água ultra pura ao béquer.Aqueça a amostra de mirtilo cortado em água ultrapura no forno de micro-ondas por 20 segundos para desativar as enzimas que poderiam decompor os açúcares durante as análises. Adicione aproximadamente 10 mililitros de água ultrapura ao béquer. Homogeneíze a mistura por cinco minutos a 12.000 RPM com um homogeneizador equipado com eixo e gerador padrão.Centrifugue a mistura homogeneizada por 10 minutos a 3.000 RPM. Em seguida, colete o filtrado por filtração a vácuo da amostra centrifugada utilizando um filtro de papel cinco B. Após repetir os passos de homogeneização duas vezes, meça o pH do filtrado e ajuste-o para sete com ácido clorídrico diluído e soluções aquosas diluídas de hidróxido de sódio.Dilua o filtrado até 50 mililitros com água ultra pura. Divida a amostra em duas partes: uma para a análise de açúcares e outra para a análise de ácidos orgânicos.Passe a primeira solução da amostra através das colunas conectadas em série para remover pigmentos, cátions e ânions. Descarte o primeiro mililitro da solução da amostra que sai das colunas. Em seguida, utilize a solução da amostra proveniente das colunas para a análise de açúcares por cromatografia líquida de alta eficiência ou HPLC.Centrifugue a solução a 6.600 RPM durante 10 minutos em um microtubo equipado com um filtro de 0,445 mícron com uma mini-centrífuga antes da análise por HPLC. Configure o sistema de HPLC utilizando uma coluna de permeação em gel na estufa de coluna a 40 graus Celsius. Utilize água ultrapura desgaseificada com uma vazão de 0,1 mililitros por minuto como eluente.Utilize também um detector de índice de refração. Meça os espectrogramas de HPLC de soluções padrão injetando uma alíquota de 20 microlitros para cada medição. Aqui, utiliza-se um software de solução empacotada para a medição.Obtenha a intensidade da área da faixa do açúcar no cromatograma de cada solução padrão clicando em reanálise com o botão direito do mouse. Em seguida, plote as intensidades das áreas em função das concentrações correspondentes para obter a curva de trabalho para cada açúcar por regressão linear. A partir da curva, obtém-se a equação que representa a relação entre a intensidade da área e a concentração para cada açúcar.Após obter a curva padrão, meça os espectrogramas de CLAE das soluções amostrais injetando uma alíquota de 20 microlitros para cada medição. Obtenha as intensidades das áreas das bandas de açúcares no cromatograma de cada solução amostral como anteriormente. Consulte o protocolo em texto para as etapas de realização das medições de ácidos orgânicos por CLAE.Mantenha os mirtilos em um congelador abaixo de menos 80 graus Celsius se eles não forem analisados quanto a antocianinas logo após as medições espectrais. Para realizar o pré-tratamento para as medições de antocianinas por CLAE, liofilize cada fruta congelada em um liofilizador a vácuo por 12 horas. Extraia a antocianina do mirtilo seco em uma solução de ácido trifluoroacético a um por cento em metanol, deixando a mistura em uma geladeira a quatro graus Celsius por 12 horas.Centrifugue o extrato por 15 minutos em um microtubo de dois mililitros usando uma ultracentrífuga a menos oito graus Celsius e 15.000 RPM. Em seguida, filtre o extrato através de um filtro de 0,45 mícron para obter a amostra para as medições de HPLC. Configure o sistema de HPLC utilizando uma coluna de fase reversa C18 em um forno de coluna a 40 graus Celsius.Utilize o método de gradiente usando ácido trifluoroacético aquoso a 0,1 por cento como LUNA e ácido trifluoroacético a 0,5 por cento em acetonitrila como LUNB. Utilize uma vazão de 0,1 mililitros por minuto, na qual a proporção de LUNB aumenta de oito por cento a 15 por cento entre zero e 50 minutos após a injeção.E de 15% a 75% durante 50 a 60 minutos após a injeção. Utilize um detector de arranjo de fotodiodos monitorando em 520 nanômetros. Meça os espectrogramas de HPLC de soluções padrão injetando uma alíquota de 10 microlitros através do amostrador automático para cada medição.Utilize o software da solução LC para a medição. Por fim, meça os espectrogramas de CLAE das soluções amostrais injetando uma alíquota de 10 microlitros por meio do auto-amostrador para cada medição. Neste ponto, a construção de modelos de calibração para a predição do teor dos ingredientes, seguida pela validação desses modelos construídos, é realizada conforme descrito no protocolo textual.Modelos de previsão são construídos utilizando os espectros observados e os teores dos ingredientes determinados por meio do procedimento apresentado aqui. Um exemplo do resultado da validação cruzada do modelo construído para a previsão do teor de açúcares totais é mostrado aqui. A correlação entre os valores previstos por espectroscopia no infravermelho próximo e aqueles determinados por CLAE é satisfatória.Um resultado semelhante é observado para a validação cruzada do modelo para o teor total de antocianinas. Novamente, a correlação entre os valores preditos e os observados é satisfatória. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter valores anteriores do teor de mirtilos com HPLC.A avaliação diferenciada só é possível utilizando modelos construídos adequadamente com base no conteúdo predefinido medido por análise química destrutiva. Isso significa que a análise química prévia de um alvo é essencial para construir modelos preditivos de alto desempenho. Consulte o protocolo textual para obter o procedimento de construção dos modelos preditivos que não são mostrados neste vídeo.Uma vez construídos corretamente, os modelos para predição são aplicáveis à estimativa de açúcares, ácidos orgânicos e quaisquer componentes de mirtilos. A espectroscopia no infravermelho próximo, como mostrado aqui, espera-se que seja aplicável à correlação de muitos tipos de produtos agrícolas. Não se esqueça de que é necessário obter limites predefinidos de conteúdo por meio de análise química para a construção de um bom modelo ao aplicar a espectroscopia no infravermelho próximo à avaliação de qualquer produto agrícola.

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Research

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Chemistry

Química

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Construção de Modelos de Previsão Nondestructive de Conteúdos ingrediente em mirtilos por espectroscopia no infravermelho próximo com base em medições de HPLC (Vídeo) | JoVE Journal

Construção de Modelos de Previsão Nondestructive de Conteúdos ingrediente em mirtilos por espectroscopia no infravermelho próximo com base em medições de HPLC

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