Injeção Artéria Intra-ilíaca para eficiente e seletiva Modelagem de microscópico metástase óssea
26 de setembro de 2016
Este manuscrito fornece o procedimento detalhado de injeção de artéria intra-ilíaca (IIA), uma técnica para entregar células cancerígenas especificamente aos tecidos dos membros posteriores, incluindo ossos, para estabelecer metástases ósseas experimentais. Embora inicialmente estabelecido com modelos de tumor de mama, esse protocolo pode ser facilmente estendido a outros tipos de câncer.
O objetivo geral deste procedimento é estabelecer metástases ósseas experimentais, entregando células cancerígenas diretamente aos tecidos dos membros posteriores, incluindo os ossos, por meio de injeção intra-ilíaca na artéria. Portanto, esse método pode nos ajudar a responder às principais perguntas sobre a colonização óssea do câncer de mama, especialmente na fase inicial desse processo, como as células do câncer de mama interagem com as células do microambiente no osso. Fizemos injeção de artéria ilíaca hoje.
A principal vantagem dessa técnica é que ela estabelece de forma eficiente e seletiva um modelo experimental de metástase óssea microscópica para vários tipos de câncer sem causar danos teciduais locais. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldade porque encontrar uma injeção que seja precisa, a posição de injeção da artéria ilíaca no microscópio pode exigir prática para atingir uma taxa de sucesso de injeção superior a noventa por cento. Comece confirmando o nível apropriado de sedação por pinça de um camundongo de vinte gramas de cinco a seis semanas de idade.
Depois de aplicar a pomada para os olhos, limpe a região da virilha direita raspada várias vezes com cotonetes sequenciais, estéreis e embebidos em etanol isopropílico a 70%, seguidos de uma esfoliação cirúrgica betadine. Em seguida, cubra todo o mouse com uma cortina estéril. Em seguida, use uma lâmina de bisturi de aço carbono número dez estéril e uma alça número três para fazer uma incisão na pele de um a 1,2 centímetro entre o quarto e o quinto mamilos no abdômen inferior direito.
E transfira o animal para um microscópio de dissecção de bancada padrão. Sob a objetiva 4X, insira uma pinça de separação romba na incisão entre o tecido adiposo e o peritônio e empurre os tecidos para fora em ambos os lados para revelar os vasos e nervos ilíacos. Em seguida, use uma pinça reta e fina para romper o tecido conjuntivo entre os vasos e o nervo mais próximo dos vasos.
Em seguida, deslize a pinça angular através do tecido conjuntivo e abaixo dos vasos ilíacos, enquanto insere a pinça reta nos tecidos conjuntivos do outro lado dos vasos para guiar a pinça angular através do tecido. Recomendamos separar e levantar a borda e a artéria ilial como um feixe para esta etapa. Embora as células tumorais sejam injetadas apenas na artéria, economiza tempo e esforço para isolar os dois vasos.
Uma vez que a pinça angulada esteja no lugar, separe ainda mais a veia ilíaca e a artéria do tecido circundante, mantendo os vasos em cima da pinça angular durante a dissecção. Quando os vasos estiverem limpos, use a pinça reta para entregar a ponta de uma sutura de seda 4-0 à pinça angular e puxe a sutura lenta e suavemente sob os vasos. Ambos os vasos da veia comum ilíaca e da artéria devem então ser sustentados pela sutura.
Quando os vasos estiverem prontos, pipete as células tumorais para cima e para baixo várias vezes para ressuspendê-las em uma única solução celular e quebrar quaisquer aglomerados. Em seguida, aspire 100 microlitros de células por camundongo em uma seringa de insulina de calibre 31. Agora, deslize a pinça angular de volta sob os vasos usando a sutura como guia e abra a pinça para que os vasos descansem suavemente nas pontas.
Com a outra mão, insira a ponta da agulha com o lado chanfrado para cima no lúmen da seção da artéria entre as pontas da pinça. Pressione o êmbolo lentamente para injetar as células. A suspensão celular liberará o sangue através do vaso.
Quando todas as células tiverem sido entregues, remova suavemente a agulha, mantendo os vasos levantados na pinça para evitar sangramento. Em seguida, retire a sutura. Por fim, remova rapidamente a pinça e pressione um cotonete na incisão por cinco a 10 minutos para estancar o sangramento.
Aqui, é mostrada uma imagem bioluminescente representativa de todo o animal após injeção intra-ilíaca de cinco vezes 10 para as quintas células de câncer de mama MCF-7 marcadas com luciferina GFP, seguida de administração de d-luciferina por injeção de seio retroorbital. No dia 14 após a injeção, um forte sinal de bioluminescência foi obtido do osso posterior injetado pela artéria intra-ilíaca, mas não do osso de controle contralateral, confirmando a localização específica das células injetadas. A secção de uma coloração H & E dos ossos portadores de tumor também demonstrou uma população de células compacta, semelhante a paralelepípedos, com grandes núcleos indicativos de lesões metastáticas microscópicas MCF-7 no tecido ósseo 14 dias após a injeção da artéria intra-ilíaca.
Além disso, a coloração imunofluorescente das seções ósseas também revelou uma mistura das células MCF-7 com osteoblastos e pré-osteoblastos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em dez a quinze minutos. Seguindo esses procedimentos, você pode usar outros métodos para responder a perguntas adicionais.
Por exemplo, podemos usar RNA-Seq para traçar o perfil das células do microambiente no nicho de metástase e compará-las com células normais. Essa técnica fornece uma maneira para os pesquisadores de câncer de mama e de próstata estudarem a micrometástase óssea em animais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estabelecer um modelo de metástase óssea de câncer de mama por injeção intra-ilíaca
Por favor, tome as devidas precauções, pois trabalhar com cetamina e xilazina pode ser extremamente perigoso.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este manuscrito descreve a técnica de injeção na artéria ilíaca interna (IIA) para entrega de células cancerígenas aos tecidos da pata traseira, incluindo ossos, com o objetivo de estabelecer metástases ósseas experimentais. Este método é particularmente útil para estudar as interações de células de câncer de mama com o microambiente ósseo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oncologia
- Técnicas Experimentais
Contexto
- A metástase óssea é uma complicação comum em pacientes com câncer.
- Compreender os mecanismos de colonização das células cancerígenas no osso é essencial para o desenvolvimento de terapias.
- O método de injeção na artéria ilíaca permite a entrega direcionada de células cancerígenas.
- Essa técnica minimiza os danos teciduais locais em comparação com outros métodos.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um modelo para estudar metástase óssea.
- Investigar as interações entre células de câncer de mama e células do microambiente ósseo.
- Aprimorar a precisão e a taxa de sucesso da técnica de injeção.
Métodos Utilizados
- Injeção intra-arterial ilíaca de células cancerígenas.
- Uso de um modelo de camundongo com cinco a seis semanas de idade.
- Monitoramento dos níveis de sedação por meio do aperto dos dedos dos pés.
- Prática de técnicas de injeção para alcançar altas taxas de sucesso.
Resultados Principais
- A técnica permite o estabelecimento eficiente de modelos de metástase óssea.
- Taxas elevadas de sucesso podem ser alcançadas com prática.
- Danos mínimos aos tecidos locais são observados com este método.
- Obtêm-se informações sobre as fases iniciais da colonização por células de câncer de mama.
Conclusões
- A injeção intra-arterial ilíaca é uma ferramenta valiosa para a pesquisa do câncer.
- Este método pode ser adaptado para diversos tipos de câncer além do câncer de mama.
- Estudos futuros podem aprimorar a compreensão das interações entre câncer e osso.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estabelecimento de modelos confiáveis de metástase óssea em estágio inicial permanece um desafio crítico na descoberta de fármacos em oncologia, particularmente para a avaliação de intervenções terapêuticas direcionadas à colonização micrometastática. A técnica de injeção na artéria ilíaca permite a disseminação sincronizada no tempo e no espaço de células cancerígenas para os ossos das patas traseiras, favorecendo a quantificação robusta de células tumorais disseminadas e reduzindo respostas inflamatórias confundidoras decorrentes de danos teciduais do procedimento. Essa abordagem aumenta a confiabilidade preditiva em estudos pré-clínicos ao permitir o monitoramento contínuo de lesões ósseas indolentes sem metástase sistêmica em órgãos, melhorando assim a relevância translacional dos modelos de metástase óssea para esforços de validação de alvos e identificação de compostos líderes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da modelagem das interações iniciais de células cancerígenas com componentes do microambiente ósseo, como osteoblastos e pré-osteoblastos.
- Valor Operacional: Oferece uma rota seletiva e eficiente para a entrega de células cancerígenas aos ossos das patas traseiras, facilitando a geração consistente de modelos em coortes experimentais.
- Valor Estratégico: Apoia a desmistificação mecanicista das vias de metástase óssea, permitindo a visualização da progressão de micrometástases, desde células isoladas até lesões multicelulares, por meio de leituras bioluminescentes e histológicas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera saídas quantificáveis, como intensidade do sinal de bioluminescência e densidade de lesões histológicas, permitindo a avaliação padronizada da carga metastática.
- Valor Operacional: Evita danos teciduais locais e os confundidores associados à cicatrização de feridas, melhorando a reprodutibilidade do ensaio e reduzindo a variabilidade nas análises subsequentes.
- Valor Estratégico: Produz sistemas relevantes para a doença com mínima metástase em órgãos fora do alvo, permitindo janelas prolongadas de observação para estudos de resposta à dose e cronometragem em campanhas de triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Alinha-se a sistemas relevantes para doenças ao capturar a progressão de células tumorais disseminadas para micrometástases no osso, um entrave clínico fundamental.
- Valor Operacional: Permite continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, apoiando análises longitudinais por imagem e análises terminais, como coloração com hematoxilina e eosina (H&E) e imunofluorescência.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avanço com base no risco ao fornecer sinais precoces de eficácia de compostos que interrompem a coexistência de câncer e estroma ou a formação de nichos no microambiente ósseo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método de injeção na artéria ilíaca interna insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores e os testes de eficácia pré-clínicos, especialmente para terapêuticas direcionadas ao osso, nas quais a modelagem precoce de metástases contribui para a compreensão mecanicista e definição de janelas terapêuticas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre as interações entre células cancerígenas e o microambiente ósseo, permitindo a entrega controlada de células tumorais a sítios esqueléticos.
- Triagem: Fornece sistemas biológicos prontos para ensaio com leituras quantitativas de bioluminescência e histopatológicas, adequadas para plataformas de triagem de alto conteúdo.
- Análises: Gera variáveis dependentes mensuráveis, incluindo fluxo de fótons proveniente da bioluminescência, área da lesão em cortes histológicos e índices de co-localização de células tumorais e estromais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao modelar a fase micrometastática avascular, que precede a progressão osteolítica ou osteoblástica na metástase óssea clínica.
- Reutilização Empresarial: Representa uma técnica cirúrgica padronizada, adaptável entre diferentes tipos de câncer e laboratórios, promovendo consistência entre projetos na geração de modelos de metástase óssea.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir o ruído proveniente da inflamação procedural e permitir a atribuição clara de alterações fenotípicas aos mecanismos do fármaco.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade por meio de marcos anatômicos definidos e isolamento vascular guiado por sutura, minimizando a variabilidade dependente do operador.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência das decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer leituras precoces e específicas de metástases em órgãos, reduzindo falhas em estágios avançados devido à tropismo ósseo inesperado.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco de candidatos direcionados ao osso, permitindo a comparação direta da carga metastática entre diferentes grupos de tratamento em modelos sinogênicos ou xenografts.
Considerações sobre a Implementação
- Exige proficiência em técnicas microcirúrgicas, incluindo isolamento de vasos e ligadura com sutura sob microscopia de dissecação.
- Depende do acesso a microscópios de dissecação estéreis, pinças finas, seringas de insulina e equipamentos para preparação de suspensão celular isotônica.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de anestesia (por exemplo, cetamina/xilazina) e do monitoramento pós-operatório para garantir o bem-estar animal e a consistência do modelo.
- As considerações para adaptação incluem o ajuste do volume de injeção e da concentração celular com base na agressividade da linhagem celular tumoral e na variabilidade da linhagem murina.
- As limitações práticas incluem uma curva de aprendizado para alcançar uma taxa de sucesso na injeção superior a 90% e a necessidade de técnica asséptica para prevenir contaminação peritoneal durante a incisão inguinal.
