Murino próstata Micro-dissecção e castração cirúrgica

O objetivo geral desses procedimentos é permitir o estudo da próstata, bem como as diferentes condições hormonais dentro do camundongo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer de próstata, como quais são os efeitos na privação hormonal na carcinogênese da próstata. A principal vantagem desta técnica é que os efeitos de vários processos patológicos e alterações hormonais podem ser estudados em glândulas prostáticas individuais.

Comece prendendo um camundongo a uma placa de dissecação em decúbito dorsal através da almofada do pé de cada pata e borrifando o abdômen com etanol a 70%. Em seguida, segurando a pele da parte inferior do abdômen com uma pinça, use uma tesoura para cortar a pele e o peritônio aproximadamente um centímetro anterior à abertura do pênis. Continue a cortar a pele e o peritônio da parte inferior do abdômen até os dois lados do abdômen até a caixa torácica, expondo a cavidade peritoneal.

Depois de identificar a localização da bexiga e do trato urogenital, ou UGT, mova suavemente a gordura e outros órgãos para o lado para expor os tecidos urinários. Em seguida, usando uma pinça, segure um ducto deferente em sua base perto da uretra e rasgue o vaso. Depois de remover o outro ducto, use uma pinça para segurar e puxar cuidadosamente a bexiga, enquanto simultaneamente usa uma tesoura para cortar a uretra abaixo da próstata ventral e aproximadamente um centímetro abaixo da base da bexiga.

Transfira o UGT colhido para uma placa de Petri de 60 a 100 milímetros contendo aproximadamente cinco a 10 mililitros de PBS e coloque a placa sob um microscópio de dissecação. Em seguida, pegue um par de pinças finas em cada mão, segurando os instrumentos como lápis, e descanse os antebraços na bancada, em ambos os lados do microscópio, para mantê-los firmes. Posicione o UGT com a pinça, de modo que a bexiga fique voltada para cima, a uretra apontada para baixo e as vesículas seminais posicionadas em ambos os lados da bexiga.

Segurando a uretra com uma pinça, use a outra pinça para retirar cuidadosamente a gordura sem remover nenhum tecido da próstata. Quando toda a gordura tiver sido removida, rasgue o tecido conjuntivo entre os dois lobos ventrais da próstata para separá-los. Em seguida, segurando um dos lobos ventrais perto da ponta com um par de pinças, segure a base do lobo o mais próximo possível da uretra.

Agora, mova o outro par de pinças para conter a uretra enquanto puxa o lóbulo para longe do vaso com um movimento firme e suave. Confirme se nenhum tecido prostático permanece ligado à uretra. Em seguida, coloque o lóbulo no meio apropriado, de acordo com a próxima etapa experimental.

Depois de isolar o outro lobo ventral da mesma maneira, use uma pinça para puxar suavemente um dos lobos anteriores para longe da vesícula seminal, tomando cuidado para não perfurar a vesícula seminal. Então, uma vez que o lobo seja independente da vesícula seminal, remova-o da mesma maneira que acabamos de demonstrar para o lobo ventral. Depois de isolar o segundo lobo anterior, vire o UGT restante, de modo que a próstata dorsal fique visível, e use uma pinça para rasgar o tecido conjuntivo entre os dois lobos laterais dorsais e entre os lobos e a região posterior das vesículas seminais.

Em seguida, remova os lobos laterais dorsais individuais, como acabamos de demonstrar. Para realizar a castração, comece colocando um camundongo anestesiado em uma superfície limpa e estéril em decúbito dorsal e confirme o nível apropriado de sedação beliscando o dedo do pé. Se o mouse não reagir, use um barbeador elétrico para raspar a área cirúrgica e esterilizar o abdômen.

Em seguida, use uma tesoura cirúrgica estéril para fazer uma incisão vertical de um centímetro através da pele da linha média do abdômen inferior, aproximadamente um ponto cinco centímetros anterior ao pênis, seguida de uma incisão menor através do peritônio, tomando cuidado para não cortar nenhum órgão. Usando uma pinça estéril, levante suavemente a borda cortada do peritônio para visualizar a cavidade peritoneal e use outra pinça estéril para puxar uma das almofadas de gordura testicular até que os testículos apareçam. Em seguida, use uma caneta cauterizada para cortar lentamente a almofada de gordura, segurando os testículos até que a artéria testicular seja cortada.

Se a artéria for cortada muito rápido, o vaso pode sangrar muito, exigindo a eutanásia do camundongo. Recomendo aquecer o curral de cautério em jatos e não deixá-lo esquentar muito, movendo o instrumento lentamente pela artéria para que o animal não sangre. Uma vez que a almofada de gordura e a artéria tenham sido cortadas, descarte os testículos e a almofada de gordura e repita a castração para os outros testículos.

Após a remoção do segundo testículo, feche o peritônio com suturas de seda estéreis e grampeie a pele com clipes de ferida cirúrgica. Em seguida, administre analgesia para controlar a dor e coloque o camundongo em uma gaiola limpa, em um aquecedor de gaiola, por 5 a 10 minutos com monitoramento, até que esteja totalmente recuperado. O trato urogenital completo é composto por todos os seis lobos da próstata, a bexiga, as vesículas seminais e a uretra.

O ducto deferente se liga à uretra, mas é desnecessário para a miro-dissecção da próstata e, portanto, pode ser descolado antes da remoção da UGT. O trato urogenital permanecerá intacto depois de removido do abdômen; coberto de tecido adiposo que precisa ser removido para ter acesso aos lóbulos da próstata. Neste experimento representativo, a castração foi seguida por dois ciclos de regeneração hormonal, e os níveis de testosterona no soro foram monitorados por ELISA.

Como esperado, em condições de castração, os níveis de testosterona praticamente desapareceram. Na presença de tamoxifeno, um modulador seletivo do receptor de estrogênio, não foi observada diferença significativa para a condição hormonalmente normal. Após a castração, no entanto, a reintrodução da testosterona causou um aumento dramático nos níveis séricos de testosterona.

Após a microdissecação, os lobos da próstata de camundongos castrados são significativamente diminuídos, enquanto os lobos de animais tratados com testosterona se recuperam ao seu tamanho original. Além disso, a coloração de hematoxilina e eosina do tecido anterior da próstata em condições normais, castradas e regeneradas revela uma redução dramática no crescimento robusto do tecido nas seções dos animais castrados. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em cinco minutos por mouse, se for executada corretamente.

Ao tentar a castração, é importante lembrar de manter tudo estéril e certificar-se de controlar a dor sentida pelo rato. Após a castração, outros métodos, como a reintrodução de andrógenos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre os efeitos da testosterona nos tumores de próstata. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do câncer de próstata explorarem a carcinogênese, o desenvolvimento e a resistência à castração em camundongos.