Isolamento de células de camundongo Coronária endoteliais

O objetivo geral deste experimento é obter um grande número de células endoteliais coronárias de camundongo altamente purificadas e de alta qualidade. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa cardiovascular. A principal vantagem desta técnica é que ela facilita a aquisição de um alto rendimento de células endoteliais de boa qualidade.

Demonstrando este procedimento estarão Shizhen Luo, especialista em pesquisa, e Dr. Ayako Makino, nosso investigador principal. Até uma semana antes do procedimento, adicione um mililitro de tampão CD31 a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro por amostra. Em seguida, misture grânulos de IGG antirrad de ovelha com pipetagem suave e adicione o volume apropriado de grânulos a cada tubo.

Depois que todas as contas forem adicionadas, agite os tubos vigorosamente 30 vezes e coloque-os em uma placa magnética por um minuto de agitação. Em seguida, com os tubos ainda presos à placa, descarte o tampão e adicione um mililitro de tampão CD31 fresco a cada tubo. Adicione dois microlitros de anticorpo anti-camundongo CD31 rad e coloque os tubos em um rotador a quatro graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, transfira os tubos sob uma capela de fluxo laminar e coloque-os de volta na placa magnética agitando por um minuto. Em seguida, substitua o sobrenadante por um mililitro de tampão CD31 fresco e agite os tubos vigorosamente com a mão 30 vezes. Após a terceira lavagem, retorne os tubos ao rotador a quatro graus Celsius.

No dia do procedimento, comece injetando no animal experimental por via intraperitoneal 0,1 mililitros de heparina para evitar a coagulação do sangue. Após dez minutos, anestesiar o mouse com uma injeção de 0,01 mililitros de pentobarbital. Em seguida, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé.

Depois de remover o tecido cardíaco e pulmonar juntos, coloque-os em um copo de tampão Krebs e enxágue os tecidos com uma agitação suave. Em seguida, transfira os tecidos para um prato de seis centímetros contendo Krebs frescos e use uma tesoura e um antecedentes para remover os lobos pulmonares. Agora insira um cateter de calibre 20 na aorta e lave o sistema circulatório coronário com HBSS suplementado com heparina.

Quando todo o sangue tiver sido removido, faça um pequeno corte no ventrículo, enxágue o coração com uma agitação suave e coloque o tecido cardíaco em um tubo de amostra no gelo. Depois de digerir o tecido para liberar as células endoteliais coronárias, faça uma pelota e lave as células duas vezes com cinco mililitros de tampão de lavagem. Em seguida, coloque um tubo das contas previamente preparadas na placa magnética e agite o tubo três vezes para distribuir uniformemente as contas.

Após a segunda lavagem, remova o máximo de sobrenadante possível sem interromper o pellet e associe as células a movimentos vigorosos. Em seguida, ressuspenda as células em um mililitro de tampão de lavagem com uma mistura suave e descarte o tampão CD31 das contas. Combine as células com as contas e sacuda o tubo 30 vezes.

Em seguida, coloque a solução de células e esferas no rotador a quatro graus Celsius por 30 minutos. Enquanto as células estão incubando, cubra a superfície de uma câmara de revestimento por amostra com solução de gelatina e coloque as câmaras a 37 graus Celsius por 30 minutos. Quando a gelatina solidificar, remova o excesso de solução de gel e seque bem a superfície da câmara.

Em seguida, transfira as células conjugadas com esferas para a placa magnética sob o capô por dois minutos de agitação e descarte o tampão de lavagem. Adicione um mililitro de tampão de lavagem fresco às células e remova o tubo da placa para 30 agitações vigorosas, seguidas de 30 movimentos. Retorne o tubo ao prato para mais um minuto de agitação.

Após a última agitação, retorne o tubo à placa magnética para um minuto final de agitação e substitua o tampão de lavagem por um mililitro de meio de célula endotelial a 37 graus Celsius, complementado com soro de bezerro fortificado com 20% de ferro. Agite e agite os tubos 30 vezes finais. Em seguida, use uma pipeta de um mililitro ajustada para 500 microlitros para agitar as células conjugadas dez vezes e transfira alíquotas de 500 microlitros de células endoteliais coronárias para cada poço da câmara de plaqueamento para incubação noturna a 37 graus Celsius.

No dia seguinte, lave as células em meio de células endoteliais, suplementado com dez por cento de FBS. A pureza das células endoteliais coronárias isoladas por este método pode ser confirmada pela coloração imuno-histoquímica contra os marcadores de superfície celular endotelial, lectina BS e AC LDL, com mais de 90% das células demonstrando uma expressão duplamente positiva de ambos os marcadores em uma cultura típica de células endoteliais coronárias de camundongo. Após esse procedimento, como método, várias imagens de sangue, imunorrecepção e fluorescência podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais, como qual proteína pode ser modificada durante diferentes estados de doença.

Após seu desenvolvimento, essa técnica fornece as ferramentas necessárias para que os pesquisadores expandam suas pesquisas no campo das células endoteliais coronarianas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar células endoteliais coronárias de camundongos de alta quantidade e qualidade. Existem vários pontos-chave durante este procedimento.

O mais importante é manter um ambiente estéril durante todo o isolamento. A segunda é lavar o sangue completamente e o mais rápido possível para evitar a coagulação do sangue na rede capilar. A terceira é medir o pH de todo o tampão, especialmente o tampão CD31.