Um Guia para Estruturado iluminação TIRF microscopia de alta velocidade com várias cores
30 de maio de 2016
Este artigo fornece um guia detalhado para a montagem e operação de um microscópio de iluminação estruturada operando com iluminação de fluorescência de reflexão interna total (TIRF-SIM) para obter imagens de processos biológicos dinâmicos com super-resolução óptica em várias cores.
O objetivo geral deste protocolo é construir e alinhar um microscópio de iluminação estruturada adequado para imagens de super-resolução de células vivas de alta velocidade, capaz de operar nos modos TIRF e de seccionamento óptico com várias cores. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia celular que atualmente não podem ser respondidas usando microscopia TIRF limitada por difração padrão. A principal vantagem desta técnica é sua resolução de tempo rápida em comparação com outras técnicas de microscopia de super resolução, o que a torna adequada para processos dinâmicos de imagem em células vivas.
Embora este protocolo descreva as etapas para a construção de um microscópio TIRF-SIM, a configuração é flexível e facilmente modificada para implementar modalidades de imagem como 3D-SIM, SIM multifocal e SIM não linear. Para organizar e alinhar o caminho de excitação para um microscópio de iluminação estruturada, comece marcando as posições dos componentes na mesa óptica conforme indicado aqui. Depois de inserir o primeiro espelho dicróico, DM4, na torre do cubo de filtro da estrutura do microscópio, insira o segundo espelho dicróico, DM3, em uma montagem de espelho cinemático quadrado de uma polegada e posicione-o a uma distância focal da lente do condensador, L5. Em seguida, para definir com precisão o acesso óptico do sistema, remova a lente objetiva, OB, da torre e, em vez disso, aparafuse uma ferramenta de alinhamento.
Em seguida, use o espelho dicróico DM3 e um espelho de alinhamento temporário posicionado na localização final aproximada do SLM para direcionar um feixe de referência colimado do laser um através do centro dos orifícios nos dois discos de alinhamento. Usando três espelhos e o espelho dicróico DM2 conforme ilustrado aqui, direcione o feixe do laser um para o espelho temporário. Uma vez determinado o eixo óptico grosseiro, remova a ferramenta de alinhamento.
Em seguida, insira uma íris no caminho do feixe antes que ela entre no corpo do microscópio e centralize-a no feixe. Prenda um pedaço de cartão branco com um pequeno orifício centralizado na íris e reinsira a lente objetiva. Em seguida, faça ajustes angulares iterativos nos espelhos DM3 e na posição SLM para centralizar o reflexo traseiro no cartão com o feixe de entrada.
Em seguida, remova temporariamente a lente objetiva e marque o ponto de laser no teto para criar uma posição de referência. Insira a lente do tubo, L5, a aproximadamente uma distância focal da objetiva, montando-a em um estágio de translação linear definido para transladar ao longo da direção do feixe de referência. Ajuste a posição e o ângulo da lente do tubo de forma que o feixe que sai da objetiva seja colimado e atinja o ponto de referência no teto.
Verifique se a lente está perpendicular ao feixe, verificando novamente o reflexo traseiro com a íris e o cartão branco. Em seguida, remova a lente objetiva e insira a segunda lente do telescópio de retransmissão de imagem, L4. Use o estágio de translação linear para ajustar a posição e o ângulo desta lente para manter a colimação e garantir que o feixe de referência ainda atinja o ponto marcado no teto. Substitua a lente objetiva e insira a primeira lente do telescópio, L3. Ajuste a posição e o ângulo desta lente para garantir colimação e não deflexão, conforme descrito anteriormente.
Após montar o chip SLM de acordo com o protocolo de texto, com as lentes alinhadas, insira o SLM no lugar do espelho. Ajuste a posição do SLM de forma que o feixe de referência fique localizado no centro do chip SLM e ajuste o ângulo para que o feixe passe pelas duas lentes do relé. Em seguida, verifique se o feixe de referência ainda está centralizado no ponto marcado.
Monte o retardador variável de cristal líquido, ou LCVR, com seu eixo rápido a 45 graus em relação à polarização incidente. Em seguida, após completar o alinhamento do rotador de polarização de acordo com o protocolo de texto, usando luz transmitida através das oculares, concentre-se em um retículo e fixe a lente objetiva nesta posição. Em seguida, prepare uma monocamada de esferas fluorescentes espalhando uma gota de contas multicoloridas de 100 nanômetros em uma lamínula número 1,5.
Deixe as contas secarem para adsorvê-las no copo antes de mergulhar novamente na água. Usando óleo de imersão, coloque a amostra de esferas na objetiva. Ajuste com precisão a posição da câmera para que a camada de esferas fluorescentes fique em foco.
Depois de gerar padrões de grade binária SIM como arquivos bitmap e carregá-los no SLM de acordo com o protocolo de texto, carregue o software de controle SLM e clique em Conectar. Na guia Repertório, clique em Carregar" para abrir o arquivo de repertório e verificar o número de ordens em execução contidas no arquivo. Clique em Enviar para o Conselho"para carregar o arquivo de repertório para o SLM.
Em seguida, selecione a guia "Status" e insira o número da ordem de execução. Clique em Selecionar" para alterar a ordem de execução para a grade de alinhamento. Insira uma máscara espacial, ou SM, montada em um estágio XY no caminho do feixe na posição focal de L3 e traduza sua posição em relação ao eixo óptico de modo que apenas as primeiras ordens desejadas sejam passadas.
Diretamente após o filtro espacial, apenas dois feixes circulares serão visíveis. Verifique a imagem da camada de esferas fluorescentes na câmera. Se os dois feixes circulares não estiverem sobrepostos conforme ilustrado aqui, reposicione o plano de amostra, ajustando iterativamente a lente objetiva e a posição da câmera.
Depois de ajustar o foco e definir o plano de amostra de acordo com o protocolo de texto, confirme a iluminação TIRF por imagem, por exemplo, uma solução de corante rodamina 6G 10 micromolar, colocando o corante em foco. Se os dois feixes incidirem no ângulo TIRF correto, as moléculas individuais serão visíveis sem fundo alto e as bordas da abertura circular estarão em foco. Ajustes finos na posição dos feixes podem ser feitos ajustando o espelho dicróico DM3.
Para sincronizar e calibrar o sistema, coloque a amostra de monocamada de esferas na objetiva e coloque em foco. Use o software de controle SLM para programar o SLM para exibir cada uma das três imagens de deslocamento de fase por vez para a primeira orientação do padrão. Em seguida, mude para a ordem de execução quatro do repertório de exemplo.
No software de aquisição, configure a câmera para o período de exposição global escolhendo Propriedades avançadas da câmera "e definindo Tipo de gatilho de saída 1" para positivo e Tipo de gatilho de saída 2" para negativo. No painel de sequência, em Tipo de Verificação, selecione Registro de Disco Rígido e defina a contagem de quadros como três. Em seguida, clique em Iniciar"para adquirir três quadros.
O padrão SLM mudará a cada exposição. Depois de calcular o sistema de acordo com o protocolo de texto, no software de controle SLM, mude a ordem de execução do SLM para a série completa de nove imagens de grade binária necessárias para TIRF-SIM. Esta é a ordem de execução zero no repertório de exemplo.
Depois de adquirir nove imagens da amostra de contas, no painel de sequência do software da câmera, selecione Gravação de disco rígido "como o tipo de varredura e altere a contagem de quadros para nove. Em seguida, clique em Iniciar"para adquirir imagens. Por fim, em Salvar imagens em buffer, escolha TIFF como o tipo de imagem e clique em OK. Reconstrua uma imagem de super-resolução de acordo com o protocolo de texto.
Mostrado aqui, contas fluorescentes multicoloridas de 100 nanômetros de diâmetro foram fotografadas para comparar o TIRF padrão com o TIRF-SIM. O TIRF-SIM claramente teve uma resolução lateral significativamente maior em comparação com o TIRF. A resolução estimada do microscópio é de 90 nanômetros e 120 nanômetros para TIRF-SIM de 488 e 640 nanômetros, respectivamente.
Isso corresponde a uma melhoria de duas vezes na resolução lateral para ambos os comprimentos de onda em comparação com o caso limitado de difração teórica. Como visto aqui, fibrilas amilóides marcadas com fluorescência foram formadas in vitro e também usadas como amostra de teste para demonstrar resolução dupla. Estruturas subcelulares com alto contraste, como microtúbulos marcados com emGFP ou LifeAct-GFP, são ideais para imagens TIRF-SIM e produzem imagens de alto contraste e super-resolução.
Aimagem TIRF-SIM usando a configuração demonstrada permite a observação de uma subpopulação de microtúbulos localizados nas proximidades do córtex basocelular, e a polimerização e despolimerização dos microtúbulos podem ser vistas ao longo do tempo. Amostras de baixo contraste sem estruturas discretas carecem de informações de alta resolução, exceto nas bordas da membrana plasmática e, portanto, são abaixo do ideal para imagens TIRF-SIM. Finalmente, o alto contraste de modulação é essencial para uma imagem SIM bem-sucedida.
Como demonstrado aqui, a transformada de Fourier da imagem reconstruída permite a visualização da função de transferência óptica do SIM. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em cerca de uma semana, se todas as peças necessárias tiverem sido adquiridas. Ao tentar este procedimento, deve-se estar ciente dos problemas mais críticos para a implementação bem-sucedida do TIRF-SIM.
Primeiro, o alinhamento preciso das vigas é essencial. Isso pode ser difícil, pois eles devem estar localizados nas bordas da abertura da lente objetiva. Em segundo lugar, é fundamental que o estado de polarização da luz seja co-girado com o padrão.
Sem isso, o contraste do padrão da amostra será baixo e a construção subsequente da imagem será impossível. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão das etapas mais importantes na construção e alinhamento de um microscópio TIRF-SIM baseado em SLM. Não se esqueça de que trabalhar com lasers Classe 3B pode ser extremamente perigoso.
A potência do laser deve ser mantida em níveis seguros para os olhos durante a execução do processo de alinhamento com a objetiva TIRF instalada.
Visão Geral
Este artigo fornece um guia detalhado para a construção e alinhamento de um microscópio de iluminação estruturada para imageamento super-resolutivo de células vivas em alta velocidade utilizando TIRF-SIM. Este método é vantajoso para o imageamento de processos biológicos dinâmicos em múltiplas cores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Técnicas de Microscopia
- Imagem de Super-Resolução
Antecedentes
- A microscopia TIRF padrão possui limitações na resolução de processos dinâmicos.
- Técnicas de super-resolução aprimoram as capacidades de imagem.
- A microscopia de iluminação estruturada (SIM) oferece maior resolução temporal.
- Este protocolo permite modificações flexíveis no conjunto do microscópio.
Objetivo do Estudo
- Construir um microscópio TIRF-SIM para imageamento avançado.
- Permitir o estudo de processos biológicos que exigem alta resolução temporal.
- Fornecer um protocolo detalhado para que pesquisadores possam replicar a montagem.
Métodos Utilizados
- Alinhamento de componentes ópticos, incluindo espelhos dicróicos e lentes.
- Uso de um retardador variável de cristal líquido para controle de polarização.
- Preparação de amostras de microesferas fluorescentes para calibração.
- Implementação de software de controle de modulador espacial de luz para geração de padrões.
Resultados Principais
- Alinhamento bem-sucedido do microscópio TIRF-SIM.
- Demonstração das capacidades de imageamento com microesferas fluorescentes.
- Verificação das condições de iluminação TIRF.
- Estabelecimento de um protocolo para estudos futuros de imageamento.
Conclusões
- A configuração TIRF-SIM permite a aquisição de imagens em alta velocidade de processos dinâmicos.
- Este método pode responder perguntas em biologia celular anteriormente inatingíveis.
- A flexibilidade da configuração permite diversas modalidades de aquisição de imagens.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem de super-resolução multicolorida de alta velocidade atende à necessidade de visualização de processos dinâmicos em ensaios com células vivas, permitindo a desmistificação mecanicista de alvos terapêuticos por meio da observação direta de dinâmicas subcelulares. A TIRF-SIM fornece confiança preditiva na validação de alvos ao resolver interações proteicas e eventos de tráfego em escala nanométrica com fidelidade temporal, apoiando decisões de avanço ou interrupção no estágio inicial de descoberta. Essa capacidade aprimora o desenvolvimento de ensaios para triagem fenotípica ao fornecer leituras quantitativas e com resolução espacial que aumentam a confiança no alvo e reduzem falsos positivos na identificação de compostos líderes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da visualização da localização e dinâmica de proteínas com resolução de 90-120 nm em células vivas.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio da observação direta da polimerização e despolimerização de microtúbulos próximo à cortex basal.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança em estudos de engajamento de alvos ao resolver subpopulações de microtúbulos e fibrilas amiloides com resolução lateral dobrada em comparação aos limites de difração.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho posteriores, calibrando com monocamadas de microesferas fluorescentes para estabelecer parâmetros de resolução.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade do ensaio por meio da geração sincronizada de padrões SLM, controle de comprimento de onda e disparo da câmera para aquisição consistente de quadros.
- Escalabilidade: Facilita a reutilização da plataforma em diferentes comprimentos de onda de excitação (488 nm, 640 nm) e modalidades de imagem, incluindo TIRF e modos de seccionamento óptico.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta observações de descoberta de estruturas subcelulares (por exemplo, microtúbulos emGFP, LifeAct-GFP) à validação pré-clínica por meio de imagens de super-resolução com alto contraste.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite a redução de riscos mecanicistas ao visualizar processos dinâmicos em células vivas que são invisíveis à TIRF padrão, orientando a seleção de alvos.
- Sistema Relevante para Doenças: Demonstra aplicabilidade a modelos de células vivas, apoiando o alinhamento de biomarcadores para processos como a dinâmica de microtúbulos na neurodegeneração ou no câncer.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Posiciona o método na fase inicial de descoberta até a identificação de compostos líderes, onde a resolução em escala nanométrica de processos dinâmicos fornece subsídios para a validação de alvos e a preparação de ensaios para triagem de compostos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao resolver distribuições e dinâmicas proteicas em escala nanométrica em modelos de células vivas.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio de imagens quantitativas com alta taxa de quadros (até 10 Hz) e capacidade multicolorida para avaliação confiável de compostos.
- Análises: Fornece saídas estatísticas por meio de imagens de super-resolução reconstruídas e validação da função de transferência óptica baseada em transformada de Fourier para comparação de condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio de imagens relevantes para doenças de estruturas subcelulares com alto contraste e resolução.
- Reutilização Corporativa: Estrutura o sistema como uma capacidade reutilizável para múltiplas modalidades de imagem (TIRF-SIM, 3D-SIM, SIM multifocal) em diversos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista em imagem de células vivas.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio do controle automatizado da polarização, estrutura espacial e sincronização de comprimento de onda.
- Valor Estratégico: Decisões mais eficazes de prosseguir/não prosseguir, eficiência do capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados mediante visualização precoce da dinâmica do alvo.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco, com base na observação direta do comportamento do alvo terapêutico em contextos fisiologicamente relevantes.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em alinhamento óptico, segurança com laser (Classe 3B) e geração de padrões baseada em moduladores espaciais de luz (SLM) para iluminação estruturada.
- Requer instrumentação para controle de polarização (retardador variável de cristal líquido), acionamento de câmera de alta velocidade e integração de laser de múltiplos comprimentos de onda.
- Exige padronização entre equipes para configuração da mesa óptica, posicionamento de componentes e protocolos de calibração utilizando monocamadas de microesferas fluorescentes.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes tipos de amostras, já que amostras de baixo contraste não possuem informações de alta resolução exceto nas bordas das membranas.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de alto contraste de modulação para obtenção bem-sucedida de imagens por SIM e alinhamento preciso dos feixes nas aberturas da objetiva.
