Name: Um Guia para Estruturado iluminação TIRF microscopia de alta velocidade com várias cores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Aprenda a construir e alinhar um microscópio TIRF-SIM para imagens super-resolvidas de alta velocidade em células vivas. Este método permite estudar processos dinâmicos celulares com resolução temporal superior à microscopia TIRF padrão.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Leverhulme, da Engenharia e Ciências Físicas Research Council [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1]; Alzheimer Research UK [áruk-EG2012A-1]; Wellcome Trust [089703 / Z / 09 / Z] e do Conselho de Pesquisa Médica [MR / K015850 / 1, MR / K02292X / 1]. Agradecemos E. Avezov e M. Lu por transfecção do LifeAct-GFP e células citosólica-GFP, respectivamente, e W. Chen para a preparação da cultura de células HEK293. Agradecemos também K. O&#39;Holleran para assistência com o design do microscópio, e L. Shao e R. Heintzmann para discussões e sugestões úteis.

<ol><li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laterally+modulated+excitation+microscopy%3A+improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating%5BTitle%5D)+AND+%22BiOS+Eur%22%5BJournal%5D)">Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> BiOS Eur. 3568, 185-196 (1999).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Shim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+Nanoscopy+of+Actin+Dynamics+in+Synapses+Deep+Inside+Living+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices.</a> Biophys. J. 101 (5), 1277-1284 (2011).</li>
<li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Mol. Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li>
<li>Westphal, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-Rate+Far-Field+Optical+Nanoscopy+Dissects+Synaptic+Vesicle+Movement%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Video-Rate Far-Field Optical Nanoscopy Dissects Synaptic Vesicle Movement.</a> Science. 320 (5873), 246-249 (2008).</li>
<li>Davies, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYK4+Promotes+Antiparallel+Microtubule+Bundling+by+Optimizing+MKLP1+Neck+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">CYK4 Promotes Antiparallel Microtubule Bundling by Optimizing MKLP1 Neck Conformation.</a> PLOS Biol. 13 (4), e1002121(2015).</li>
<li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+herpes+simplex+virus+by+optical+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging.</a> Nat. Commun. 6, 5980(2015).</li>
<li>Pinotsi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+heterogeneous+amyloid+fibril+growth+kinetics+via+two-color+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct observation of heterogeneous amyloid fibril growth kinetics via two-color super-resolution microscopy.</a> Nano Lett. 14 (1), 339-345 (2014).</li>
<li>Esbjörner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+amyloid+%CE%B2+Self-assembly+in+live+cells+provide+insights+into+differences+in+the+kinetics+of+A%CE%B2%281-40%29+and+A%CE%B2%281-42%29+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observations of amyloid β Self-assembly in live cells provide insights into differences in the kinetics of Aβ(1-40) and Aβ(1-42) aggregation.</a> Chem. Biol. 21 (6), 732-742 (2014).</li>
<li>Michel, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+monomeric+tau+protein+is+sufficient+to+initiate+the+spread+of+tau+protein+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Extracellular monomeric tau protein is sufficient to initiate the spread of tau protein pathology.</a> J. Biol. Chem. 289 (2), 956-967 (2014).</li>
<li>Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Super-Resolution+Imaging+of+%CE%B2-Amyloid+Aggregation+In+Vitro+and+In+Vivo%3A+Method+and+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Biol.+Alzheimer%27s+Dis.+SE+-+6%22%5BJournal%5D)">Optical Super-Resolution Imaging of β-Amyloid Aggregation In Vitro and In Vivo: Method and Techniques.</a> Syst. Biol. Alzheimer's Dis. SE - 6. 1303, 125-141 (2016).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Cragg, G. E., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+resolution+enhancement+with+standing+evanescent+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Lateral resolution enhancement with standing evanescent waves.</a> Opt. Lett. 25 (1), 46-48 (2000).</li>
<li>Chung, E., Kim, D., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+resolution+wide-field+optical+imaging%3A+objective-launched+standing-wave+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Extended resolution wide-field optical imaging: objective-launched standing-wave total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 31 (7), 945(2006).</li>
<li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339-342 (2009).</li>
<li>Fiolka, R., Shao, L., Rego, E. H., Davidson, M. W., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+two-color+3D+imaging+of+live+cells+with+doubled+resolution+using+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Time-lapse two-color 3D imaging of live cells with doubled resolution using structured illumination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (14), 5311-5315 (2012).</li>
<li>Brunstein, M., Wicker, K., Hérault, K., Heintzmann, R., Oheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-field+dual-color+100-nm+super-resolution+imaging+reveals+organization+and+dynamics+of+mitochondrial+and+ER+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Full-field dual-color 100-nm super-resolution imaging reveals organization and dynamics of mitochondrial and ER networks.</a> Opt. Express. 21 (22), 26162-26173 (2013).</li>
<li>Förster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+structured+illumination+microscope+setup+with+high+acquisition+speed+by+using+a+spatial+light+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Simple structured illumination microscope setup with high acquisition speed by using a spatial light modulator.</a> Opt. Express. 22 (17), 20663(2014).</li>
<li>Lu-Walther, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fastSIM%3A+a+practical+implementation+of+fast+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl.+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">fastSIM: a practical implementation of fast structured illumination microscopy.</a> Methods Appl. Fluoresc. 3, 014001(2015).</li>
<li>Shaw, M., Zajiczek, L., O'Holleran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+speed+structured+illumination+microscopy+in+optically+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High speed structured illumination microscopy in optically thick samples.</a> Methods. , (2015).</li>
<li>von Olshausen, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Total+internal+reflection+microscopy%3A+super-resolution+imaging+of+bacterial+dynamics+and+dark+field+imaging%22">Total internal reflection microscopy: super-resolution imaging of bacterial dynamics and dark field imaging</a>. , University of Freiburg. (2012).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Meadowlark Optics Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Basic+Polarization+Techniques+and+Devices%22">Basic Polarization Techniques and Devices</a>. , (2005).</li>
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<li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Wicker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-iterative+determination+of+pattern+phase+in+structured+illumination+microscopy+using+auto-correlations+in+Fourier+space%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Non-iterative determination of pattern phase in structured illumination microscopy using auto-correlations in Fourier space.</a> Opt. Express. 21 (21), 24692(2013).</li>
<li>Boulanger, J., Pustelnik, N., Condat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-smooth+convex+optimization+for+an+efficient+reconstruction+in+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%222014+IEEE+11th+Int.+Symp.+Biomed.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Non-smooth convex optimization for an efficient reconstruction in structured illumination microscopy.</a> 2014 IEEE 11th Int. Symp. Biomed. Imaging. 3 (1), 995-998 (2014).</li>
<li>Ströhl, F., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+joint+Richardson-Lucy+deconvolution+algorithm+for+the+reconstruction+of+multifocal+structured+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl.+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">A joint Richardson-Lucy deconvolution algorithm for the reconstruction of multifocal structured illumination microscopy data.</a> Methods Appl. Fluoresc. 3 (1), 014002(2015).</li>
<li>Mudry, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+illumination+microscopy+using+unknown+speckle+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Photonics%22%5BJournal%5D)">Structured illumination microscopy using unknown speckle patterns.</a> Nat. Photonics. 6 (5), 312-315 (2012).</li>
<li>Ayuk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+illumination+fluorescence+microscopy+with+distorted+excitations+using+a+filtered+blind-SIM+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Structured illumination fluorescence microscopy with distorted excitations using a filtered blind-SIM algorithm.</a> Opt. Lett. 38 (22), 4723(2013).</li>
<li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMcheck%3A+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Sci. Rep. 5, 15915(2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+live%2C+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended-resolution+structured+illumination+imaging+of+endocytic+and+cytoskeletal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.</a> Science. 349 (6251), (2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+live%2C+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

<html> sistemas Custom-Built TIRF-SIM, tais como a configuração detalhado neste protocolo são capazes de imagem de super-resolução multicolor em alta velocidade em comparação com microscópios comercialmente disponíveis. A vantagem inerente de SIM, como uma técnica de super-resolução é que a resolução temporal não é limitada pelos fotofísica do fluoróforo, em comparação com outros métodos tais como microscopia de molécula única localização (SMLM) ou métodos de verificação de pontos, tais como microscopia de depleção de emissão estimulada ( STED). Ao contrário dessas outras técnicas, SIM não requer fluoróforos foto induzida ou esgotáveis ​​modo imagem multicolor é simples. sistemas TIRF-SIM não, tais como a óptica de seccionamento SIM e multifocal SIM geralmente pode conseguir melhorar a resolução de 1,7 vezes ou menos, na prática, ao contrário do factor de 2 a melhoria aqui relatado, e sistemas comerciais são também muitas vezes mais lenta e menos flexível do que o sistema apresentado neste protocolo. &quot;&gt; As duas principais dificuldades na aplicação desta técnica são, em primeiro lugar a necessidade de posicionamento preciso das seis vigas SIM dentro da zona TIR de abertura costas do objetivo, que requer um tempo trabalhoso e demorado procedimento de alinhamento óptico. Em segundo lugar, para produzir alto contraste padrão na amostra, a rotação de polarização é essencial. para sistemas de baixa nA 2D-SIM, rotação de polarização pode ser evitado pela escolha cuidadosa da orientação de polarização linear, mas isso torna-se impossível para TIRF SIM-25. para imagem multicolor de alta velocidade, eletro- controle de polarização óptica é necessário e isso aumenta a complexidade e o custo do sistema. Limitações da técnica TIRF-SIM, como TIRF convencional, é, naturalmente, limitada a observação de estruturas e processos localizados na membrana celular basal, que pode ser iluminada por a profundidade de penetração de 150-200 nm do campo evanescente biológicos. EnquantoSIM é frequentemente citado como sendo menos photodamaging de células do que qualquer um ou STED SMLM, duplicação resolução lateral ainda faz aumentar o número necessário de fótons por, pelo menos, 4 vezes em comparação com 5 TIRF microscopia convencional. Para geração de imagens em altas taxas de quadros com tempos de exposições curtas, este aumento de fótons exige uso de aumento da intensidade de iluminação. Embora qualquer fluoróforo pode ser usado para geração de imagens de amostras SIM móveis fixos ou lentos, proteínas fluorescentes de alto brilho ou próxima geração de corantes sintéticos com fotoestabilidade melhorada são recomendados para imagens de células vivas. Embora esta aplicação é capaz de imagiologia de uma única cor em taxas de quadros SIM em excesso de 20 Hz, a imagem multicolor no sistema apresentado é limitada pelo tempo de comutação do filtro de emissão de roda motorizada. Devido ao grande tamanho do chip câmara scmos, o uso de um filtro de emissão de banda múltipla e separadoras de imagem óptica seria possível e permitir i simultâneamaging com múltiplos comprimentos de onda, sem qualquer penalidade na velocidade. Outra possibilidade seria a alternância das diferentes lasers de excitação e usar um filtro de entalhe de banda múltipla para rejeitar a luz de excitação. O uso de um SLM ferroeléctrica binário nesta aplicação também não é óptima. A eficiência de difracção de tal SLM é muito baixo, então a maior parte da luz incidente é no reflexo de ordem zero, que é filtrado para fora por a máscara espacial. Para aplicações que exigem muito altas taxas de quadros, a velocidade de imagem é, portanto, limitada pelo poder dos diodos de laser de saída. O SLM também introduz algumas elipticidade na polarização para comprimentos de onda de distância do comprimento de onda de 550 nm projeto onde os pixels não funcionam placas meia onda como ideais. Embora isso poderia ser compensado através da utilização de uma LCVR adicional, a solução ideal pode ser o uso de um dispositivo de micro-espelho digitais (DMD) como um gerador de padrão. possíveis modificações O prese configuraçãonted aqui é flexível e mais facilmente modificado do que os instrumentos comerciais para que outras modalidades de imagem, tais como 3D-SIM, rápida 2D-SIM, SIM multifocal (MSIM) e SIM não-linear (NL-SIM) podem ser implementadas 21,34,35. 2D-SIM pode ser bem adequado para imagiologia relativamente plana, move-se rapidamente estruturas, tais como o retículo endoplasmático periférica. O ER periférica é mais profundo dentro da célula que pode ser iluminado usando um campo evanescente TIRF, mas devido à sua estrutura plana pode ser fotografada usando padrão 2D-SIM com insignificante fundo fora de foco. Além disso, o uso de melhores algoritmos de reconstrução de corte ópticas para suprimir fora-de-foco de luz estender o uso do 2D-SIM para opticamente amostras de espessura, embora onde duplicação resolução axial não é necessária 21. Em MSIM, a amostra é iluminada por uma rede esparsa de excitação focos 36. Esta modalidade pode ser implementado simplesmente removendo a máscara espacial (SM) E substituindo-o por um polarizador. O SLM agora funciona como um modulador de amplitude. As grelhas SIM binários exibidos na SLM pode ser substituído por uma estrutura de pontos em 2D, com o tamanho dos pontos escolhidos para ser igual ao tamanho de um foco de difracção limitada no plano de imagem. Na Figura 7A, uma estrutura de 4 x 4 quadrados do pixel é exibido na SLM (inset) que quando demagnified sobre a amostra gera focos de difracção limitada de 150 x 150 mm, tendo em conta o tamanho do pixel SLM física de 13,62 | im. Os focos de excitação pode ser então traduzida pela mudança do padrão da rede em SLM e isto é repetido várias vezes a fim de iluminar a totalidade do campo de visão. As imagens são adquiridas para cada posição do padrão traduzida e a pilha é pós-processados ​​para produzir uma imagem reconstruída com uma melhor resolução de até um fator de <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq19.jpg" /> e reduziu fora-de-foco de luz em comparação com a imagem widefield equivalente30. Esta modalidade pode ser útil para imagiologia de amostras grossas, densos para os quais SIM padrão é inadequado, por exemplo, estruturas de baixo contraste, tais como os glóbulos vermelhos corados (Figura 7C), embora o tempo de aquisição é aumentada, devido ao grande número de quadros de matérias- requerido por campo de visão (neste caso n = 168). Finalmente, a configuração pode ser modificada para permitir que seja alta-NA linear TIRF-SIM ou activação modelado não linear SIM (PA NL-SIM), tal como apresentado recentemente por Li et al., Através da utilização de uma 1,7 objectivo ou a adição de ultra NA de um laser de 405 nm fotoativação e otimização cuidadosa dos SLM padrões ralar 35. Aplicações futuras SIM ainda é uma técnica rápida evolução e muitas aplicações nas ciências da vida será habilitado no futuro. A velocidade, resolução e melhorias de contraste da técnica e a capacidade de utilizar padrão fluorï¿½oros mean que, para bioimaging, SIM está definido para substituir muitos sistemas de microscopia convencional, tais como plataformas de campo confocal e largas. sistemas SIM comerciais já estão disponíveis hoje, com especificações técnicas pendentes, no entanto, eles estão além do alcance financeiro de muitos laboratórios de pesquisa, e, crucialmente, eles são inflexíveis de ser modificado e desenvolvido para implementar as mais recentes desenvolvimentos da investigação no campo. Eles também não têm a capacidade essencial para &#39;ser adaptado para o experimento na mão&#39;, muitas vezes um gargalo crítico na corte pesquisa de ciências biológicas borda. O sistema descrito aqui será particularmente adequado para estudar processos dinâmicos perto da superfície da célula, para estudos in vitro de sistemas bicamada reconstituídos, para estudar a química de superfície nos materiais e ciências físicas, por exemplo. de materiais 2D, e muitas outras aplicações.

Ao longo da última meia década, a microscopia de super-resolução amadureceu e mudou-se de laboratórios ópticos especializados para as mãos do biólogo. Existem soluções microscópio comerciais para os três principais variantes para alcançar óptico super-resolução: microscopia molécula localização única (SMLM), estimulado microscopia de esgotamento de emissão (STED), e microscopia de iluminação estruturada (SIM) 1,2. SMLM tais como microscopia fotoativados localização (PALM) e microscopia óptica reconstrução estocástico (STORM) têm sido as técnicas mais populares, em grande parte devido à simplicidade da configuração óptica e a promessa de alta resolução espacial, prontamente abaixo de 20 nm. No entanto microscopia de super-resolução via única molécula de localização vem com uma intrínseca trade-off: o atingível resolução espacial é dependente de acumular um número suficiente de localizações fluoróforo individuais, limitando assim a resolução temporal. processo dinâmico de imagemES em células vivas, por conseguinte, torna-se problemático como uma amostra deve adequadamente o movimento da estrutura de interesse para evitar artefactos de movimento ao mesmo tempo que a aquisição de acontecimentos de localização suficientes em que o tempo para reconstruir uma imagem. A fim de atender a esses requisitos, demonstrações ao vivo SMLM celular têm obtido o necessário aumento das taxas de fluoróforo photoswitching, aumentando muito o poder de excitação, e isso leva por sua vez a fototoxicidade e estresse oxidativo, limitando assim o tempo de sobrevivência de amostra e relevância biológica 3. A clara vantagem de STED sobre ambos SIM e SMLM é que ele pode imagem com super-resolução em amostras de espessura, por exemplo resolução lateral de cerca de 60 nm foi conseguida em fatias de cérebro organotípicas em profundidades de até 120 mm 4. Imagiologia em tais profundidades com implementações objetivos únicos de SMLM ou SIM é inviável, mas torna-se possível com qualquer folha de luz única molécula ou estrutura folha de luz microscopy 5. -Taxa de Vídeo STED também tem sido demonstradas e utilizadas para mapear a mobilidade das vesículas sinápticas, embora até agora este tem sido limitada a imagiologia de pequenos campos de visão 6. Para aplicações em biologia celular e reacções auto-montagem moleculares 7 - 12 que exigem imagens com alta resolução temporal ao longo de muitos pontos de tempo, microscopia de iluminação estruturada (SIM) pode ser bem adequada, uma vez que não é dependente das propriedades fotofísicas de um marcador fluorescente particular, sondar. Apesar dessa vantagem inerente do SIM, até agora a sua utilização tem sido principalmente confinada à imagem latente células fixas ou processos lentos. Isto é devido às limitações dos sistemas de SIM comercialmente disponíveis: a taxa de quadros aquisição destes instrumentos foi limitada pela velocidade de rotação das grades utilizadas para gerar os padrões de iluminação sinusoidais necessários, bem como a manutenção da polarização óptica. A mais nova geração de SIM comercialinstrumentos são capazes de imagem rápido, mas eles são proibitivamente caro para todos, mas as instalações de imagiologia centrais. Este protocolo apresenta um guia para a construção de um sistema flexível SIM para imagiologia de processos rápidos em amostras finas e perto da superfície basal de células vivas. Emprega total de fluorescência de reflexão interna (TIRF) para gerar um padrão de iluminação que penetra no mais profundo do que cerca de 150 nm na amostra 13, que reduz drasticamente o fora de sinal de fundo do foco. A idéia de combinar SIM com TIRF é quase tão antiga como SIM-se 14, mas não foi realizado experimentalmente antes de 2006 15. A primeira in vivo imagens obtidas com TIRF-SIM foram relatados em 2009 16 atingindo taxas de quadro de 11 Hz para visualizar tubulina e kinesin dinâmica, e dois sistemas TIRF-SIM cores foram apresentados 17,18. Mais recentemente, uma guia para a construção e utilização de uma única cor de dois feixes s SIMistema foi apresentado com frame-rate de até 18 Hz 19,20. O set-up aqui apresentado é capaz de imagem de super-resolução SIM a 20 Hz em três cores, dois dos quais podem ser operados em TIRF-SIM. Todo o sistema é construído em torno de um corpo do microscópio invertido e usa uma fase de tradução XY motorizada com um palco z-atuado piezo. Para gerar os padrões de excitação sinusoidal necessários para TIRF-SIM, o sistema apresentado utiliza um modulador de luz espacial ferroeléctrica (SLM). padrões binários de grelha são mostradas na SLM e as ordens de difracção de ± 1 resultantes são filtrados, e retransmitida focado no anel TIR da lente objectiva. Os deslocamentos e as rotações dos gradeamentos de fase necessários são aplicadas mudando a imagem exibida SLM. Este protocolo descreve como construir e alinhar um tal caminho de excitação, detalha o alinhamento do caminho de emissão, e apresenta amostras de ensaio para garantir um alinhamento óptimo. É também des<html> os secretários questões e desafios específicos para alta velocidade TIRF-SIM em matéria de controlo de polarização e sincronização de componentes. Considerações de design e Restrições Antes de montar o sistema TIRF-SIM apresentados neste protocolo, existem várias restrições de design a considerar que determinam a escolha de componentes ópticos. Todas as abreviaturas de componentes ópticos referem à Figura 1. Spatial Luz modulador (SLM) A ferroelétrico SLM binário é utilizado nesta configuração, uma vez que é capaz de comutação padrão de sub-milissegundo. SLMs nemáticos em tons de cinza podem ser usados, mas estes oferecem bastante reduzido os tempos de comutação. Cada ligado ou desligado do pixel binário numa fase SLM vai conferir deslocamento para a frente de onda plana incidente, quer uma fase π ou 0, por conseguinte, se um padrão de grelha periódica é exibido na SLM ele irá operar como uma grade de difracção de fase. ent &quot;&gt; reflexão interna total (TIR) Para atingir TIR e produzir um campo evanescente, o ângulo de incidência dos feixes de excitação na interface vidro-amostra deve ser maior do que o ângulo crítico <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq1.jpg" /> . Isso define o ângulo mínimo incidente necessário, e, portanto, também o espaçamento máximo, ou período, do padrão de iluminação evanescente. O ângulo máximo de incidente <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq2.jpg" /> (O ângulo de aceitação) é limitado pela abertura numérica (NA) da lente objectiva, que pode ser calculada a partir da definição <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq3.jpg" /> . Isto determina o padrão de espaçamento mínimo realizável de acordo com a fórmula Abbe <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq4.jpg" /> que liga NA e comprimento de onda <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq5.jpg" /> para o padrão de espaçamento mínimo <imgalt = &quot;Equação&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53988 / 53988eq6.jpg&quot; /&gt;. Na prática, uma imersão em óleo 1,49 NA TIRF objectivo produz um ângulo de incidência máximo de cerca de 79 ° e um período mínimo de padrão na amostra de 164 nm, utilizando um comprimento de onda de excitação de 488 nm. Estes dois ângulos definem um anel em volta da abertura da objectiva sobre os quais o instrumento atinge TIR iluminação (ou seja. O anel TIR), e em que os focos duas excitação deve ser posicionado com precisão e precisamente rodado para gerar cada padrão de iluminação. Reconstrução de imagens TIRF-SIM exige a aquisição de um mínimo de três deslocamentos de fase por rotação padrão, portanto, o período padrão de SLM deve ser divisível por 3 (ver Figura 1). Por exemplo, um período de 9 pixels para iluminação 488 nm e 12 pixels para 640 nm iluminação. Para uma discussão abrangente de design padrão SLM, incluindo otimização de sub-pixel de padrão de espaçamento usando grades de cisalhamento, Ver o trabalho anterior de Kner et al. 16 e Lu-Walther et al. 20 A posição dos dois focos de excitação deve estar dentro do anel TIR para todos os comprimentos de onda, no entanto, o ângulo de difracção dos ± 1 ordens da SLM é de comprimento de onda dependente. Para SIM padrão, imagem multicolor pode ser obtida através da optimização do período de reticulação para o comprimento de onda mais longo, e tolerar uma perda de desempenho para os canais mais curtos. Para TIRF-SIM no entanto, optimizando para um comprimento de onda significa que o outro comprimento de onda deixa de focos dentro do anel são TIR. Por exemplo, utilizando um período de reticulação de 9 pixels é suficiente para proporcionar TIRF para 488 nm, como os focos são a 95% do diâmetro da abertura para trás e para dentro do anel TIR, mas para 640 nm, este período seria posicionar o focos fora a abertura. Por esta razão diferentes espaçamentos padrão de pixel deve ser utilizado para cada comprimento de onda de excitação. O alinhamento do caminho de excitação TIRF-SIMé extremamente sensível a pequenas mudanças na posição do espelho dicróico (DM4 na Figura 1) no corpo do microscópio, muito mais assim do que no SIM convencional. Utilização de uma torreta rotativa cubo de filtro não é recomendado, em vez disso usar um único, espelho dicróico multi-banda, que é mantido numa posição fixa e concebidos especificamente para os comprimentos de onda de excitação utilizados. É essencial que apenas a maior qualidade espelhos dicróicos são utilizados. Estes exigem substratos grossos de pelo menos 3 mm, e são muitas vezes designado como &quot;plano de imagem&quot; pelos fabricantes. Todos os outros substratos levar a aberração intolerável e degradação da imagem em TIRF-SIM. Controle de polarização Para alcançar TIRF-SIM é essencial rodar o estado de polarização da luz de excitação, em sincronia com o padrão de iluminação de modo a que ele permanece azimutais polarizada no plano da pupila objectivo em relação ao eixo óptico (isto é,. s-polarizada). O alinhamento das ópticas de controlo de polarização dependerá do elemento óptico específico empregue, por exemplo uma célula de Pockels 21, ou uma placa de meia onda em uma etapa de rotação motorizada 22. Neste protocolo um retardador variável de cristal líquido personalizado (LCVR) é usado, projetado para fornecer de onda completa (2π) retardance sobre a faixa de comprimento de onda 488-640 nm, uma vez que permite a comutação rápida (~ ms). Se usar um retardador de cristal líquido é essencial a utilização de um componente de alta qualidade: componentes padrão geralmente não são suficientemente estáveis ​​para dar um retardamento constante ao longo da duração do tempo de exposição da câmara que leva a uma desfocagem para fora do padrão de iluminação e de baixo contraste de modulação . retardadores de cristal líquido são também fortemente dependente da temperatura e exigem construído no controle de temperatura. sincronização Os lasers deve ser sincronizado com o SLM. SLMs ferroelétricos binários são equilibrados internamente por switching entre um estado ligado e desligado do estado. Os pixels só agem placas como meio de onda em qualquer seu estado ligado ou desligado, mas não durante o tempo entre quadros de comutação. Portanto, os lasers só deve ser ligado durante estados on / off através do LED Activar sinal do SLM para evitar uma redução em contraste padrão devido ao estado intermediário dos pixels. Um modulador acústico-óptico (OMA) pode, alternativamente, ser utilizado como um obturador rápido, se os lasers não podem ser modulados digitalmente. Escolha de lentes Com base nestes constrangimentos, o demagnification necessária do plano SLM sobre o plano da amostra para produzir os padrões de iluminação pretendida pode ser determinada. Isto permite o cálculo das distâncias focais de duas lentes L3 e L4 no telescópio relé imagem e a lente de excitação condensador L5. Neste sistema um / imersão em óleo 1.49NA lente objectiva 100X é usado com 488 nm de excitação e 640 nm, consequentemente, utiliza comprimentos focais de 300 e 140 milímetrospara L4, L3, e 300 mm de L5, dando um total de demagnification 357X, equivalente a um tamanho de pixel de 38 nm SLM no plano da amostra. Usando esta combinação de lentes, SLM ralar para 9 períodos de iluminação 488 nm e 12 pixels para dar 640 nm padrão de espaçamentos 172 e 229 nm para a amostra, que corresponde a ângulos de incidência de 70 ° e 67 ° respectivamente. Para uma interface de água de vidro, o ângulo crítico é de 61 °, e é independente do comprimento de onda, por conseguinte, estes dois espaçamentos padrão permitir excitação TIRF para ambos os comprimentos de onda. Uma lente objectiva equipado com um colar de correcção é útil para a correcção das aberrações esféricas introduzidos por variações na espessura da lamela, ou se a operar a 37 ° C. Reconstrução imagem Uma vez que os dados em bruto SIM tenha sido adquirido, é uma questão de esforço computacional para gerar imagens de super-resolvido em um processo de duas etapas. Em primeiro lugar, o padrão de iluminação tem de ser determinado paracada imagem e em segundo lugar, os componentes do espectro SIM deve ser separada e recombinadas de forma adequada como para dobrar o suporte OTF eficaz (ver Figura 6, inserções). O conhecimento preciso dos padrões de iluminação projectados é primordial, como os componentes de frequência super-resolvido tem que ser não misturados com a maior precisão possível para evitar artefactos causados ​​por as partes residuais de componentes sobrepostos. Nós determinamos o padrão de iluminação parâmetros a posteriori a partir dos dados de imagem em bruto seguindo o procedimento introduzido por Gustafsson et al. 23 Em suma, um conjunto de parâmetros de iluminação que descreve uma senóide bidimensional normalizada tem de ser encontrado para cada um dos <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq7.jpg" /> padrões de excitação <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq8.jpg" /> : <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq9.jpg" /> por este meio <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" /> e <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq11.jpg" /> descrever o contraste da franja e do padrão na fase inicial de cada imagem individual m respectivamente. Os componentes do vector de onda, <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq12.jpg" /> e <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq13.jpg" /> , Só mudam com orientações diferentes <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq14.jpg" /> do padrão e pode ser assumida em contrário constante. Para determinar grosseiramente as componentes do vector de onda uma correlação cruzada dos espectros de imagem em bruto é realizada, o que é refinada através da aplicação de deslocamentos subpixel a uma das imagens interligado a optimizar a sobreposição. Isto é feito através de multiplicação de espaço-Real gradientes de fase <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq15.jpg" /> que induzem uma mudança subpixel na frefre--espaço. Note-se que é útil ter uma boa estimativa da onda-vectores antes da estimativa real padrão e esta pode ser encontrada por imagiologia de uma camada de cordão fluorescente. Como o passo de fase entre os padrões é deslocado <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq16.jpg" /> , Ou seja. <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq17.jpg" /> , A separação de componentes de frequência pode ser realizada por uma transformada de Fourier ao longo do eixo &quot;fase&quot;. A fase mundial <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq18.jpg" /> e o contraste franja <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" /> pode então ser determinada usando regressão linear complexa de diferentes componentes. Os componentes individuais separadas são então combinadas através de um filtro de Wiener generalizado. Para uma descrição detalhada de ambos extração de parâmetros e implementação do filtro de Wiener generalizado nos referimos o leitor a Gustafssonet al. 23, onde o mesmo algoritmo é utilizado.

<table><tbody><tr><td>Laser de 488 nm</td><td>Toptica</td><td>iBeam SMART</td><td>com modulação digital</td></tr><tr><td>Laser de 561 nm</td><td>OBIS coerente</td><td>LS</td><td>com modulação digital</td></tr><tr><td>Laser de 640 nm</td><td>Cobolt</td><td>MLD</td><td>com modulação digital</td></tr><tr><td>Espelhos dicróicos de longa duração&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>para combinar feixes</td><td></td> de excitação</tr><tr><td>Espelho dicróico de banda quádrupla</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>3 mm de espessura, imagem plana TIRF, montado em cubo de filtro Olympus BX</td></tr><tr><td>Espelho dicróico de banda quádrupla</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>Do mesmo lote acima, montagem cinemática quadrada de 25 x 25 mm</td></tr><tr><td>1"</td><td>Edmund Optics</td><td>58-860</td><td></td></tr><tr><td>Glan-Taylor calcite polarizadores</td><td>Thorlabs</td><td>GT5-A</td><td>Para alinhamento de LCVR</td></tr><tr><td>Glan-Taylor montagem</td><td>Thorlabs</td><td>SM05PM5</td><td></td></tr><tr><td>Placa acromática de meia onda</td><td>Thorlabs</td><td>AHWP05M-600</td><td>400-800 nm</td></tr><tr><td>Montagem em gaiola</td><td>de rotação Thorlabs</td><td>CRM1/M</td><td>Para HWP</td></tr><tr><td>Retardador Variável de Cristal Líquido</td><td>Meadowlark Optics</td><td>SWIFT</td><td>Construído sob medida para fornecer retardância de onda total na faixa de 488 a 640 nm.</td></tr><tr><td>Controlador LCVR</td><td>Meadowlark Optics</td><td>D3060HV</td><td>Controlador de alta tensão de dois canais para retardadores de cristal líquido</td></tr><tr><td>Placa acromática de quarto de onda</td><td>Meadowlark Optics</td><td>AQM-100-0545</td><td></td></tr><tr><td>Montagem em gaiola de rotação</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1P/M</td><td>Para QWP</td></tr><tr><td>10 mm gibão acromático</td><td>Thorlabs</td><td>AC080-010-A-ML</td><td>Para expansor de feixe</td></tr><tr><td>200 mm acromático doublet</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>Para expansor de feixe</td></tr><tr><td>Cage XY Tradutores</td><td>Thorlabs</td><td>CXY1</td><td></td></tr><tr><td>Modulador de luz espacial ferroelétrico</td><td>Forth Dimension Displays</td><td>M0787-00249&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Microdisplay SXGA-3DM (IFF) Tipo M249, 1.280 x 1.024 pixels, com placa de driver</td></tr><tr><td>Moldura de montagem SLM</td><td>Forth Dimension Displays</td><td>M0787-10014</td><td>Fixa para montagem de alumínio personalizada</td></tr><tr><td>&Oslash; 50,8 milímetros Gimbal Mirror Mount</td><td>Thorlabs</td><td>GM200/M</td><td>Para montagem SLM</td></tr><tr><td>Estágio de tradução linear de dois eixos com plataforma rotativa</td><td>Thorlabs</td><td>XYR1/M</td><td>Para montagem SLM</td></tr><tr><td>Transportador ferroviário</td><td>Newport</td><td>M-PRC-3</td><td>Para montagem SLM</td></tr><tr><td>Trilho óptico de precisão</td><td>Newport</td><td>PRL-6</td><td>Para montagem SLM</td></tr><tr><td>Lente dupla acromática de 300 mm</td><td>Qioptiq</td><td>G322 273 322&nbsp;</td><td>f = 300 mm, 31,5 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>Lente dupla acromática de 140 mm</td><td>Qioptiq</td><td>G322 239 322</td><td>f = 140 mm, 31,5 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>Montagens de tradução de precisão XY Adaptadores</td> de montagem de lentes <td>Thorlabs</td><td>LM2XY</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>SM2AD32</td><td>Para montagem de lentes de 31,5 mm em montagens de 2"</td></tr><tr><td>Estágios de tradução</td><td>Comar</td><td>12XT65</td><td>Rabo de andorinha, acionamento lateral</td></tr><tr><td>Tradutor XY com acionamentos diferenciais</td><td>Thorlabs</td><td>ST1XY-D/M</td><td>para filtro espacial</td></tr><tr><td>Montagem em gaiola de rotação</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1/M</td><td>para filtro espacial</td></tr><tr><td>Gibão acromático de 300 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-300-A-ML</td><td>Lente de tubo de excitação</td></tr><tr><td>Estágio XY automatizado com placa superior Z-piezo</td><td>ASI</td><td>PZ-2150-XYFT-PZ-IX71&nbsp;</td><td>com controlador MS-2000</td></tr><tr><td>Moldura de microscópio invertida</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>Lente objetiva</td><td>Olympus</td><td>UAPON100XOTIRF</td><td>100X/1.49NA</td></tr><tr><td>Roda de filtro de alta velocidade</td><td>Prior Scientific</td><td>HF110A</td><td>com controlador Prior ProScan III</td></tr><tr><td>Filtros de emissão passa-banda</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/30, FF01-676/29</td><td></td></tr><tr><td>câmera sCMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA Flash v4.0</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de palco</td><td>OKO Lab</td><td>H301-K-FRAME</td><td>Para imagens de células vivas, com controladores de temperatura e CO2</td></tr><tr><td>Pinos ópticos em aço inoxidável</td><td>Série Thorlabs</td><td>TR</td><td>para montagem de componentes ópticos</td></tr><tr><td>Suportes de postes</td><td>Série Thorlabs</td><td>PH</td><td>para montagem de componentes</td></tr><tr><td>ópticos Montagens de espelho cinemático</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td>para montagem de espelhos de 1"</td></tr><tr><td>Interferômetro de cisalhamento</td><td>Thorlabs</td><td>SI100</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas fluorescentes de 100 nm</td><td>Life Technologies</td><td>T-7279</td><td>Tetraspeck</td></tr><tr><td>Rodamina 6G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83697-250MG</td><td></td></tr><tr><td>8 pratos de fundo de vidro de 8 poços</td><td>ibidi</td><td>80827</td><td>com #1.5 Coverglass</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155409</td><td>com lâmina de retículo de microscópio #1.5</td></tr> de <tr><td>0,01 mm</td><td>EMS</td><td>68039-22</td><td></td></tr><tr><td>CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10613</td><td></td></tr></tbody></table>

um guia para estruturado iluminação tirf microscopia de alta velocidade com várias cores

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

imaging super-resolução óptica com microscopia de iluminação estruturada (SIM) é uma tecnologia-chave para a visualização de processos a nível molecular na ciências biomédicas e químicas. Embora os sistemas SIM comerciais estão disponíveis, os sistemas que são projetados em laboratório pode superar sistemas comerciais, este último normalmente concebidos para facilidade de uso e aplicações de uso geral, tanto em termos de fidelidade de imagem e velocidade. Este artigo apresenta um guia detalhado para a construção de um sistema SIM que utiliza iluminação reflexão interna total (TIR) ​​e é capaz de imagem em até 10 Hz em três cores em uma resolução chegando a 100 nm. Devido à combinação de SIM e TIRF, o sistema proporciona um melhor contraste de imagem do que as tecnologias rivais. Para atingir estas especificações, vários elementos ópticos são utilizados para permitir controle automatizado sobre a estrutura de estado de polarização e espacial da luz de iluminação para todos wav excitação disponíveiselengths. Detalhes completos sobre a implementação de hardware e controle são dadas para conseguir a sincronização entre a geração de luz de excitação teste padrão, comprimento de onda, estado de polarização, e controle da câmera com ênfase na obtenção de taxa de quadros máxima de aquisição. Um protocolo passo-a-passo para o alinhamento e a calibração do sistema é apresentado e a melhoria resolução alcançável é validado em amostras de teste ideal. A capacidade de imagiologia super-resolução de taxa de vídeo é demonstrada com células vivas.

Este artigo fornece um guia detalhado para a montagem e operação de um microscópio de iluminação estruturada operando com iluminação de fluorescência de reflexão interna total (TIRF-SIM) para obter imagens de processos biológicos dinâmicos com super-resolução óptica em várias cores.

Um Guia para Estruturado iluminação TIRF microscopia de alta velocidade com várias cores

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

O objetivo geral deste protocolo é construir e alinhar um microscópio de iluminação estruturada adequado para imagens de super-resolução de células vivas de alta velocidade, capaz de operar nos modos TIRF e de seccionamento óptico com várias cores. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia celular que atualmente não podem ser respondidas usando microscopia TIRF limitada por difração padrão. A principal vantagem desta técnica é sua resolução de tempo rápida em comparação com outras técnicas de microscopia de super resolução, o que a torna adequada para processos dinâmicos de imagem em células vivas.Embora este protocolo descreva as etapas para a construção de um microscópio TIRF-SIM, a configuração é flexível e facilmente modificada para implementar modalidades de imagem como 3D-SIM, SIM multifocal e SIM não linear. Para organizar e alinhar o caminho de excitação para um microscópio de iluminação estruturada, comece marcando as posições dos componentes na mesa óptica conforme indicado aqui. Depois de inserir o primeiro espelho dicróico, DM4, na torre do cubo de filtro da estrutura do microscópio, insira o segundo espelho dicróico, DM3, em uma montagem de espelho cinemático quadrado de uma polegada e posicione-o a uma distância focal da lente do condensador, L5. Em seguida, para definir com precisão o acesso óptico do sistema, remova a lente objetiva, OB, da torre e, em vez disso, aparafuse uma ferramenta de alinhamento.Em seguida, use o espelho dicróico DM3 e um espelho de alinhamento temporário posicionado na localização final aproximada do SLM para direcionar um feixe de referência colimado do laser um através do centro dos orifícios nos dois discos de alinhamento. Usando três espelhos e o espelho dicróico DM2 conforme ilustrado aqui, direcione o feixe do laser um para o espelho temporário. Uma vez determinado o eixo óptico grosseiro, remova a ferramenta de alinhamento.Em seguida, insira uma íris no caminho do feixe antes que ela entre no corpo do microscópio e centralize-a no feixe. Prenda um pedaço de cartão branco com um pequeno orifício centralizado na íris e reinsira a lente objetiva. Em seguida, faça ajustes angulares iterativos nos espelhos DM3 e na posição SLM para centralizar o reflexo traseiro no cartão com o feixe de entrada.Em seguida, remova temporariamente a lente objetiva e marque o ponto de laser no teto para criar uma posição de referência. Insira a lente do tubo, L5, a aproximadamente uma distância focal da objetiva, montando-a em um estágio de translação linear definido para transladar ao longo da direção do feixe de referência. Ajuste a posição e o ângulo da lente do tubo de forma que o feixe que sai da objetiva seja colimado e atinja o ponto de referência no teto.Verifique se a lente está perpendicular ao feixe, verificando novamente o reflexo traseiro com a íris e o cartão branco. Em seguida, remova a lente objetiva e insira a segunda lente do telescópio de retransmissão de imagem, L4. Use o estágio de translação linear para ajustar a posição e o ângulo desta lente para manter a colimação e garantir que o feixe de referência ainda atinja o ponto marcado no teto. Substitua a lente objetiva e insira a primeira lente do telescópio, L3. Ajuste a posição e o ângulo desta lente para garantir colimação e não deflexão, conforme descrito anteriormente.Após montar o chip SLM de acordo com o protocolo de texto, com as lentes alinhadas, insira o SLM no lugar do espelho. Ajuste a posição do SLM de forma que o feixe de referência fique localizado no centro do chip SLM e ajuste o ângulo para que o feixe passe pelas duas lentes do relé. Em seguida, verifique se o feixe de referência ainda está centralizado no ponto marcado.Monte o retardador variável de cristal líquido, ou LCVR, com seu eixo rápido a 45 graus em relação à polarização incidente. Em seguida, após completar o alinhamento do rotador de polarização de acordo com o protocolo de texto, usando luz transmitida através das oculares, concentre-se em um retículo e fixe a lente objetiva nesta posição. Em seguida, prepare uma monocamada de esferas fluorescentes espalhando uma gota de contas multicoloridas de 100 nanômetros em uma lamínula número 1,5.Deixe as contas secarem para adsorvê-las no copo antes de mergulhar novamente na água. Usando óleo de imersão, coloque a amostra de esferas na objetiva. Ajuste com precisão a posição da câmera para que a camada de esferas fluorescentes fique em foco.Depois de gerar padrões de grade binária SIM como arquivos bitmap e carregá-los no SLM de acordo com o protocolo de texto, carregue o software de controle SLM e clique em Conectar. Na guia Repertório, clique em Carregar" para abrir o arquivo de repertório e verificar o número de ordens em execução contidas no arquivo. Clique em Enviar para o Conselho"para carregar o arquivo de repertório para o SLM.Em seguida, selecione a guia "Status" e insira o número da ordem de execução. Clique em Selecionar" para alterar a ordem de execução para a grade de alinhamento. Insira uma máscara espacial, ou SM, montada em um estágio XY no caminho do feixe na posição focal de L3 e traduza sua posição em relação ao eixo óptico de modo que apenas as primeiras ordens desejadas sejam passadas.Diretamente após o filtro espacial, apenas dois feixes circulares serão visíveis. Verifique a imagem da camada de esferas fluorescentes na câmera. Se os dois feixes circulares não estiverem sobrepostos conforme ilustrado aqui, reposicione o plano de amostra, ajustando iterativamente a lente objetiva e a posição da câmera.Depois de ajustar o foco e definir o plano de amostra de acordo com o protocolo de texto, confirme a iluminação TIRF por imagem, por exemplo, uma solução de corante rodamina 6G 10 micromolar, colocando o corante em foco. Se os dois feixes incidirem no ângulo TIRF correto, as moléculas individuais serão visíveis sem fundo alto e as bordas da abertura circular estarão em foco. Ajustes finos na posição dos feixes podem ser feitos ajustando o espelho dicróico DM3.Para sincronizar e calibrar o sistema, coloque a amostra de monocamada de esferas na objetiva e coloque em foco. Use o software de controle SLM para programar o SLM para exibir cada uma das três imagens de deslocamento de fase por vez para a primeira orientação do padrão. Em seguida, mude para a ordem de execução quatro do repertório de exemplo.No software de aquisição, configure a câmera para o período de exposição global escolhendo Propriedades avançadas da câmera "e definindo Tipo de gatilho de saída 1" para positivo e Tipo de gatilho de saída 2" para negativo. No painel de sequência, em Tipo de Verificação, selecione Registro de Disco Rígido e defina a contagem de quadros como três. Em seguida, clique em Iniciar"para adquirir três quadros.O padrão SLM mudará a cada exposição. Depois de calcular o sistema de acordo com o protocolo de texto, no software de controle SLM, mude a ordem de execução do SLM para a série completa de nove imagens de grade binária necessárias para TIRF-SIM. Esta é a ordem de execução zero no repertório de exemplo.Depois de adquirir nove imagens da amostra de contas, no painel de sequência do software da câmera, selecione Gravação de disco rígido "como o tipo de varredura e altere a contagem de quadros para nove. Em seguida, clique em Iniciar"para adquirir imagens. Por fim, em Salvar imagens em buffer, escolha TIFF como o tipo de imagem e clique em OK. Reconstrua uma imagem de super-resolução de acordo com o protocolo de texto.Mostrado aqui, contas fluorescentes multicoloridas de 100 nanômetros de diâmetro foram fotografadas para comparar o TIRF padrão com o TIRF-SIM. O TIRF-SIM claramente teve uma resolução lateral significativamente maior em comparação com o TIRF. A resolução estimada do microscópio é de 90 nanômetros e 120 nanômetros para TIRF-SIM de 488 e 640 nanômetros, respectivamente.Isso corresponde a uma melhoria de duas vezes na resolução lateral para ambos os comprimentos de onda em comparação com o caso limitado de difração teórica. Como visto aqui, fibrilas amilóides marcadas com fluorescência foram formadas in vitro e também usadas como amostra de teste para demonstrar resolução dupla. Estruturas subcelulares com alto contraste, como microtúbulos marcados com emGFP ou LifeAct-GFP, são ideais para imagens TIRF-SIM e produzem imagens de alto contraste e super-resolução.A imagem TIRF-SIM usando a configuração demonstrada permite a observação de uma subpopulação de microtúbulos localizados nas proximidades do córtex basocelular, e a polimerização e despolimerização dos microtúbulos podem ser vistas ao longo do tempo. Amostras de baixo contraste sem estruturas discretas carecem de informações de alta resolução, exceto nas bordas da membrana plasmática e, portanto, são abaixo do ideal para imagens TIRF-SIM. Finalmente, o alto contraste de modulação é essencial para uma imagem SIM bem-sucedida.Como demonstrado aqui, a transformada de Fourier da imagem reconstruída permite a visualização da função de transferência óptica do SIM. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em cerca de uma semana, se todas as peças necessárias tiverem sido adquiridas. Ao tentar este procedimento, deve-se estar ciente dos problemas mais críticos para a implementação bem-sucedida do TIRF-SIM.Primeiro, o alinhamento preciso das vigas é essencial. Isso pode ser difícil, pois eles devem estar localizados nas bordas da abertura da lente objetiva. Em segundo lugar, é fundamental que o estado de polarização da luz seja co-girado com o padrão.Sem isso, o contraste do padrão da amostra será baixo e a construção subsequente da imagem será impossível. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão das etapas mais importantes na construção e alinhamento de um microscópio TIRF-SIM baseado em SLM. Não se esqueça de que trabalhar com lasers Classe 3B pode ser extremamente perigoso.A potência do laser deve ser mantida em níveis seguros para os olhos durante a execução do processo de alinhamento com a objetiva TIRF instalada.

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