Preparação de 3D colágeno Géis e microcanais para o estudo das interações 3D In Vivo

O objetivo geral deste procedimento é gerar matrizes de colágeno 3D alinhadas e aleatórias, com o objetivo de observar a migração celular ou outros processos celulares no contexto de um ambiente 3D. Este método é projetado para capturar características de colágeno que encontramos em tecidos reais, o que pode ajudar a responder às principais questões, como os mecanismos que as células usam para reconhecer uma matriz extracelular alinhada ou aleatória. A principal vantagem dessa técnica é que você pode manipular a organização do ambiente 3D, células de imagem internas e pode fazer isso de maneira econômica com equipamentos comumente disponíveis.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque não misturam a solução de colágeno e o tampão de neutralização bem o suficiente e atraem o colágeno pelos canais de forma inconsistente. Demonstrando esse procedimento estará Brian Burkel, que é um cientista sênior em meu laboratório. Para começar, misture bem o colágeno e o tampão HEPES antes de adicionar células e meios para garantir a neutralização adequada do colágeno.

Em seguida, adicione as células e o meio à mistura de colágeno neutralizado e coloque-o no gelo, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Pipete a mistura gelada em uma superfície estéril não tratada com cultura de tecidos para minimizar a fixação e o crescimento de células fora do gel de colágeno. Use uma pipeta para espalhar uniformemente a solução.

Deixe o gel polimerizar à temperatura ambiente por aproximadamente 10 a 15 minutos. Em seguida, cubra os géis e mova-os para uma incubadora de 37 graus Celsius por mais 45 a 60 minutos para terminar a polimerização. Após a polimerização, o gel ficará opaco.

Depois de polimerizado, adicione dois a três mililitros de meio. Em seguida, solte os géis das laterais do poço passando uma pipeta 200 ao redor do perímetro do poço. Gire o prato suavemente para liberar o gel da superfície inferior.

A fim de criar microcanais PDMS para alinhar matrizes de colágeno. Primeiro prepare um mestre de silício SuA, usando técnicas padrão de litografia suave descritas em outro lugar. Em seguida, use um bastão artesanal para misturar completamente 20 gramas de base de elastômero com 2 gramas de agente de cura em um copo descartável.

Depois de bem misturado, desgaseifique a mistura PDMS colocando o copo descartável em uma câmara de vácuo sob uma pressão de vácuo de 550 milímetros de mercúrio. Desgaseifique a mistura por aproximadamente uma a uma hora e meia. Durante a desgaseificação do PDMS, prepare o mestre de silício colocando uma folha limpa de filme transparente em uma placa quente seguida pelo mestre de silício.

Certifique-se de que o molde do microcanal esteja voltado para cima. Após uma a uma hora e meia, remova o PDMS desgaseificado da câmara de vácuo. Despeje lentamente o PDMS no centro do mestre e deixe a gravidade espalhá-lo uniformemente.

Em seguida, enrole cuidadosamente uma segunda folha de filme de transparência em cima do mestre de silício e do PDMS para evitar bolhas de ar. Coloque delicadamente uma folha de borracha em cima da transparência, seguida por uma folha de acrílico de 1/8 de polegada e, em seguida, adicione o primeiro de três pesos de dez libras em cima da folha de acrílico. Inicialmente, o primeiro peso flutuará, permitirá que ele se acomode e se estabilize antes de prosseguir com as duas placas de peso restantes.

Quando estiver pronto para continuar, ajuste uma placa quente para 70 graus Celsius e catalise o PDMS por quatro horas. Depois de curado, deixe o PDMS esfriar por no mínimo mais uma hora e, em seguida, retire cuidadosamente o filme de transparência superior para o wafer. Por fim, remova os canais com a pinça.

Coloque os canais de cabeça para baixo em um novo filme de transparência limpo e limpe todas as portas com movimentos circulares com pinças afiadas. Remova quaisquer fragmentos de PDMS que se soltem. Em seguida, coloque um pedaço de fita adesiva na bancada, com o lado adesivo para cima, e coloque o canal PDMS voltado para baixo na parte superior da fita.

Pressione os canais com a extremidade redonda de um par de pinças para garantir um bom contato. Remova os canais e repita esse processo em ambos os lados até que todos os detritos visíveis tenham sido removidos. Em seguida, transfira os canais PDMS limpos e preparados para um tubo cônico de 50 mililitros cheio de etanol a 70%.

Vortex os canais na velocidade máxima por 30 segundos e, em seguida, substitua a solução por etanol fresco a 70%. Usando técnicas assépticas, transfira o canal PDMS para cima para um prato limpo e estéril. Em seguida, trate os canais por UV até que o etanol tenha evaporado.

Depois de secos, vire os canais sobre uma lamínula ou prato com fundo de vidro e pressione-os contra o vidro para fazer uma boa vedação. Adicione um adesivo de PDMS estéril para cobrir e fechar a parte central dos canais e deixe a configuração secar completamente antes de prosseguir. Em seguida, coloque uma gota de 100 microlitros de uma solução de colágeno de 10 microgramas por mililitro no topo de um canal e puxe-a através do canal usando um vácuo.

Incube os canais a 37 graus Celsius por uma hora e, em seguida, transfira os canais, ainda cheios de solução de revestimento de colágeno, para uma geladeira. Resfrie a configuração por aproximadamente 15 a 30 minutos e, em seguida, use um aspirador ou pipeta para remover a solução de revestimento de colágeno dos canais. Comece neutralizando a solução de colágeno, diluindo-a com meio celular e incubando-a no gelo por 15 minutos.

Em seguida, coloque 120 a 150 microlitros da solução de colágeno na porta A de um canal pré-resfriado. Em seguida, conecte uma pipeta de 25 mililitros a uma linha de vácuo e coloque-a sobre a porta C.Use-a para aspirar a mistura por meio de um único movimento uniforme, parando quando o colágeno chegar ao fim. O passo mais importante para gerar matrizes aleatórias é desenhar lentamente o colágeno através do canal.

Se for desenhado muito rapidamente, resultará em maior alinhamento na parte do canal ou em todo o canal. Remova cuidadosamente qualquer excesso de solução das regiões da porta e, em seguida, coloque adesivos PDMS estéreis sobre ambas as portas, A e C. Após dois a três minutos, remova o adesivo PDMS central que cobre a porta B e adicione duas a três micro camas de células a uma concentração de um a três milhões de células por mililitro na porta central. Deixe o gel polimerizar parcialmente à temperatura ambiente por mais 10 a 15 minutos e, em seguida, transfira o contrato para uma incubadora de 37 graus Celsius por mais 15 a 30 minutos.

Depois de polimerizado, remova as tampas das portas PDMS e adicione mídia para cobrir completamente o canal. Aqui, 50.000 quatro células T um foram incluídas em um gel de colágeno de 2 mg / ml ou 3,5 mg / ml por 5 dias. A linha de quatro células T é uma linha de câncer altamente contrátil da Med Aesthetic, mas só é capaz de contrair o gel de alta densidade em aproximadamente 10% Os géis de baixa densidade portáteis são contraídos 57% durante o mesmo período de tempo.

O grau de alinhamento do colágeno é modulado pela taxa de fluxo de colágeno, de modo que uma taxa de fluxo de colágeno mais alta produz um melhor alinhamento. O uso de canais mais estreitos juntamente com pressões de vácuo mais altas aumenta o alinhamento da rede de colágeno, enquanto um canal mais amplo usado em conjunto com baixas pressões de vácuo gera matrizes aleatórias. Uma vez dominado, o derramamento de géis ou canais de colágeno pode ser feito em duas horas e meia, se realizado corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de configurar os componentes antes de iniciar. Depois de começar a trabalhar com o colágeno, você precisa trabalhar rapidamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia celular 3D explorarem a adesão, migração e invasão celular em ambientes extracelulares tridimensionais.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como derramar géis de colágeno de densidades variadas e como gerar, matrizes de colágeno aleatórias e alinhadas.