Name: As análises siRNA transfecção e EMSA sobre recentemente isolados das vilosidades citotrofoblastos Humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprenda a transfectar siRNA em citotrofoblastos vilosos humanos recém-isolados usando microporação e realize ensaios EMSA para estudar interações DNA-proteína. Este método eficiente facilita pesquisas sobre regulação gênica na biologia placentária.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Conselho Nacional de Ciências e Pesquisa de Engenharia do Canadá (NSERC) (# 298527) (BB). CT foi apoiado por uma bolsa FARE institucional. AV foi apoiado por um Ph.D. NSERC Graham Bell Bolsa. BB realizou uma Research Chair Canadá em Retrovirology Humano (Tier 2). Graças a Beatrix Beisner para ajudar na revisão do texto.

O comitê de ética UQAM aprovou estes protocolos, que estão em conformidade com as orientações do comitê de ética de St-Luc Hospital do Centre Hospitalier Universitaire de Montreal (Montreal, Canadá). Os participantes assinaram um termo de consentimento informado. 1. Médio Preparação e Isolamento de primárias das vilosidades citotrofoblastos <ol><li> Prepare meio de cultura para citotrofoblastos vilosidades primárias humanas, completando meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), com HEPES 25 mM, 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina. Filtrar o meio preparado por meio estéril filtro de 0,22 um e armazenar em um congelador a -20 ° C em alíquotas de 50 ml. </li><li> Isolar citotrofoblastos vilosidades primárias de placentas frescos seguintes protocolos padrão 3. <ol><li> Utilizando um alicate, retire a membrana fetal a partir do tecido delicadamente riscar-lo, tomando cuidado para não remover o tecido das vilosidades. Corte oremanescente vilosidades da placenta em cubos de cerca de 3 x 3 cm usando bisturi e tesoura. Lavar exaustivamente com água contendo NaCl 0,9% para remover o sangue materno. <ol><li> Segurando cada cubo com um alicate, remova cuidadosamente o tecido das vilosidades dos vasos remanescentes e tecidos fibrosos usando uma tesoura. </li><li> Para 15 a 30 mg de tecido das vilosidades, digerir quatro vezes em solução salina equilibrada de Hank (HBSS) contendo tripsina (de 9,6 x 10 5-1,8 x 10 6 L; concentração final 1.2 mg / ml) e desoxirribonuclease I (ADNase I) ( concentração final de 200 ug / ml) durante 30 min a 37 ° C num banho de água com agitação contínua. Nota: Use 150 ml de volume total para a primeira digestão, 100 ml para a segunda digestão e 75 ml para as duas digestões remanescentes. </li></ol></li><li> Recolhe-se o sobrenadante contendo as células dispersas e centrifugar a 1250 xg durante 15 min sem travão. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de DMEM contendo pré-aquecido1% de penicilina / estreptomicina. </li><li> A camada de células dispersas no topo de uma descontínua 5% - 70% gradiente de silica revestida com polivinilpirrolidona (ver Tabela 1 para a preparação de gradiente) e centrifuga-se durante 23 min a 507 x g sem travão. Remover a camada de densidade entre 1,017-1,033 por aspiração e recolher as camadas entre 40% e 50% do gradiente com uma pipeta nova. Lave as células exaustivamente com 10 ml de DMEM pré-aquecido contendo 1% de penicilina / estreptomicina. Nota: A fracção recolhida corresponde a densidades entre 1.048 e 1.062, que abriga trofoblastos. </li><li> Contar as células usando um hemocitômetro. Resumidamente, células de misturar e adicionar 10 ul num tubo de microcentrífuga novo. Adicionar 10 ml de azul de tripano e misture delicadamente novamente. Elaborar a suspensão de células e preencher as câmaras hemocitômetro. Contar as células sob objetiva de 10X. </li><li> Coloque 1 x 10 6 e 4,5 x 10 6 células em tubos separados para uso em seções 1.3 e 2, respectivaly. Semear as restantes células a uma densidade de 1,5 X 10 6 células / poço em meio de cultura DMEM suplementado e a 37 ° C e 5% de CO 2 durante um máximo de 4 dias para outras experiências. </li></ol></li><li> Avaliação da pureza do isolado citotrofoblastos vilosidades primárias <ol><li> Spin 1 x 10 6 dos citotrofoblastos recentemente isoladas em microtubos a 300 x g. Descartar o sobrenadante e adicionar 1 ml de solução salina tamponada com fosfato de pré-aquecida (PBS). células centrifugar a 300 xg e remover PBS por aspiração. </li><li> Adicionar 1 ml de metanol frio para as células e incuba-se à temperatura de -20 ° C durante 20 min. células centrifugar a 300 xg durante 5 min e remover o metanol por aspiração. Cuidado: Use máscara canister, óculos de segurança e luvas de borracha ao manusear metanol. </li><li> Adicionar 1 ml de PBS à temperatura ambiente para re-hidratar as células, centrifugação a 300 xg e remover por aspiração PBS. </li><li> Incubar as células em PBS contendo FBS (01:50 [v / v] de diluição) e um FcRreagente de bloqueio (01:10) durante 45 min à temperatura ambiente para eliminar a ligação não específica. </li><li> Lavar duas vezes com 500 ul de PBS temperatura ambiente, centrifugar células a 300 xg durante 5 min e remover por aspiração PBS. Ressuspender as células em 100 ul temperatura ambiente PBS. </li><li> Incubar as células com um isotiocianato de monoclonal de rato fluoresceína (FITC) -conjugated LP5K anti-humana de clone de anticorpo citoqueratina-7 (1: 200) ou um controlo de isotipo-emparelhado não específica de anticorpos em PBS contendo 0,2% de BSA durante 45 min à temperatura ambiente em o escuro. Lave as células em PBS. </li><li> Analisar as células por citometria de fluxo 3. Use preparações de células, que demonstram um mínimo de células CK-7-positivos a 96% em citometria de fluxo para outras experiências. </li></ol></li></ol> 2. siRNA transfecção de primárias Humanos das vilosidades citotrofoblastos <ol><li> A transfecção de citotrofoblastos vilosidades primárias humanas utilizando um dispositivo de formação de microporos <ol><li> Prepare placas de 6 poços contendo2 ml de meio DMEM suplementado para a incubação de células microporated. </li><li> Após o isolamento de citotrofoblastos primários (ver secção 1.2), tomar uma alíquota de células em suspensão e determinar o número de células usando um hemocitômetro. </li><li> Transferir 1,5 x 10 6 células para um tubo de microcentrífuga e as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Lavam-se as células com 1 ml de PBS de Dulbecco (DPBS) (Mg 2+, Ca 2 + livre) e peletizar as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender as células suavemente em 100 ul de tampão de ressuspensão. Nota: Evitar mantendo suspensão de células durante mais de 15-30 min à temperatura ambiente, para maximizar a viabilidade das células e a eficiência de transfecção. </li><li> Adicionar 300 ng de Syncytin-2 siRNA (ou mexidos-ARNsi de controlo) para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e aspirar a mistura de células-siRNA transfecção utilizando uma pipeta de 100 uL. Inserira pipeta na estação (veja Lista de Materiais) e submeter as células a um 1.300 V pulso único de 30 ms. </li><li> Imediatamente transferir as células para placas de 6 poços (preparado no passo 2.1.1) contendo meio suplementado 37 ° C pré-aquecido para evitar danos nas células. </li><li> Repita os passos 2.1.5 e 2.1.6 para as amostras restantes. </li><li> Agite suavemente a placa durante 30 segundos para assegurar uma distribuição das células. Incubar a placa a 37 ° C numa atmosfera humidificada de CO 2 incubadora durante 24 a 48 h. Refrescar o meio de cultura 24 h após a transfecção. </li><li> Avaliar a eficiência de transfecção por análise de Western blot (veja as etapas 3 a 6). </li></ol></li><li> A lipofecção de siRNA em citotrofoblastos primários humanos <ol><li> Após o isolamento dos citotrofoblastos vilosidades, semear as células a uma densidade de 1,5 x 10 6 culas por po em placas de 6 poços em 2 ml de meio de cultura e incuba-se durante 18 h. </li><li> Diluir 300 ng de Syncytin-2-específica siRNA (ou Control-mexidossiARN) e 5 ul de reagente de transfecção à base de lípidos em separadas tubos de 1,5 ml em um volume total de 10 ul de forma a antibióticos e isento de soro. Incubar durante 5 min. </li><li> Misturar os reagentes diluídos e incubar durante mais 20 min à temperatura ambiente para formar o complexo de transfecção. Adicionar 90 uL de meio aos antibióticos e sem soro à mistura até um volume final de 100 ul. </li><li> Remover o meio de cultura das placas de 6 poços (passo 2.2.1). Adicionar 2 ml de meio fresco e a mistura de transfecção 100 ul a cada poço. Incubar as células a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 durante 24 a 48 h. Refrescar o meio de cultura 24 h após a transfecção. </li><li> Avaliar a eficiência de transfecção por análise de Western blot (veja as etapas 3 a 6). </li></ol></li></ol> 3. Preparação de lisados ​​de células inteiras a partir de cultura <ol><li> Remova a mídia e lavar cada poço (de passos 2.1.8 e 2.2.4), utilizando DPBS pré-aquecido (Mg 2+, Ca 2+ livre). Aspirar o DPBS e adicionar 500 mL de 0,25% de ácido tripsina / etilenodiaminotetracético (EDTA). Incubar durante 1-3 min a 37 ° C em uma incubadora de CO 2. Pare de tratamento com tripsina, adicionando 500 mL de meio de crescimento contendo soro. Nota: Use volume de mídia apropriadas de acordo com o tipo de frasco / prato: 1 ml por 10 7 células / 100 milímetros prato / 150 cm 2 frasco; 0,5 ml por 5 X 10 6 células / placa de 60 mm / 75 cm 2 balão. </li><li> Transferir as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, as células por centrifugação a 300 xg durante 2 min à temperatura ambiente. Lavam-se as células com DPBS (Mg 2+, Ca 2 + livre) e as células por centrifugação a 300 xg durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Colocar o tubo em gelo. Ressuspender o sedimento em 50-200 Radio-imunoprecipitação de Ensaio (RIPA) de tampão gelado ul (ver Quadro 2 para a composição do tampão) contendo recém adicionarEd protease e inibidores de fosfatase a uma concentração final de 1x. Resumidamente, vortex do tubo e deixar em gelo durante 30 min. </li><li> Centrifugação a 16000 xg durante 20 min a 4 ° C. Com cuidado, coloque o tubo em gelo. Usando uma pipeta, transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco pré-arrefecida mantido em gelo. Descartar o sedimento. </li></ol> 4. Preparação de Extratos nucleares de células em cultura <ol><li> Para cada poço (passo 1.2.5), lavar citotrofoblastos cultivadas duas vezes com 1 ml de DPBS pré-aquecido (Mg2 +, Ca2 + livre). Aspirar DPBS e adicionar 500 mL de 0,25% tripsina / EDTA. Incubar durante 1-3 min a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 e parar o tratamento de tripsina por adição de 500 ul de meio de crescimento contendo soro. </li><li> Transferir as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, as células por centrifugação a 300 xg durante 2 min à temperatura ambiente. Lavam-se as células com DPBS (Mg 2+, Ca 2 + livre) e as células por centrifugaçãoa 300 xg durante 2 min à temperatura ambiente. Retire com cuidado todas sobrenadante sem perturbar o sedimento e colocar o tubo no gelo. </li><li> Extracto de proteína nuclear de acordo com as instruções do fabricante. Determinar a concentração de proteína de cada amostra utilizando o ensaio de quantificação de proteínas (Bradford ou ensaio de ácido bicinconï¿½ico (BCA)). </li></ol> 5. Preparação de amostras e Electroforese <ol><li> Determinar a concentração de proteína para cada extracto celular utilizando um ensaio de quantificação de proteína (por exemplo, Bradford 8 ou 9 BCA). </li><li> De acordo com as instruções do fabricante (se os anticorpos poderiam ser utilizados em condições de redução e desnaturação), adicionar um volume igual de 2x tampão de amostra de Laemmli (Tabela 2) a 20-30 ug de proteína total. </li><li> Os lisados ​​celulares em ebulição a 100 ° C durante 5 min. Aliquota 50-100 ul de lisado para evitar ciclos de congelamento / descongelamento repetidos e armazenar os restantes tubos a -20 ° C para uso futuro. </li&gt; <li> Enquanto as amostras são aquecimento, preparar 1 L de 1x tampão de corrida (Tabela 2). </li><li> Rodar as amostras a 16.000 xg durante alguns segundos e colocá-los em gelo. </li><li> Carga igual quantidade de proteína em cada poço de um gel SDS-PAGE a 12% (ver Quadro 2 para a composição de gel), juntamente com um marcador de peso molecular. Submeter o gel durante 1 a 2 horas a 100 V. </li></ol> 6. Transferir a proteína a partir do gel para a membrana <ol><li> Activa membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) com metanol durante 1 min e lavar com solução de tampão / metanol a 10% a transferência de 1x. De acordo com as instruções do fabricante, transferir durante 30 min a 1 hora, dependendo do tamanho da proteína. Nota: eficiência de transferência pode ser avaliada utilizando a coloração de Ponceau Red antes do passo de bloqueamento. </li></ol> 7. Anticorpo de coloração <ol><li> Bloquear a membrana durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C utilizando uma solução de bloqueamento de 5%. </li><li> Incubar a membrana com anticorpos anti-Syncytin-2 (4 ng / ml; 1: 5000) 6 ou com anti-gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH; 0,4 ug / ml; 1: 500) em solução de bloqueio 5% durante a noite a 4 ° C (anti-Syncytin-2) ou durante 45 min à temperatura ambiente. Lava-se a membrana três vezes em solução salina tamponada com Tris Tween (TBST; ver Quadro 2 para a composição do tampão) durante 5 min. </li><li> Incubar a membrana com peroxidase de rábano apropriado (HRP) -conjugated anti-coelho ou anti-ratinho (1: 10000) em 5% de tampão em TBST bloqueio à temperatura ambiente durante 1 h. Lava-se a membrana três vezes em TBST durante 5 minutos e depois enxaguar em TBS. Detectar sinais utilizando o substrato blotting à base de quimioluminescência. </li></ol> 8. A marcação radioactiva de cadeia simples Oligonucleï¿½ido <ol><li> reacção de fosforilação <ol><li> Num tubo de microcentrífuga, adicionar 50 ng de um oligonucleótido para a frente juntamente com T4 polinucleótido quinase 1x tampão, 1 LT4 polinucleótido-quinase e 20 uCi (γ- 32 P) ATP e perfazer o volume de reacção para 20 l com água livre de nuclease. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 30 min. Parar a reacção por adição de 5 ul de EDTA 0,5 M. Perfazer o volume de 50 ul com água livre de nuclease. </li></ol></li><li> A remoção dos nucleótidos não incorporados a partir de oligonucleótidos <ol><li> Prepara-se uma coluna G-25 equilibrada com tampão TE (Tabela 2) seguindo as instruções do fabricante. Colocar a coluna em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de DNase-livre fresco. </li><li> Lentamente, adicionar 50 ul de sonda (a partir do passo 8.1.2) sobre a resina, tendo o cuidado de não perturbar o leito de resina. Rotação durante 2 minutos a 350 x g para recolher a amostra purificada no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Lava-se a coluna G-25 com 36 ul de água isenta de nuclease e centrifugação durante 2 minutos a 350 xg para recolhê-lo no tubo de microcentrífuga. </li></ol></li><li> A hibridação com a cadeia complementar oligonucleotide <ol><li> Transferir a sonda marcada radioactivamente (86 ul) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionar 200 ng do oligonucleótido reverso e 1 x de tampão de recozimento (Tabela 2). Aquecer 5 min a 95 ° C e deixar durante a noite à temperatura ambiente para arrefecimento. </li><li> Prepare não radioactivos oligonucleótidos de cadeia dupla pela adição de 50 ng de não marcado para a frente e oligonucleótidos e 1x de tampão de recozimento reversa num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Perfazer o volume de 100 ml com água livre de nuclease. Calor e manter a temperatura ambiente como descrito no passo 8.3.1. </li></ol></li></ol> 9. Preparação de um gel de poliacrilamida não desnaturante para EMSA <ol><li> Preparar um gel nativo a 4% (10 x 12 cm), com um espaço de pente 1,5 mm (ver Quadro 2 para a composição de gel). Limpe todas as placas de vidro com água destilada. Nota: É fundamental que as placas de ser completamente livre de detergente iónico, como SDS. </li><li> imediatamente pa solução de acrilamida entre as placas e permitir a polimerização se realizasse (aproximadamente 30 min). </li><li> Montar o aparelho de eletroforese e encher o tanque com TBE 0,5x. Pré-correr o gel durante 30 min a 1 h a 150 V antes do carregamento da amostra. </li></ol> 10. ADN de ligação Reacção <ol><li> Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar 10 mg de extrato nuclear (passo 4.3) em tampão de Deslocamento da Encadernação 1x Gel (Tabela 2) e completar o volume final para 10 ml com água livre de nuclease. Como um controlo, preparar um tubo sem o extracto nuclear. Para a reacção de competição, adicionar 1 ul de oligonucleótido de cadeia dupla frio não específica ou específica (passo 8.3.2). </li><li> Adicionar 1 ml de sonda radioactiva a partir do passo 8.3.1 a cada reacção. Incubar a reacção a temperatura ambiente durante 20 min. Adicionar 1 ml de tampão de carregamento de gel 10x por reação e carregar cada amostra no gel preparada na secção 9. </li><li> Submeter o gel durante 1 1/2 a 2 horas a 150 V. Após a migração, enrole o gel eo vidro em um filme plástico e posição em uma cassete de exposição abaixo uma tela de fósforo. Deixar cassete a 4 ° C durante 24 h. </li><li> Remova a tela a partir da cassete de exposição e inserir no dispositivo de imagem de fósforo para digitalização. </li></ol>

<ol><li>Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+origins+of+preeclampsia%3A+challenging+the+current+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis.</a> Hypertension. 51, 970-975 (2008).</li>
<li>Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFPA+Award+in+Placentology+Lecture%3A+Biology+of+the+placental+syncytiotrophoblast--myths+and+facts%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts.</a> Placenta. 31, Suppl . S75-S81 (2010).</li>
<li>Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+term+human+cytotrophoblast+cells+and+in+vitro+methods+for+studying+human+cytotrophoblast+cells%27+calcium+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake.</a> Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).</li>
<li>Morrish, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cultured+human+term+cytotrophoblast%3A+a+model+for+normal+primary+epithelial+cells+demonstrating+a+spontaneous+differentiation+programme+that+requires+EGF+for+extensive+development+of+syncytium%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">In vitro cultured human term cytotrophoblast: a model for normal primary epithelial cells demonstrating a spontaneous differentiation programme that requires EGF for extensive development of syncytium.</a> Placenta. 18, 577-585 (1997).</li>
<li>Forbes, K., Desforges, M., Garside, R., Aplin, J. D., Westwood, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+siRNA-mediated+reduction+of+mRNA+and+protein+expression+in+human+placental+explants%2C+isolated+primary+cells+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Methods for siRNA-mediated reduction of mRNA and protein expression in human placental explants, isolated primary cells and cell lines.</a> Placenta. 30, 124-129 (2009).</li>
<li>Vargas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syncytin-2+plays+an+important+role+in+the+fusion+of+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Syncytin-2 plays an important role in the fusion of human trophoblast cells.</a> J. Mol. Biol. 392, 301-318 (2009).</li>
<li>Toufaily, C., Lokossou, A. G., Vargas, A., Rassart, E., Barbeau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRE%2FAP-1-Like+Motif+Is+Essential+for+Induced+Syncytin-2+Expression+and+Fusion+in+Human+Trophoblast-Like+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A CRE/AP-1-Like Motif Is Essential for Induced Syncytin-2 Expression and Fusion in Human Trophoblast-Like Model.</a> PLoS One. 10, e0121468(2015).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+reaction+patterns+in+first+trimester+placenta%3A+implications+for+trophoblast+isolation+and+purity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening.</a> Placenta. 21, 733-741 (2000).</li>
<li>Desforges, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SNAT4+isoform+of+the+system+A+amino+acid+transporter+is+functional+in+human+placental+microvillous+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The SNAT4 isoform of the system A amino acid transporter is functional in human placental microvillous plasma membrane.</a> J. Physiol. 587, 61-72 (2009).</li>
<li>Felgner, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection%3A+a+highly+efficient%2C+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 7413-7417 (1987).</li>
<li>Guilbert, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+functional+characterization+of+villous+cytotrophoblasts+free+of+syncytial+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Preparation and functional characterization of villous cytotrophoblasts free of syncytial fragments.</a> Placenta. 23, 175-183 (2002).</li>
<li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li>
<li>Ma, B., Zhang, S., Jiang, H., Zhao, B., Lv, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoplex+morphologies+and+their+influences+on+transfection+efficiency+in+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery.</a> J. Control. Release. 123, 184-194 (2007).</li>
<li>Freeley, M., Long, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+siRNA+delivery+to+T-cells%3A+potential+clinical+applications+for+inflammatory+disease%2C+cancer+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection.</a> Biochem. J. 455, 133-147 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Estudos sobre a função da placenta humana e desenvolvimento têm sido muito melhorada através de protocolos destinados a optimizar o isolamento de várias populações de células da placenta. Um dos melhores população de células da placenta estudado continua a ser o citotrofoblastos vilosidades, o estudo de que muito tem beneficiado de protocolos otimizados que permitem o isolamento eficiente e confiável. Isto permitiu ainda um certo número de experiências, tais como estudos de transfecção e promotor. Usando um protocolo pr...

A disfunção placentária humana está associada ao desenvolvimento de várias doenças associadas à gravidez, como pré-eclâmpsia e restrição de crescimento intrauterino 1. Um importante constituinte celular da placenta são os trofoblastos, que podem ser classificados como citotrofoblastos extravilosos ou vilosos. Após a fusão, os citotrofoblastos vilosos se diferenciam ainda mais na camada sinciciotrofoblástica, uma estrutura celular multinuclear com um papel importante na troca feto-materna e na produção de hormônios 2. Os citotrofoblastos vilosos primários humanos e suas contrapartes diferenciadas representam importantes amostras biológicas e permitem que os pesquisadores estudem vários processos relacionados à placenta, como a fusão celular, em cultura. Além disso, esforços substanciais estão em andamento para identificar marcadores que facilitem o manejo adequado e melhorem as terapias preventivas específicas para doenças relacionadas à gravidez. Os laboratórios isolam rotineiramente citotrofoblastos vilosos humanos primários de placentas frescas, usando um procedimento de isolamento padrão baseado na digestão por tripsina das vilosidades placentárias 3. À medida que os citotrofoblastos cultivados perdem sua capacidade de proliferar e se diferenciar rapidamente em uma camada semelhante a sinciciotrofoblastos após a cultura 4, são necessários métodos de transfecção muito eficientes e abordagens de análise otimizadas. Estudos anteriores determinaram condições ótimas de transfecção desses citotrofoblastos primários 5. Aqui, é apresentado um método diferente de transfecção de siRNA, que foi previamente testado neste tipo de célula 6. Em comparação com uma abordagem baseada em lipofecção, este método de microporação melhora a transfecção, conforme avaliado pela extensão do silenciamento de genes específicos.
Estudos de promotor e expressão gênica também fornecem uma melhor compreensão da função placentária. Embora mais difícil de usar devido ao curto período de tempo para o qual os citotrofoblastos vilosos primários podem ser cultivados, as análises de promotores usando protocolos padrão podem ser abordadas, conforme publicado anteriormente 7. O Ensaio de Deslocamento de Mobilidade Eletroforética (EMSA) é um desses métodos in vitro comumente usados, permitindo o monitoramento rápido e fácil das interações DNA-proteína. Extratos nucleares desses trofoblastos primários foram usados para testar uma região do promotor da Sincitina-2 para interações específicas. Os resultados revelaram que os fatores de ligação podem ser detectados em diferentes momentos da cultura e de maneira específica e reprodutível.
Os dados apresentados neste protocolo confirmam que nossa abordagem de transfecção e o protocolo EMSA podem ser usados para citotrofoblastos vilosos primários isolados e serão de grande utilidade para estudar as diversas funções dos citotrofoblastos vilosos em condições normais ou patológicas.

<table><tbody><tr><td>HBSS sem&nbsp; Ca2+, Mg2+&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#H2387</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x)</td> <td>Sigma</td> <td># 14060-057</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Alta Glicose sem Hepes</td><td>Gibco</td> <td># 12100-061</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1 M)</td> <td>Gibco</td> <td># 15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Neomicina (100x)</td> <td>Gibco</td> <td># 15640-055</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#A2411</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>#C4901</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#M</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>#16170-078&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#P-1644</td><td>Para tecnologias de gradiente de densidade</td></tr><tr><td>Syncytin-2 siRNA</td><td>Ambion Life</td><td>#AM16708</td><td></td></tr><tr><td>SiRNA embaralhado</td><td>Qiagen</td><td># SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D5025</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, tipo I&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#T8003</td><td></td></tr><tr><td>DharmaFECT Lipotransfecção reagentes&nbsp;</td><td>GEhealthcare</td><td># T-2001-01</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Life technologies</td><td>#25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Protease Cocktail</td><td>Roche Diagnostic</td><td>#11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23225</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>#P9416&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-coelho, anticorpo ligado a HRP&nbsp;</td><td>Sinalização Celular</td><td>#7074</td><td></td></tr><tr><td>BM Quimioluminescência Western Blotting Substrate (POD)</td><td>Roche Diagnostic</td><td>#11500708001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>#14287-080</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleotídeo Quinase</td><td>NEB</td><td>#M0201S</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&gamma;-32P]</td><td>Perkin Elmer</td><td>#BLU002A100UC</td><td></td></tr><tr><td>Acrylmide</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#A9099</tr><tr><td>TEMED</td><td>Life technologies</td><td>#17919</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de Amônio</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#A3678</tr><tr><td>Anti-citoqueratina-7 anti-humano clone LP5K, FITC conjugado</td><td>Millipore</td><td>CBL194F</td><td>Diluição 1:200</td></tr><tr><td>FcR reagente bloqueador&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130- 059-901</td><td>Diluição 1:10</td></tr><tr><td>Citômetro de Fluxo BD Sistema Acuri</td><td>Aparelho Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microporator MP-100&nbsp;</td><td>Tampão de Ressuspensão Digital Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R (Sistema de Transfecção Neon 100&nbsp; &micro; l Kit)</td> <td>Tecnologias de vida</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>membrana PVDF&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010&nbsp;</td><td>Ativar com metanol</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GAPDH humano</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-137179</td><td>1:500</td></tr><tr><td>HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugado anti-coelho anti-coelho anticorpo ou anti-camundongo</td><td>Sinalização Celular</td><td>#7074</td><td>1:10,000</td></tr><tr><td>HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugado anti-rato de cabra anti-mouse</td><td>Sinalização Celular</td><td>#7076&nbsp;</td><td>1:10.000</td></tr><tr><td>Reagente de Extração Nuclear e Citoplasmática NE-PER</td><td>Thermo Scientific</td><td>#78833</td><td></td></tr><tr><td>G-25 coluna&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>#27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de imagem de quimioluminescência e fluorescência</td><td>Montr&eacute; al Biotech</td><td>Fusion FX5</td><td></td></tr><tr><td>4% gel nativo</td><td>PBS</td><td></td><td></td>caseiro</tr> Feito <tr><td></td><td>em casa</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>Sistema de Imageador Molecular Pessoal (PMI)</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

as análises sirna transfecção e emsa sobre recentemente isolados das vilosidades citotrofoblastos humanos

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Os citotrofoblastos vilosos primários humanos são uma fonte muito útil de células primárias para estudar as funções placentárias e os mecanismos regulatórios e para compreender doenças relacionadas à gravidez. Neste protocolo, citotrofoblastos vilosos primários humanos recém-isolados de placentas por meio de um protocolo padrão de DNase / tripsina são microporados com pequeno RNA interferente (siRNA). Essa abordagem proporcionou maior eficiência para a transfecção de siRNA quando comparada a um método baseado em lipofecção. As células transfectadas podem ser posteriormente analisadas por Western blot padrão dentro de um período de 3-4 dias após a transfecção. Além disso, usando citotrofoblastos vilosos primários cultivados, a análise do Ensaio de Deslocamento de Mobilidade Eletroforética (EMSA) foi otimizada e realizada em extratos dos dias 1 a 4. O uso dessas células primárias cultivadas e o protocolo descrito permitem uma avaliação da implicação de genes específicos e fatores de transcrição no processo de diferenciação do citotrofoblasto viloso em uma camada celular semelhante ao sinciciotrofoblasto. No entanto, o período de tempo limitado permitido na cultura impede o uso de métodos que requerem mais tempo, como a geração de uma população de células estável. Portanto, o teste dessa população de células requer protocolos de transferência de genes altamente otimizados.

placentas frescos de gestação a termo foram usados ​​para isolar citotrofoblastos vilosidades primárias humanos para conduzir o conjunto de experimentos apresentados na seção Protocolo. Seguindo o seu isolamento, analisou-se primeiro a pureza de citotrofoblastos através da utilização do marcador citoqueratina-7 (Figura 1). Preparações celulares foram assim coradas utilizando um anticorpo monoclonal anti-citoqueratina-7. A Figura 1 representa os resultado...

Este protocolo descreve um método para eficazmente transfectar siARN em citotrofoblastos vilosidades humanos isolados de fresco utilizando formação de microporos e identificação de complexos de ADN-proteína nestas células. As células transfectadas pode ser monitorado por análises Western blot e EMSA durante o tempo de cultura de 4 dias.

As análises siRNA transfecção e EMSA sobre recentemente isolados das vilosidades citotrofoblastos Humanos

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar as condições ideais para a transfeção de citotrofoblastos vilosos primários recém-isolados e apresentar um método para a identificação de interações entre DNA e proteínas em sítios promotores. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da pesquisa placentária, como aquelas relacionadas a genes envolvidos na diferenciação de citotrofoblastos e aos mecanismos regulatórios envolvidos em sua expressão. A principal vantagem dessa técnica é que ela é fácil de realizar e muito eficiente.Além disso, o tempo necessário para realizar este experimento é curto e pode incluir uma grande variedade de amostras. A demonstração desses procedimentos será feita por Chirine Toufaily, ex-aluna de doutorado do meu laboratório, bem como por Yong Xiao, pesquisador associado. Aqui, citotrofoblastos vilosos primários são isolados de placentas frescas de acordo com protocolos padrão.O primeiro passo deste protocolo é analisar a pureza da preparação por meio de análise de FACS. Primeiro, centrifugue um vezes dez elevado à sexta dos citotrofoblastos recém-isolados em tubos de microcentrífuga a 300 vezes G durante cinco minutos. Após a centri

sirna-transfection-emsa-analyses-on-freshly-isolated-human-villous

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Neste protocolo, descreve-se a dissecção de placenta de rato sobre a gravidez d10.5, seguido de isolamento das células trofoblásticas, utilizando um gradiente de Percoll. Em seguida, demonstrar o uso de células isoladas, num ensaio de invasão de Matrigel.

Isolamento de células primário do mouse trofoblasto e Ensaio invasão do trofoblasto

Este manuscrito apresenta um modelo in vitro único de células citotrofoblásticas vilosas humanas imunopurificadas cultivadas sob hipóxia/reoxigenação. Este modelo é adequado para estudar os efeitos protetores de tratamentos promissores, como a melatonina, nas complicações da gravidez associadas ao aumento do estresse oxidativo e à alteração da função placentária.

Trophoblast primário humano Cultura celular modelo para estudar os efeitos protetores da melatonina contra a hipóxia / Disruption induzida pela reoxigenação

As células gigantes trofoblásticas (TGCs) desempenham um papel fundamental na placenta para garantir uma gravidez saudável. Apresentamos um protocolo para avaliar o estado transcricional de genes em TGCs por hibridização in situ fluorescente nascente em cortes de criostato de embriões pós-implantação ou culturas de curto prazo de cones ectoplacentários embrionários do dia 7.

Análise transcricional por RNA Nascente PEIXES de<em&gt; In Vivo</em&gt; Células trofoblásticas gigantes ou<em&gt; In Vitro</em&gt; Culturas de curto prazo de Ectoplacental Cone explantes

Aqui, apresentam-se um protocolo para a dissecção de cordão umbilical humano (UC) e a amostra da placenta fetal em cordão de revestimento (CL), geleia de Wharton (WJ), junção de cabo-placenta (CPJ), e na placenta fetal (FP) para o isolamento e caracterização de células estromais mesenquimais (MSCs), utilizando a técnica de cultura de explante.

Isolamento e Caracterização de células mesenquimais do estroma a partir de cordão umbilical humano e Fetal Placenta

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar eficientemente células trofoblásticas humanas a partir de células-tronco pluripotentes humanas usando proteína morfogênica óssea 4 e inibidores das vias Activina/Nodal. Este método é adequado para a diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas e pode gerar grandes quantidades de células para manipulação genética.

Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

Apresentado aqui é um protocolo para amostragem de tecido placentário humano das vilosidades seguido pelo isolamento de cytotrophoblasts para cultura de células primárias. Tratamento de trophoblasts com TNFa recapitula a inflamação no ambiente intra-uterino obeso e facilita a descoberta de alvos moleculares regulada pela inflamação na placenta com obesidade materna.

Um modelo de trofoblasto humano primário para estudar o efeito da inflamação associada com obesidade materna no Regulamento de autofagia na Placenta

Este estudo apresenta um protocolo para o tecido reversível compensação, imunocoloração, renderização 3D e análise de redes vasculares em amostras de vilosidades da placenta humana na ordem de 1-2 mm3.

Renderização tridimensional e análise de Immunolabeled, esclareceu humana da placenta vilosa redes vasculares

Este protocolo demonstra um método para o isolamento de células de decidual humanas primários coletados de membranas fetais de placentas de termo que podem ser usadas para uma variedade de aplicações (ou seja, imunocitoquímica, citometria de fluxo, etc.) com o objetivo para estudar o papel das populações de células diferentes em complicações na gravidez.

Isolamento de células humanas primárias do Decidual de membranas fetais de termo placentas

Aqui, apresentamos um protocolo altamente acessível para avaliar o movimento de célula em células do trofoblasto humana usando três ensaios in vitro: ensaio de zero, o ensaio de invasão transwell e o ensaio de proliferação celular.

Em Vitro ensaios para avaliar a migração, invasão e proliferação de linhas de células humanas imortalizado primeiro trimestre trofoblasto

O presente protocolo permite a recuperação de estruturas semelhantes a tubos formadas no ensaio clássico de formação de tubos de angiogênese in vitro , onde células, como células trofoblásticas, se organizam em estruturas semelhantes a capilares sobre uma camada de matriz de membrana basal extracelular. As estruturas recuperadas são usadas para isolamento de RNA e proteínas para várias análises bioquímicas.

Recuperação de células trofoblásticas do ensaio de formação de tubos de angiogênese para análise de expressão de marcadores de diferenciação

Esse protocolo permite a purificação, caracterização e cultivo de trofoblastos extravilosos primários HLA-G+ (EVT) a partir da decídua basal e da membrana coriônica das placentas humanas a termo. Culturas primárias de EVT mantêm a viabilidade por 96 horas, permitindo co-cultura com células imunes maternas comparadas por amostra e subsequente análise citométrica e molecular de fluxo de suas interações.

Purificação de Trofoblastos Extravillosos HLA-G+ de Tecidos Placentários Humanos para Fenotipagem e Análise Funcional

Aprenda a transfectar siRNA em citotrofoblastos vilosos humanos recém-isolados usando microporação e realize ensaios EMSA para estudar interações DNA-proteína. Este método eficiente facilita pesquisas sobre regulação gênica na biologia placentária.

As análises siRNA transfecção e EMSA sobre recentemente isolados das vilosidades citotrofoblastos Humanos

Explorar mais vídeos