Geração de mutantes sem marcadores marcados e no modelo de cianobactérias da espécie

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um sistema para gerar mutantes não marcados na PCC6803 de espécies de cianobactérias Synechocystis e mutantes marcados em espécies de Synechococcus PCC7002. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da genética de cianobactérias. Por exemplo, como introduzir alterações cromossômicas em uma cepa.

Por inserção de um gene de resistência a antibióticos, seguida de uma remoção subsequente deste, usando um marcador selecionável negativo. A principal vantagem dessa técnica é que as cepas podem ser manipuladas geneticamente repetidamente. Permitir que quantas alternâncias sejam introduzidas em uma cepa conforme desejado.

Após a preparação dos meios, cepas de cianobactérias e plasmídeos, de acordo com o protocolo de texto. Configure uma cultura fresca inoculando uma alça cheia de células de cianobactérias, em 30 a 50 mililitros de meio BG11. Cultive a cultura à luz a 30 graus Celsius por dois a três dias, até um OD7500, igual a 0,2 a 0,6.

Após a incubação, centrifugue um a dois mililitros da cultura a 2.300g por cinco minutos. Em seguida, depois de descartar o sobrenadante, use o meio BG11 para lavar os pellets uma vez, pipetando suavemente para ressuspender as células. Como o vórtice pode resultar na perda de pili, que são essenciais para a captação de DNA.

Depois de peletizar as células novamente e remover o sobrenadante, adicione o meio BG11 a um volume final de 100 microlitros e transfira as células para um tubo inferior redondo de 14 mililitros. Em seguida, adicione 1 micrograma de plasmídeo A previamente preparado às células. E bata suavemente para misturar.

Em seguida, coloque os tubos horizontalmente na incubadora a 30 graus Celsius e incube por quatro a seis horas. Após a incubação, espalhar alíquotas da mistura de ADN plasmidial de cultura de células em placas de ágar BG11 sem antibióticos. E incubar a 30 graus Celsius.

Aproximadamente 24 horas depois, prepare uma solução de ágar 0,6%, em água contendo canamicina. E deixe esfriar até 42 graus Celsius. Em seguida, adicione 2,5 a três mililitros às bordas das placas de cultura e incline a placa, de modo que a solução forme uma camada superior de ágar uniforme na superfície.

Incube as placas por aproximadamente sete dias para que as colônias sejam visíveis. Em seguida, divida uma placa de ágar BG11 mais canamicina em seis setores. E use um palito de ponta romba para riscar colônias individuais.

Para realizar a PCR, para confirmar o nocaute marcado, transfira uma pequena quantidade de células para um tubo contendo 50 microlitros de água e aproximadamente 20 esferas de vidro de 425 a 600 micrômetros. Agite as células e grânulos a aproximadamente 2.000 rpm por cinco minutos, antes de girar a 15.700 g por cinco minutos. Em seguida, use cinco microlitros do sobrenadante para preparar reações de PCR de 50 microlitros com preliminares de DNA aderente.

Para validar os mutantes, após projetar primers de acordo com o protocolo de texto, produto amplificado usando o seguinte programa e incluir um controle do tipo selvagem. Através de gelelektroforeses, verificamos o genótipo de transformantes knockout. Mostrando uma banda de aproximadamente quatro pares de kilobase e sem a banda do tipo selvagem.

Consulte o protocolo de texto para obter mais detalhes. Se ainda estiver presente uma banda de tipo selvagem, repetir a tensão na placa fresca e repetir a PCR. Repita o processo de validação até que o mutante seja segregado e nenhuma banda de tipo selvagem seja observada na reação de PCR.

Para uma cepa que mostra perfil mutante marcado, re-streak em uma placa nova para uso na geração de um nocaute não marcado. Para gerar mutantes de Synechocystis não marcados, estabeleça uma nova cultura do nocaute marcado inoculando a alça cheia de células em 30 a 50 mililitros de meio BG11. Cultive a cultura por dois a três dias até OD750, igual a 0,2 a 0,6.

Centrifugue 10 mililitros da cultura a 2.300 g por cinco minutos e descarte o sobrenadante. Em seguida, usamos o meio BG11 para lavar suavemente as células. Depois de adicionar BG11 a um volume final de 200 microlitros e transferir as células para um tubo inferior redondo de 14 mililitros, adicione 1 micrograma de DNA de plasmídeo B às células e bata suavemente para misturar.

Em seguida, coloque os tubos horizontalmente na incubadora e incube por quatro a seis horas. Após a incubação, adicione 1,8 mililitros de meio BG11 e incube as amostras por um total de quatro dias com agitação. Este é um tempo suficiente para permitir que a recombinação ocorra nas múltiplas cópias cromossômicas.

Coloque alíquotas de 50, 10 e 1 microlitro da cultura transformada em placas de ágar BG11 mais 5% de sacarose e incube por aproximadamente sete dias para gerar colônias únicas. Em seguida, usando um palito de dente de ponta romba, ecloda de 30 a 50 colônias individuais em placas BG11 mais canamicina. Em seguida, aplique BG11 mais 5% de sacarose.

Colônias que crescem em BG11 mais sacarose, mas não em placas com canamicina, são potenciais nocautes não marcados. As colônias que crescem em ambas as placas provavelmente são resistentes à sacarose devido a uma mutação no gene sacB. Seguindo o método de PCR, demonstrado anteriormente neste vídeo, verifique os nocautes não marcados, que produzirão uma banda de gel correspondente ao tamanho do tipo selvagem menos a região excluída.

Se a cepa mostrar um perfil mutante não marcado, coloque-a novamente em ágar BG11 fresco sem antibióticos. Para armazenar as cepas a longo prazo, estabeleça uma nova cultura da cepa inoculando uma alça cheia de células em 30 a 50 mililitros de meio BG11. Cultive a cultura por três a quatro dias e OD750 igual a 0,4 a 0,7.

Depois de usar BG11 para lavar as células uma vez, ressuspenda o pellet em aproximadamente dois mililitros de BG11. Adicione 0,8 mililitros das células concentradas a um tubo. Em seguida, adicione 0,2 mililitros de glicerol esterilizado com filtro a 80%.

Para outro tubo, adicione 0,93 mililitros de células concentradas e 0,07 mililitros de DMSO. Armazene os dois tubos a 80 graus Celsius negativos. Para reviver as cepas, remova o tubo e use um palito de dente sem corte para raspar algumas células em uma placa de ágar sem antibióticos.

Em seguida, use um laço estéril para listrar normalmente. Esta figura mostra exemplos de plasmídeos A e B usados para gerar mutantes de deleção. Em cada caso, as cinco regiões principais e três principais são aproximadamente 900 a 1.000 pares de bases.

O plasmídeo B também pode conter um de genes entre as regiões flanqueadoras de cinco primos e três primos de aproximadamente um par de quilobases. Ou uma versão modificada da sequência do gene nativo. Após a transformação com o plasmídeo A, várias centenas de colônias aparecerão em uma placa após sete a 10 dias.

Se os genes não são essenciais e os mutantes demonstram crescimento, semelhante à cepa do tipo selvagem, todos os cromossomos devem conter uma sequência inserida de cópia npt1 / sacB, conforme determinado por PCR. Se os genes não são essenciais e os mutantes crescem lentamente, então várias rodadas de re-streaking com concentrações crescentes de canamicina são necessárias para obter um mutante marcado segregado. Se, após a re-estria, um mutante marcado não for obtido, o gene provavelmente é essencial para a sobrevivência.

A maioria das colônias individuais, obtidas a partir da transformação com plasmídeo B, será sensível à canamicina e resistente à sacarose. Como demonstrado aqui, a amplificação por PCR da região alvo nessas colônias mostra que quase 100% do perfil mutante não marcado. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em horas durante um período de seis semanas, se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar a técnica estéril. Após este procedimento, outros métodos, como medir a produção de oxigênio ou espectrometria de massa por cromatografia gasosa, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como medir taxas fotossintéticas ou produção de metabólitos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da genética de cianobactérias.

Explorar os principais processos bioquímicos e fisiológicos neste filo e cepas de desenvolvimento para fins industriais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar nocautes não marcados em espécies de Synechococcus PCC6803.