Name: Geração de mutantes sem marcadores marcados e no modelo de cianobactérias da espécie (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Aprenda a gerar mutantes sem marcadores em Synechocystis sp. PCC6803 e mutantes marcados em Synechococcus sp. PCC7002. Este método permite manipulações genéticas repetidas para engenharia de cianobactérias.

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<ol><li>Zwirglmaier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+phylogeography+of+marine+Synechococcus+and+Prochlorococcus+reveals+a+distinct+partitioning+of+lineages+among+oceanic+biomes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Global phylogeography of marine Synechococcus and Prochlorococcus reveals a distinct partitioning of lineages among oceanic biomes.</a> Environ Microbiol. 10, 147-161 (2008).</li>
<li>Galloway, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+cycles%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Nitrogen cycles: past, present, and future.</a> Biogeochemistry. 70, 153-226 (2004).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+cyanobacterial+alkane+production+to+the+ocean+hydrocarbon+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Contribution of cyanobacterial alkane production to the ocean hydrocarbon cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2015).</li>
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<li>Lea-Smith, D. J., Bombelli, P., Vasudevan, R., Howe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic%2C+respiratory+and+extracellular+electron+transport+pathways+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic, respiratory and extracellular electron transport pathways in cyanobacteria.</a> Biochim Biophys Acta. , (2015).</li>
<li>McCormick, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+production+through+oxygenic+photosynthesis+using+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC+6803+in+a+bio-photoelectrolysis+cell+%28BPE%29+system%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Environ.+Sci%22%5BJournal%5D)">Hydrogen production through oxygenic photosynthesis using the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 in a bio-photoelectrolysis cell (BPE) system.</a> Energy Environ. Sci. 6, 2682-2690 (2013).</li>
<li>Bradley, R. W., Bombelli, P., Lea-Smith, D. J., Howe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+oxidase+mutants+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+show+increased+electrogenic+activity+in+biological+photo-voltaic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Terminal oxidase mutants of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 show increased electrogenic activity in biological photo-voltaic systems.</a> Phys Chem Chem Phys. 15, 13611-13618 (2013).</li>
<li>Ducat, D. C., Way, J. C., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cyanobacteria+to+generate+high-value+products%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering cyanobacteria to generate high-value products.</a> Trends Biotechnol. 29, 95-103 (2011).</li>
<li>Dismukes, G. C., Carrieri, D., Bennette, N., Ananyev, G. M., Posewitz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquatic+phototrophs%3A+efficient+alternatives+to+land-based+crops+for+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Aquatic phototrophs: efficient alternatives to land-based crops for biofuels.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 235-240 (2008).</li>
<li>Tan, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+natural+products+from+marine+cyanobacteria+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Bioactive natural products from marine cyanobacteria for drug discovery.</a> Phytochemistry. 68, 954-979 (2007).</li>
<li>Volk, R. B., Furkert, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antialgal%2C+antibacterial+and+antifungal+activity+of+two+metabolites+produced+and+excreted+by+cyanobacteria+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Antialgal, antibacterial and antifungal activity of two metabolites produced and excreted by cyanobacteria during growth.</a> Microbiol Res. 161, 180-186 (2006).</li>
<li>Scott, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+from+algae%3A+challenges+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biodiesel from algae: challenges and prospects.</a> Curr Opin Biotechnol. 21, 277-286 (2010).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phycobilisome-deficient+strains+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803+have+reduced+size+and+require+carbon-limiting+conditions+to+exhibit+enhanced+productivity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phycobilisome-deficient strains of Synechocystis sp. PCC 6803 have reduced size and require carbon-limiting conditions to exhibit enhanced productivity.</a> Plant Physiol. 165, 705-714 (2014).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thylakoid+terminal+oxidases+are+essential+for+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+to+survive+rapidly+changing+light+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Thylakoid terminal oxidases are essential for the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 to survive rapidly changing light intensities.</a> Plant Physiol. 162, 484-495 (2013).</li>
<li>Liu, X., Sheng, J., Curtiss, R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+production+in+genetically+modified+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6899-6904 (2011).</li>
<li>Xu, H., Vavilin, D., Funk, C., Vermaas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+deletions+of+small+cab-like+proteins+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC+6803+-+Consequences+for+pigment+biosynthesis+and+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple deletions of small cab-like proteins in the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 - Consequences for pigment biosynthesis and accumulation.</a> J Biol Chem. 279, 27971-27979 (2004).</li>
<li>Castenholz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+methods+for+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Culturing methods for Cyanobacteria.</a> Method Enzymol. 167, 68-93 (1988).</li>
<li>Mitschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimentally+anchored+map+of+transcriptional+start+sites+in+the+model+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An experimentally anchored map of transcriptional start sites in the model cyanobacterium Synechocystis sp PCC6803.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2124-2129 (2011).</li>
<li>Ried, J. L., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+nptI-sacB-sacR+cartridge+for+constructing+directed%2C+unmarked+mutations+in+gram-negative+bacteria+by+marker+exchange-eviction+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis.</a> Gene. 57, 239-246 (1987).</li>
<li>Vieira, J., Messing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pUC+plasmids%2C+an+M13mp7-derived+system+for+insertion+mutagenesis+and+sequencing+with+synthetic+universal+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers.</a> Gene. 19, 259-268 (1982).</li>
<li>Vermaas, W. F. J., Williams, J. G. K., Rutherford, A. W., Mathis, P., Arntzen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+Engineered+Mutant+of+the+Cyanobacterium+Synechocystis+6803+Lacks+the+Photosystem-Ii+Chlorophyll-Binding+Protein+Cp-47%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetically Engineered Mutant of the Cyanobacterium Synechocystis 6803 Lacks the Photosystem-Ii Chlorophyll-Binding Protein Cp-47.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 9474-9477 (1986).</li>
<li>Westphal, S., Heins, L., Soll, J., Vothknecht, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vipp1+deletion+mutant+of+Synechocystis%3A+A+connection+between+bacterial+phage+shock+and+thylakoid+biogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vipp1 deletion mutant of Synechocystis: A connection between bacterial phage shock and thylakoid biogenesis?</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4243-4248 (2001).</li>
<li>Zhang, S. Y., Shen, G. Z., Li, Z. K., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vipp1+Is+Essential+for+the+Biogenesis+of+Photosystem+I+but+Not+Thylakoid+Membranes+in+Synechococcus+sp+PCC+7002%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Vipp1 Is Essential for the Biogenesis of Photosystem I but Not Thylakoid Membranes in Synechococcus sp PCC 7002.</a> J Biol Chem. 289, 15904-15914 (2014).</li>
<li>Taroncher-Oldenberg, G., Nishina, K., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+the+polyhydroxyalkanoate-specific+beta-ketothiolase+and+acetoacetyl+coenzyme+A+reductase+genes+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+strain+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of the polyhydroxyalkanoate-specific beta-ketothiolase and acetoacetyl coenzyme A reductase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp strain PCC6803.</a> Appl Environ Microbiol. 66, 4440-4448 (2000).</li>
<li>Hein, S., Tran, H., Steinbuchel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synechocystis+sp.+PCC6803+possesses+a+two-component+polyhydroxyalkanoic+acid+synthase+similar+to+that+of+anoxygenic+purple+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synechocystis sp. PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria.</a> Arch Microbiol. 170, 162-170 (1998).</li>
<li>Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+of+photoautotrophic+protein+production+by+combining+promoters+and+neutral+sites+in+Synechocystis+6803%2C+a+cyanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium.</a> Appl Environ Microbiol. , (2015).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os passos mais críticos na geração de mutantes não marcados são: 1) um projeto cuidadoso plasmídeo para garantir que apenas a região de destino é alterada; 2) garantir que as amostras permanecem axênico, especialmente quando cultivadas em sacarose; 3) para a geração de células chapeamento mutante marcada inicialmente transformado em placas de agar BG11 falta antibióticos, seguido por adição de ágar antibióticos mais 24 horas mais tarde; 4) cultura marcada mutantes para 4 dias completos antes de plaqueamento em BG11 além...

As cianobactérias são um filo antiga e diversificada evolutivamente de bactérias encontradas em quase todos ambiente natural na Terra. Em ecossistemas marinhos são particularmente abundantes e desempenham um papel fundamental em muitos ciclos de nutrientes, sendo responsável por cerca de metade da fixação de carbono 1, a maioria da fixação de nitrogênio 2 e centenas de milhões de toneladas de produção de hidrocarbonetos 3 nos oceanos anualmente. Cloroplastos, a organela responsável pela fotossíntese em algas e plantas eucariótica, são susceptíveis de ter evoluído de uma cianobactéria que foi engolida por um organismo hospedeiro 4. As cianobactérias provaram organismos modelo útil para o estudo da fotossíntese, transporte de electrões 5 e vias bioquímicas, muitos dos quais são conservados em plantas. Em adição cianobactérias são cada vez mais utilizados para a produção de alimentos, biocombustíveis 6, 7 e electricidade industriais compostos 8, devido à sua oiconversão ghly eficiente de água e CO 2 a biomassa usando a energia solar 9. Muitas espécies podem ser cultivadas em terras não-aráveis ​​com nutrientes mínimos e água do mar, o que sugere que as cianobactérias potencialmente poderiam ser cultivadas em grande escala, sem afetar a produção agrícola. Certas espécies também são fontes de produtos naturais, incluindo antifúngicos, antibacterianos e anti-câncer compostos 10,11. A capacidade de gerar mutantes é a chave para a compreensão de cianobactérias fotossíntese, bioquímica e fisiologia, e essencial para o desenvolvimento de cepas para fins industriais. A maioria dos trabalhos publicados produzir estirpes geneticamente modificados por inserção de uma cassete de resistência a antibiótico no local de interesse. Isto limita o número de mutações que podem ser introduzidas numa estirpe, como apenas algumas cassetes de resistência aos antibióticos estão disponíveis para uso em cianobactérias. Estirpes que contêm genes que conferem re antibióticosistance não pode ser usado para a produção industrial em lagoas abertas, o que é susceptível de ser o único meio de baixo custo para a produção de biocombustíveis e outros produtos de baixo valor 12. A geração de mutantes sem marcação supera essas limitações. mutantes não marcadas não contêm DNA estranho, a não ser intencionalmente incluídos, e pode ser manipulado diversas vezes. Por isso, é possível gerar o maior número de alterações em uma cepa como desejado. Além disso, os efeitos polares de genes a jusante do local de modificação pode ser minimizado, permitindo a modificação mais preciso do organismo 13. Para gerar estirpes mutantes, plasmídeos suicidas contendo dois fragmentos de ADN idênticos às regiões no cromossoma de cianobactérias que flanqueiam o gene a ser suprimido (denominado a 5 &#39;e 3&#39; que flanqueiam regiões) são construídos em primeiro lugar. Dois genes são então inserida entre estas regiões flanqueadoras. Uma delas codifica uma proteína de resistência a antibiótico; o segundo codifica SacB, que produces levanossacarase, um composto que confere sensibilidade à sacarose. Na primeira fase do processo, os mutantes marcadas, as estirpes ou seja, contendo algum ADN estranho, são gerados. A construção de plasmídeo é misturado com as células de cianobactérias e o ADN é tomado naturalmente pelo organismo. Os transformantes são seleccionados por crescimento em placas de agar contendo os antibióticos apropriados e o genótipo mutante verificada por PCR. plasmídeos suicidas não pode replicar dentro da estirpe de interesse. Portanto, quaisquer colónias resistentes ao antibiótico irá resultar a partir de um evento de recombinação em que o gene de interesse é inserida no cromossoma. Para gerar mutantes não marcados, o mutante marcada é, em seguida, misturado com um segundo plasmídeo suicida contendo apenas as regiões f lanqueadoras 5 &#39;e 3&#39;. No entanto, se for necessária a inserção de ADN estranho, num plasmídeo que consiste em 5 &#39;e 3&#39; com regiões de uma cassete que contém os genes de interesse inserido entre estes fragmentos de ADN de flanqueamento, pode ser utilizado. Selecção é através de crescimento em placas de agar contendo sucrose. Como a sacarose é letal para as células quando o produto do gene sacB é expresso, as únicas células que sobrevivem são aquelas nas quais ocorreu um segundo evento de recombinação, em que o gene de sensibilidade de sacarose, em adição ao gene de resistência aos antibióticos, foi recombinado para fora do cromossoma e para o plasmídeo. Como consequência da permuta de recombinação, as regiões f lanqueadoras e qualquer ADN entre eles são inseridos no cromossoma. Temos utilizado com sucesso destes métodos para gerar múltiplas mutações cromossómicas na mesma estirpe de Synechocystis sp. PCC6803 (doravante referida como Synechocystis) 13,14, para introduzir mutações pontuais em um gene de interesse 13 e para a expressão de cassetes de genes. Enquanto a geração de nocautes não marcado foi demonstrada antes de nosso trabalho em Synechocystis 15,16, um método detalhado, auxiliado poruma apresentação visual dos passos críticos, não está disponível publicamente. Nós também aplicaram o mesmo método para geração de nocautes marcados em outro cianobactéria modelo, Synechococcus sp. PCC7002 (doravante referida como Synechococcus). Este protocolo fornece um método claro, simples para a geração de mutantes e um protocolo rápido para validar e armazenar estas estirpes.

<table><tbody><tr><td>NaNO3</td><td>Sigma</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>ácido cítrico</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Fisher</td><td>EDT002</td><td></td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Sigma</td><td>339067</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2.4H2O</td><td>Sigma</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4.2H2O</td><td>Sigma</td><td>331058</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Co(NO3)2.6H2O</td><td>Sigma</td><td>239267</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de amônio férrico</td><td>Sigma</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Fisher</td><td>SODC001</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>SODH001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>cianocobalamina</td><td>Sigma</td><td>47869</td><td></td></tr><tr><td>Na2S2O3</td><td>Sigma</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Bacto</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fisher</td><td>SUC001</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 90 mm com ventilação tripla</td><td>Greiner</td><td>633185</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &micro; filtros m</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Frascos cônicos de 100 ml</td><td>Pyrex</td><td>CON004</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 100 mm x 38&nbsp; m</td><td>Bemis</td><td>FIL003</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerase de alta fidelidade&nbsp;</td>Kit de purificação de DNA <td>Phusion</td><td>F-530</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MoBio</td><td>12100-300</td><td></td></tr><tr><td>Endonucleases de restrição</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 ligase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani caldo</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de canamicina</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Kit miniprep de plasmídeo GeneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>14 ml tubo de fundo redondo</td><td>BD falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA polimerase</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>425-600 &micro; m contas de vidro</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpadas fluorescentes</td><td>Gro-Lux</td><td>69</td><td></td></tr><tr><td>HT multitron fotobiorreator</td><td>Infors</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

geração de mutantes sem marcadores marcados e no modelo de cianobactérias da espécie

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

As cianobactérias são organismos ecologicamente importantes e plataformas potenciais para a produção de biocombustíveis e produtos industriais úteis. A manipulação genética de cianobactérias, especialmente organismos modelo como Synechocystis sp. PCC6803 e Synechococcus sp. PCC7002, é uma ferramenta fundamental para pesquisa básica e aplicada. A geração de mutantes não marcados, por meio da qual alterações cromossômicas são introduzidas em uma cepa por meio da inserção de um de resistência a antibióticos (um fragmento manipulável de DNA contendo um ou mais genes), seguido pela remoção subsequente desse usando um marcador selecionável negativo, é uma técnica particularmente poderosa. Mutantes não marcados podem ser manipulados geneticamente repetidamente, permitindo que quantas alterações sejam introduzidas em uma cepa conforme desejado. Além disso, a ausência de genes que codificam proteínas de resistência a antibióticos na cepa mutada é desejável, pois evita a possibilidade de 'fuga' de organismos resistentes a antibióticos para o meio ambiente. No entanto, métodos detalhados para rodadas repetidas de manipulação genética de cianobactérias não são bem descritos na literatura científica. Aqui, fornecemos uma descrição abrangente dessa técnica, que usamos com sucesso para gerar mutantes com deleções múltiplas, mutações de ponto único dentro de um gene de interesse e inserção de novos de genes.

O plasmídeo concepção é crítica para a geração bem sucedida de ambos os mutantes marcadas e não marcadas. A Figura 1 dá um exemplo do plasmídeo A e B usadas para gerar um mutante de deleção nos genes de Synechocystis cpcC1 e cpcC2 13. Em cada caso, as regiões f lanqueadoras 5 &#39;e 3&#39; são aproximadamente 900-1.000 pb. flanqueando reduzidas pode ser utilizado, embora o menor temos testadas com sucesso tem sido aproximadamente 500...

A introdução de múltiplas alterações genômicas em cianobactérias é uma ferramenta essencial no desenvolvimento de cepas para fins industriais e de pesquisa básica. Descrevemos um sistema para geração de mutantes não marcados na espécie modelo de cianobactéria Synechocystis sp. PCC6803 e mutantes marcados em Synechococcus sp. PCC7002.

Geração de mutantes sem marcadores marcados e no modelo de cianobactérias da espécie

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um sistema para gerar mutantes não marcados na PCC6803 de espécies de cianobactérias Synechocystis e mutantes marcados em espécies de Synechococcus PCC7002. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da genética de cianobactérias. Por exemplo, como introduzir alterações cromossômicas em uma cepa.Por inserção de um gene de resistência a antibióticos, seguida de uma remoção subsequente deste, usando um marcador selecionável negativo. A principal vantagem dessa técnica é que as cepas podem ser manipuladas geneticamente repetidamente. Permitir que quantas alternâncias sejam introduzidas em uma cepa conforme desejado.Após a preparação dos meios, cepas de cianobactérias e plasmídeos, de acordo com o protocolo de texto. Configure uma cultura fresca inoculando uma alça cheia de células de cianobactérias, em 30 a 50 mililitros de meio BG11. Cultive a cultura à luz a 30 graus Celsius por dois a três dias, até um OD7500, igual a 0,2 a 0,6.Após a incubação, centrifugue um a dois mililitros da cultura a 2.300g por cinco minutos. Em seguida, depois de descartar o sobrenadante, use o meio BG11 para lavar os pellets uma vez, pipetando suavemente para ressuspender as células. Como o vórtice pode resultar na perda de pili, que são essenciais para a captação de DNA.Depois de peletizar as células novamente e remover o sobrenadante, adicione o meio BG11 a um volume final de 100 microlitros e transfira as células para um tubo inferior redondo de 14 mililitros. Em seguida, adicione 1 micrograma de plasmídeo A previamente preparado às células. E bata suavemente para misturar.Em seguida, coloque os tubos horizontalmente na incubadora a 30 graus Celsius e incube por quatro a seis horas. Após a incubação, espalhar alíquotas da mistura de ADN plasmidial de cultura de células em placas de ágar BG11 sem antibióticos. E incubar a 30 graus Celsius.Aproximadamente 24 horas depois, prepare uma solução de ágar 0,6%, em água contendo canamicina. E deixe esfriar até 42 graus Celsius. Em seguida, adicione 2,5 a três mililitros às bordas das placas de cultura e incline a placa, de modo que a solução forme uma camada superior de ágar uniforme na superfície.Incube as placas por aproximadamente sete dias para que as colônias sejam visíveis. Em seguida, divida uma placa de ágar BG11 mais canamicina em seis setores. E use um palito de ponta romba para riscar colônias individuais.Para realizar a PCR, para confirmar o nocaute marcado, transfira uma pequena quantidade de células para um tubo contendo 50 microlitros de água e aproximadamente 20 esferas de vidro de 425 a 600 micrômetros. Agite as células e grânulos a aproximadamente 2.000 rpm por cinco minutos, antes de girar a 15.700 g por cinco minutos. Em seguida, use cinco microlitros do sobrenadante para preparar reações de PCR de 50 microlitros com preliminares de DNA aderente.Para validar os mutantes, após projetar primers de acordo com o protocolo de texto, produto amplificado usando o seguinte programa e incluir um controle do tipo selvagem. Através de gelelektroforeses, verificamos o genótipo de transformantes knockout. Mostrando uma banda de aproximadamente quatro pares de kilobase e sem a banda do tipo selvagem.Consulte o protocolo de texto para obter mais detalhes. Se ainda estiver presente uma banda de tipo selvagem, repetir a tensão na placa fresca e repetir a PCR. Repita o processo de validação até que o mutante seja segregado e nenhuma banda de tipo selvagem seja observada na reação de PCR.Para uma cepa que mostra perfil mutante marcado, re-streak em uma placa nova para uso na geração de um nocaute não marcado. Para gerar mutantes de Synechocystis não marcados, estabeleça uma nova cultura do nocaute marcado inoculando a alça cheia de células em 30 a 50 mililitros de meio BG11. Cultive a cultura por dois a três dias até OD750, igual a 0,2 a 0,6.Centrifugue 10 mililitros da cultura a 2.300 g por cinco minutos e descarte o sobrenadante. Em seguida, usamos o meio BG11 para lavar suavemente as células. Depois de adicionar BG11 a um volume final de 200 microlitros e transferir as células para um tubo inferior redondo de 14 mililitros, adicione 1 micrograma de DNA de plasmídeo B às células e bata suavemente para misturar.Em seguida, coloque os tubos horizontalmente na incubadora e incube por quatro a seis horas. Após a incubação, adicione 1,8 mililitros de meio BG11 e incube as amostras por um total de quatro dias com agitação. Este é um tempo suficiente para permitir que a recombinação ocorra nas múltiplas cópias cromossômicas.Coloque alíquotas de 50, 10 e 1 microlitro da cultura transformada em placas de ágar BG11 mais 5% de sacarose e incube por aproximadamente sete dias para gerar colônias únicas. Em seguida, usando um palito de dente de ponta romba, ecloda de 30 a 50 colônias individuais em placas BG11 mais canamicina. Em seguida, aplique BG11 mais 5% de sacarose.Colônias que crescem em BG11 mais sacarose, mas não em placas com canamicina, são potenciais nocautes não marcados. As colônias que crescem em ambas as placas provavelmente são resistentes à sacarose devido a uma mutação no gene sacB. Seguindo o método de PCR, demonstrado anteriormente neste vídeo, verifique os nocautes não marcados, que produzirão uma banda de gel correspondente ao tamanho do tipo selvagem menos a região excluída.Se a cepa mostrar um perfil mutante não marcado, coloque-a novamente em ágar BG11 fresco sem antibióticos. Para armazenar as cepas a longo prazo, estabeleça uma nova cultura da cepa inoculando uma alça cheia de células em 30 a 50 mililitros de meio BG11. Cultive a cultura por três a quatro dias e OD750 igual a 0,4 a 0,7.Depois de usar BG11 para lavar as células uma vez, ressuspenda o pellet em aproximadamente dois mililitros de BG11. Adicione 0,8 mililitros das células concentradas a um tubo. Em seguida, adicione 0,2 mililitros de glicerol esterilizado com filtro a 80%.Para outro tubo, adicione 0,93 mililitros de células concentradas e 0,07 mililitros de DMSO. Armazene os dois tubos a 80 graus Celsius negativos. Para reviver as cepas, remova o tubo e use um palito de dente sem corte para raspar algumas células em uma placa de ágar sem antibióticos.Em seguida, use um laço estéril para listrar normalmente. Esta figura mostra exemplos de plasmídeos A e B usados para gerar mutantes de deleção. Em cada caso, as cinco regiões principais e três principais são aproximadamente 900 a 1.000 pares de bases.O plasmídeo B também pode conter um de genes entre as regiões flanqueadoras de cinco primos e três primos de aproximadamente um par de quilobases. Ou uma versão modificada da sequência do gene nativo. Após a transformação com o plasmídeo A, várias centenas de colônias aparecerão em uma placa após sete a 10 dias.Se os genes não são essenciais e os mutantes demonstram crescimento, semelhante à cepa do tipo selvagem, todos os cromossomos devem conter uma sequência inserida de cópia npt1 / sacB, conforme determinado por PCR. Se os genes não são essenciais e os mutantes crescem lentamente, então várias rodadas de re-streaking com concentrações crescentes de canamicina são necessárias para obter um mutante marcado segregado. Se, após a re-estria, um mutante marcado não for obtido, o gene provavelmente é essencial para a sobrevivência.A maioria das colônias individuais, obtidas a partir da transformação com plasmídeo B, será sensível à canamicina e resistente à sacarose. Como demonstrado aqui, a amplificação por PCR da região alvo nessas colônias mostra que quase 100% do perfil mutante não marcado. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em horas durante um período de seis semanas, se for executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar a técnica estéril. Após este procedimento, outros métodos, como medir a produção de oxigênio ou espectrometria de massa por cromatografia gasosa, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como medir taxas fotossintéticas ou produção de metabólitos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da genética de cianobactérias.Explorar os principais processos bioquímicos e fisiológicos neste filo e cepas de desenvolvimento para fins industriais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar nocautes não marcados em espécies de Synechococcus PCC6803.

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Research

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Biology

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