Name: Desenvolvimento de um modelo de fígado fibrótica induzida por etanol no peixe-zebra para estudar Progenitor mediada por células de regeneração de hepatócitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Aprenda a estabelecer um modelo de fígado fibrótico induzido por etanol em Danio rerio para estudar regeneração hepática. Este método permite triagens químicas econômicas e análise de células individuais in vivo.

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Este trabalho foi financiado em parte por doações do GTEC (2731336 e 1411318), o NIH (K01DK081351), ea NSF (1.354.837) para CHS Agradecemos Alem Giorgis para a leitura crítica do manuscrito.

Peixe-zebra foram levantadas e criados usando um protocolo padrão que atenda aos critérios dos Institutos Nacionais de Saúde e aprovado pelo Instituto de Tecnologia da Geórgia Institutional Animal Care e do Comitê Use. 1. Preparação de Soluções <ol><li> Prepare 20 L de água de ovo (intercambiável usado com &quot;médio embrião &#39;) para manter peixe-zebra embrionária / larval. Dissolver 1,5 g CaSO 4 e 6 g de sal do mar instantânea oceano em 250 ml de água destilada. Despeje em um garrafão cheio com 20 L de água destilada e agite. </li><li> Prepare 1 L (PTU) solução estoque-2-tioureia 1-fenil (20x). Dissolve-se 0,6 g de pó PTU em 1 L de água destilada. Adicionar 1 ml de solução de reserva por 20 ml de meio de embrião para uma concentração final de 0,003% como uma solução de trabalho. CUIDADO: PTU pode causar toxicidade sistémica após inalação ou exposição dérmica. Preparar e usar, de acordo com as diretrizes de manejo adequadas. </li><li> Prepare 1 L de acetato de 3-aminobemetanossulfonato (tricaina) solução estoque nzoate (20x). Dissolve-se 4 g tricaina pó em água destilada. Ajustar o pH a 7 por adição de tampão Tris 1 M (pH 9), e levar o volume final a 1 litro com água destilada. Alíquota para 50 ml e armazenar a -20 ° C. Descongelar antes de usar. CUIDADO: tricaina pode induzir uma perda de sensação. Preparar e usar, de acordo com as diretrizes de manejo adequadas. </li><li> Prepare 100 ml de solução de metronidazol larval (MTZ) trabalhando. Adicione solução fresca 15 MTZ mM por dissolução de 0,25 g do MTZ em pó 0,1% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) em 100 ml de meio de embrião. Dissolver MTZ pó completamente por agitação vigorosa. Faça solução MTZ fresco e utilizar folha de alumínio para evitar a degradação fotocatalítica de MTZ. CUIDADO: MTZ pode causar irritação. Preparar e usar, de acordo com as diretrizes de manejo adequadas. </li><li> Preparar solução de trabalho de 100 ml de etanol larvar / metronidazol (EtOH / MTZ). Faça solução MTZ fresco e utilizar folha de alumínio para evitar de fotocatalíticogradação da MTZ. Adicionar 1,5 ml de 100% de etanol em 100 ml de solução de MTZ para uma concentração final de 1,5% imediatamente antes da utilização. </li><li> Prepare 500 ml de solução de trabalho de adultos MTZ. Faça fresco solução a 10 MTZ mM por dissolução de 0,83 g MTZ pó em 0,1% DMSO em 500 ml de água do sistema. Dissolver MTZ pó completamente por agitação vigorosa. Faça solução MTZ fresco e utilizar folha de alumínio para evitar a degradação fotocatalítica de MTZ. </li><li> Preparar um tampão de L PEM. Dissolver 30,2 g tubulações, 0,74 g EGTA e 0,12 g MgSO4 em água destilada. Ajustar o pH a 7 com NaOH. Levar o volume final a 1 L com água destilada. </li></ol> 2. Preparação de larvas de peixe-zebra <ol><li> Configurar o acasalamento de [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15,17 peixe-zebra adulto com Tg (hand2: EGFP) PD24 13 adulto zebrafish em tanques de acasalamento. Use divisórias para realizar o acasalamento cronometrado. </li><li> Remover o divider na manhã seguinte e permitir que os peixes para acasalar sem interrupções. embriões colheita 2 horas mais tarde por esforço água do sistema e transferir os embriões em 100 mm placas de Petri com meio embrião. </li><li> Mantenha há mais de 100 embriões por placa de Petri. Sob um microscópio estereoscópico, remover os ovos não fertilizados usando uma pipeta de vidro. Cresça embriões a 28 ° C e adiciona-feniltioureia (PTU) para uma concentração final de 0,003% após 10 horas pós-fertilização (HPF) para inibir o desenvolvimento de pigmentos. </li></ol> 3. O etanol, Tratamento Metronidazol e fígado Regeneração na larval Zebrafish <ol><li> Preparar a solução de EtOH fresco por adição de etanol no meio de embrião para uma concentração final de 1,5%. Não adicione PTU. </li><li> Tratar os embriões com uma solução de etanol a 20 ml por placa de Petri de 56-80 HPF. Cobrir placas de Petri com filme plástico para evitar a evaporação do etanol. </li><li> Classificar para fora [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11 </sup&gt;; Tg (hand2: EGFP) PD24] larvas com tamanho semelhante fígado, como determinado por expressão da PCP, a 80 HPF. Não use tricaina ao classificar as larvas tratadas com EtOH, porque isso irá causar elevada taxa de mortalidade, com posterior tratamento EtOH / MTZ. Manter larvas classificada a uma densidade de 30 embriões por placa de Petri. </li><li> Prepare fresco mM MTZ 15 em meio embrião em 0,1% DMSO. Adicionar uma quantidade apropriada de EtOH em solução MTZ para fazer uma concentração final de 1,5%. Incubar larvas em 20 ml de solução de EtOH / MTZ por placa de Petri durante 24 h a 28 ° C. Cobrir placas de Petri com filme plástico para manter a concentração EtOH e com folha de alumínio para proteger da luz. </li><li> No final do tratamento, remover a solução de EtOH / MTZ através da transferência de larvas para novas placas de Petri com meio fresco embrião. Lavar as larvas 3 vezes com meio embrião e mantê-los em 20 ml de meio de embrião sem PTU. </li><li> Para resolver as larvas com a ablação quase completa dos hepatócitos, observar fluorescênciasob um microscópio de epifluorescência, com o filtro de PCP com uma ampliação de 80X. Resultados da ablação com sucesso em um mínimo de fluorescência PCP no fígado e volume do fígado reduzida significativamente. </li><li> Para evitar a morte das larvas tratadas MTZ EtOH /, não use tricaina para classificação. Corrigir as larvas para a imunocoloração (consulte a secção 5) ou manter larvas classificada em placas de Petri a 28 ° C para posteriores análises. </li></ol> 4. Telas químicos em tratados MTZ EtOH / larval Zebrafish <ol><li> Trazer as placas de 96 poços contendo 10 mM stocks químicos em DMSO (consulte a lista de materiais para obter detalhes sobre as bibliotecas químicas comerciais) dos -80 ° C congelador. Cubra com papel alumínio para evitar a degradação fotocatalítica de produtos químicos. Descongelar as soluções estoque em temperatura ambiente com agitação suave. </li><li> Prepare soluções químicas por diluição de soluções de estoque 10 mM com meio embrião para uma concentração final de 50 uM (em placas de 96 poços: s inicialcreen; em tubos de 1,5 ml: reteste). larvas de controlo foram tratadas com concentrações iguais de DMSO em meio de embrião. </li><li> Transferência das larvas com ablação completa ou quase completa de hepatócitos, os quais foram tratados com 1,5% de EtOH / MTZ 15 mM e classificadas como acima mencionado, quer para 96 ​​poços (tela) ou 24 poços (reteste) placas pré-cheio com meio de embrião a uma densidade de 5 larvas por poço. Use poços duplicados para cada produto químico. </li><li> Remover o meio e adicionar embrião, quer 250 ul (placas de 96 cavidades) ou 500 ul (placas de 24 poços) soluções químicas a cada poço. Cubra as placas com folha de alumínio e tratamento de larvas por 50 horas a 28 ° C. Inspecione larvas de imersão química diária e remover qualquer larvas mortas em poços individuais. </li><li> No final do tratamento químico, observar o número e / ou a intensidade de hepatócitos que expressam PCP sob um microscópio de epifluorescência, com o filtro de PCP com uma ampliação de 80X. Fotografia ao vivo mostrando larvas reforçada ou reduzirnúmero d e / ou intensidade de hepatócitos expressando PCP com uma câmera digital para registros. </li><li> Preserve larvas por fixação em formol para a imagem latente confocal como descrito no capítulo 5. </li><li> Para testar novamente os produtos químicos que facilitam a regeneração de hepatócitos no ecrã inicial, examinar a sua potência em concentrações mais elevadas e mais baixas para encontrar a concentração mais eficaz com os procedimentos descritos no 4,1-4,5 ( &#39;reanálise&#39;). </li></ol> 5. larval Zebrafish Fixation, imunocoloração e Imagem Confocal <ol><li> Anestesiar larvas adicionando tricaina a uma concentração final de 0,02%. Transferir 10-15 larvas para um tubo de 1,5 ml e lava-se uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Remover PBS e adicionar 1 mL de 2% preparada de fresco em tampão PEM formaldeído para fixar O / N a 4 ° C. CUIDADO: O formaldeído provoca irritação e é conhecido por ser um carcinogéneo humano. Pega em um exaustor química. </li><li> Descartar solução de fixação adequadamente e, em seguida, WAsh 3 vezes com PBS à temperatura ambiente. larvas fixas podem ser mantidos em PBS a 4 ° C durante até vários dias. Prosseguir para a próxima etapa dá prontamente melhores resultados de positividade. </li><li> Remova cuidadosamente gema e pele que cobre a área do fígado usando um # 55 fórceps sob microscópio estereoscópico. </li><li> Permeabilizar e larvas de bloco em tampão de bloqueio (4% de albumina de soro bovino e 0,3% de Triton X-100 em PBS) O / N a 4 ° C. </li><li> Incubar com anticorpo de coelho anti-colagénio I a uma diluição de 1: 100 em tampão de bloco S / N a 4 ° C. Lavar 5 vezes durante 15 minutos cada, com tampão de lavagem (0,3% de Triton X-100 em PBS). </li><li> Incubar com AlexaFluor anticorpo anti-coelho de burro conjugado 647, a uma diluição de 1: 200 em tampão de bloco S / N a 4 ° C. Lavar 5 vezes durante 15 minutos cada, com tampão de lavagem. Em seguida, lavar uma vez com PBS. </li><li> Gentilmente transferir larvas de lâminas de vidro usando uma pipeta de vidro, e as larvas fixo oriente com o lado lateral esquerdo virado para cima. Retire o excesso de PBS utilizando Kimwipes. Adicionar uma gota de meio de montagemE tampa de vidro selo com unha polonês. Realização de imagem confocal imediatamente é muito recomendada. </li><li> Use um sistema confocal equipado com uma lente de 40X / 1.3 petróleo para capturar imagens. Use a força do laser em 20-50%. Capturar imagens da pilha Z em intervalos de 1 mm. </li></ol> 6. Preparação de Zebrafish Adulto <ol><li> Configurar o acasalamento de [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15,17 peixe-zebra adulto em tanques de acasalamento. Colheita de embriões na manhã seguinte por esforço água do sistema e transferir os embriões em placas de Petri de 100 mm com meio embrião. </li><li> Mantenha há mais de 100 embriões por placa de Petri. Sob um microscópio estereoscópico, remover os ovos não fertilizados usando uma pipeta de vidro. Cresça embriões a 28 ° C e adicionar o PTU para uma concentração final de 0,003% após 10 HPF para inibir o desenvolvimento de pigmentos. </li><li> Às 4 dpf, use tricaina para anestesiar as larvas e resolver [Tg (fabp10a: CFP-NTR)GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] larvas. Lave a tricaina mudando para embriões médio várias vezes frescos. Permitir larvas para recuperar a 28 ° C até atingirem a taxa normal do coração de 120-180 batimentos por minuto 18. </li><li> Levante larvas classificada para 6-12 meses de idade com base no procedimento padrão de 19. </li></ol> 7. Etanol, Tratamento Metronidazol, e Liver Regeneração Zebrafish Adulto <ol><li> Transferir 6-12 meses de idade [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] adulto peixe-zebra para tanques de acasalamento com uma rede. Manter o peixe a uma densidade de não mais de 10 peixes por tanque. </li><li> Preparar a solução de EtOH fresco por adição de EtOH em água do sistema a uma concentração final de 1%. Trate peixes adultos com 500 ml solução EtOH em cada tanque e mantê-los em um 28 ° C incubadora. </li><li> peixes transferência de adultos para solução EtOH fresco diariamente, descarte prop peixes mortosErly como um risco biológico. Continuamente tratar os animais durante 72 horas antes do tratamento MTZ. </li><li> Preparar a solução MTZ 10 mM fresco na água do sistema em 0,1% DMSO. Pré-aquecer a solução de MTZ em uma incubadora de 28 ° C. Tratar peixe com 500 ml de solução de MTZ em 1 L tanque de cruzamento, durante 8 h a 28 ° C, protegido da luz utilizando folha de alumínio. </li><li> Observe hora em hora durante o tratamento e remover os peixes mortos imediatamente. Descarte peixes mortos adequadamente como um risco biológico. No final do tratamento MTZ, lavar a MTZ através da transferência de animais para água do sistema fresco duas vezes. </li><li> Permitir que os animais recuperar e mantê-las em uma incubadora a 28 ° C. Alimentar e transferência de peixe à água sistema de fresco diariamente até o ponto de tempo para análise. </li></ol> 8. Zebrafish Adulto fígado Fixation, imunocoloração e Imagem Confocal <ol><li> Anestesiar os peixes adultos com 0,02% tricaina e eutanásia em água de gelo durante 15 min. Seque a peixe em uma toalha de papel e coloque-o sobre um tapete de dissecação. </li><li> Expor órgãos gastrointestinais, removendo a pele e os músculos, como descrito anteriormente 20. Utilize uma tesoura para cortar a pele e o músculo subjacente ao longo da barriga da barbatana anal para o opérculo, e, em seguida, posteriormente ao longo do lado do peixe de volta à barbatana anal. </li><li> Coloque o peixe num tubo cónico de 15 mL e lavar uma vez com PBS. Remover PBS e adicionar 4 ml de 2% preparada de fresco em tampão PEM formaldeído para fixar O / N a 4 ° C. </li><li> Descartar solução de fixação correctamente, e lavar 3 vezes com PBS à temperatura ambiente. As amostras fixadas podem ser mantidos em PBS a 4 ° C durante vários dias. Prosseguir para a próxima etapa imediatamente dá melhores resultados de positividade. </li><li> Dissecar todo o intestino com o fígado a partir da cavidade do corpo do peixe, por corte do esófago. Incorporar os órgãos gastrointestinais com 4% baixo ponto de fusão de agarose em um molde de corte. </li><li> Usar um vibratome para cortar amostras em secções transversais em intervalos de 50 mm em PBS gelado, a partir da extremidade anterior. transferir secções a placa de 6 poços com PBS usando um pincel # 1. </li><li> Permeabilizar e secções de bloco em bloco de buffer o / n a 4 ° C. </li><li> Incubar com anticorpo de coelho anti-colagénio I a uma diluição de 1: 100 em tampão de bloco S / N a 4 ° C. Lavar 5 vezes, 15 min cada, com tampão de lavagem. </li><li> Incubar com AlexaFluor anticorpo anti-coelho de burro conjugado 647, a uma diluição de 1: 200 em tampão de bloco S / N a 4 ° C. Lavar 5 vezes, 15 min cada, com tampão de lavagem e uma vez com PBS. </li><li> Gentilmente transferir seções para lâminas de vidro usando um pincel # 1. Retire o excesso de PBS utilizando Kimwipes, adicione uma gota de meio de montagem e tampa de vidro selo com unha polonês. Realização de imagem confocal imediatamente é altamente recomendado. </li><li> Use um sistema confocal equipado com uma lente de 40X / 1.3 petróleo para capturar imagens. Use a força do laser em 20-50%. Capturar imagens da pilha Z em intervalos de 1 mm. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Observamos mediada por HPC regeneração de hepatócitos no fígado recuperando-tratada MTZ EtOH /, sugerindo que, mesmo na presença de uma quantidade substancial de proteínas de ECM, incluindo o tipo I fibrilar colagénio, os HPCs conservam a sua competência para regenerar como hepatócitos. A única MTZ-tratamento não aumentar a deposição das proteínas da MEC significativamente, ao passo que o único tratamento EtOH não induziu activação de HPC 15. Ao utilizar o tratamento combinado de EtOH / MTZ, fomos capazes de ...

Apesar da notável capacidade de regeneração de hepatócitos 1, que são o tipo de célula parenquimatosa grande do fígado, insuficiência hepática crónica prejudica essa capacidade, levando a célula progenitora hepática (HPC) regeneração dependente 2. Lesão hepática crônica é essencialmente derivada de abuso de álcool, o vírus da hepatite C crônica (HCV) 3 e doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) 4. Ele conduz a fibrose do fígado sustentada, que está associada com a acumulação de proteínas da matriz extracelular (ECM). Persistindo acumulação ECM distorce a arquitetura hepática intacta através da formação de um tecido fibroso de cicatriz 5, posteriormente, resultando em cirrose com alta morbidade e mortalidade. Muitas tentativas têm sido feitas para reduzir a resposta fibrótica, principalmente, concentrando-se em inibir citocinas profibrogenic e miofibroblastos activados 6. Este último é derivado principalmente de células estreladas hepáticas (HSCs), as células não-parenquimatosas hepáticas responsáveis ​​principais para a formação de cicatriz hepática 4. No entanto, as terapias de regeneração que estimulam fontes celulares endógenos, incluindo HPCs para regenerar hepatócitos na presença de insultos fibrogênicas sustentados aguardam uma investigação mais aprofundada. Muitos modelos experimentais de fibrose hepática foram descritos em mamíferos. Injecção repetida de tetracloreto de carbono (CCl 4) tem sido amplamente utilizado para induzir a fibrose do fígado em modelos de rato e de murino 7. Quando combinado com uma dieta de elevado teor de gordura (HF), álcool levou a uma regulação positiva da expressão do gene substancial profibrogenic e fibrose hepática 8. Enquanto esteatose (acumulação de lípidos) resulta da exposição aguda do álcool, faz o fígado suscetível a lesões hepáticas mais graves 9. O peixe-zebra, Danio rerio, tem emergido como um inestimável sistema modelo para o estudo de vertebrados regeneração. Emboraoutros vertebrados inferiores, tais como tritões e axolotls têm uma notável capacidade de regeneração, o peixe-zebra tem vantagens sobre outros sistemas modelo em relação às estratégias de manipulação genética e visualização necessários para manipular potencial regenerativo fatores 10. O peixe-zebra também representa um modelo atractivo para estudar vertebrado doença hepática alcoólica (ALD) pela simples adição de etanol (EtOH) para a água. A exposição aguda EtOH para peixe-zebra larval e adulto causada esteatose hepática 11-13. Quando peixe-zebra adulto recebeu a exposição EtOH estendida, deposição de colágeno foi observada com a regulação positiva de genes relacionados à fibrose 14. No entanto, existe uma necessidade para o desenvolvimento de modelos para estudar a regeneração do fígado em resposta a um estímulo de EtOH como fibrogênica. Recentemente, desenvolvemos um modelo de fígado fibrótica induzida por etanol no peixe-zebra 15. Nós combinados um sistema de ablação genética específicos de hepatócitos com o tratamento de EtOH em larvas e adult de peixe-zebra. Geramos duas linhagens transgênicas, Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 e Tg (fabp10a: mCherry-NTR) gt2, no qual E.coli nitro-redutase (NTR) são fundidos ao ciano e proteína fluorescente mCherry, respectivamente, sob o controle do ácido graxo específico do hepatócito de ligação 10a proteína, fígado básico (fabp10a) promotor. Neste sistema, NTR converte um pró-f ármaco não tóxico metronidazol (MTZ) num ADN agente de reticulação inter-cadeia 16, induzir a morte explícita dos hepatócitos. Utilizando este modelo, foi demonstrado que uma população de células hepáticas, que respondem à sinalização de Notch, convertido em hepatócitos na quase ausência de hepatócitos e o excesso de ECM. Nós designado essas células como HPCs. Além disso, através de telas químicas, identificamos pequenas ativadores de moléculas de sinalização Wnt e inibidores da sinalização Notch que aumentam a regeneração de hepatócitos no fígado fibrótico. Therefore, o nosso modelo de fígado fibrótico no peixe-zebra representa um sistema de triagem química excelente em comparação com cultura- celular ou sistema de triagem de mamíferos-based. É um sistema in vivo, com custo significativo e benefícios de economia de tempo. Aqui nós descrevemos os procedimentos detalhados para o estabelecimento de um modelo de fígado fibrótica induzida por etanol e para a realização de telas químicos usando este modelo no peixe-zebra. Além disso, foram realizadas análises de tempo-curso para investigar a forma como a regeneração de hepatócitos no fígado ocorre fibrótica. Este protocolo irá fornecer uma ferramenta valiosa para estudar os mecanismos e estratégias de reforço de hepatócitos regeneração no fígado fibrótico.

<table><tbody><tr><td>Sulfato de cálcio hemi-hidratado (CaSO4)</td><td>Acros</td><td>AC385355000</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio (MgSO4)</td><td>EMD</td><td>MX0075</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 1,4-piperazinadietanossulfônico (PIPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)- N,N,N&prime;,N&prime; -ácido tetracético (EGTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 prova</td></tr><tr><td>de formaldeído</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazol (MTZ)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M3761</td><td></td></tr><tr><td>1-fenil-2-tioureia (PTU)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>éster etílico de ácido 3-amino benzóico (Tricocaína)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Comprimido de solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Amresco</td><td>E404</td><td>Dissolva um comprimido com 100 ml de água destilada</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Baixo ponto de fusão agarose&nbsp;</td>Biblioteca de Compostos de Sinalização de Células-Tronco <td>Amresco</td><td>BP165</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Selleck Chemicals</td><td>L2100</td><td>10&nbsp; Estoque mM na Biblioteca DMSO</td></tr><tr><td>ActiProbe-1K</td><td>Timtec</td><td>ActiProbe-1K</td><td>10&nbsp; Estoque mM em DMSO</td></tr><tr><td>SB 415286</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2729</td><td>Dissolver com DMSO para 10&nbsp; mM</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2924</td><td>Dissolve com DMSO para 10&nbsp; Anticorpo</td></tr><tr><td>anti-colágeno I</td> mM <td>Abcam</td><td>ab23730</td><td>Use a 1:100 para imunocoloração, reage com peixes</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>Sondas moleculares</td><td>A31573</td><td>Use a 1:200 para imunocoloração Meios de</td></tr><tr><td>montagem (Vectorshield)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 100 mm</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>24 poços placa</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>Dumont #55</td></tr><tr><td>Lâmina de vidro</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75x25 mm</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura</td><td>VWR</td><td>48366-045</td><td>18 mm</td></tr><tr><td>Filme plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>22305654</td><td></td></tr><tr><td>Folha de alumínio</td><td>Fisher Scientific</td><td>1213100</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Vibrotome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de epifluorescência</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocol</td>, <td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento de um modelo de fígado fibrótica induzida por etanol no peixe-zebra para estudar progenitor mediada por células de regeneração de hepatócitos

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

A fibrose hepática sustentada com continuação do acúmulo de proteína da matriz extracelular (MEC) resulta na perda da competência celular do fígado, levando à cirrose com disfunção hepatocelular. Entre vários insultos hepáticos, o abuso de álcool pode levar a problemas de saúde significativos, incluindo insuficiência hepática e carcinoma hepatocelular. No entanto, a identidade de fontes celulares endógenas que regeneram hepatócitos em resposta ao álcool não foi devidamente investigada. Além disso, poucos estudos modelaram efetivamente a regeneração de hepatócitos após lesões induzidas por álcool. Recentemente, relatamos o estabelecimento de um modelo de fígado fibrótico induzido por etanol (EtOH) em peixe-zebra no qual células progenitoras hepáticas (HPCs) deram origem a hepatócitos após a perda quase completa de hepatócitos na presença de estímulo fibrogênico. Além disso, por meio de telas químicas usando esse modelo, identificamos várias pequenas moléculas que aumentam a regeneração de hepatócitos. Aqui descrevemos em detalhes os procedimentos para desenvolver um modelo de fígado fibrótico induzido por EtOH e realizar triagens químicas usando este modelo em peixe-zebra. Este protocolo será uma ferramenta crítica para delinear os mecanismos moleculares e celulares de como os hepatócitos se regeneram no fígado fibrótico. Além disso, esses métodos facilitarão a descoberta potencial de novas estratégias terapêuticas para doença hepática crônica in vivo.

A Figura 1 mostra o desenvolvimento de um modelo de fígado de fibrose induzida por etanol no peixe-zebra larval. Para otimizar um protocolo para expor larvas do peixe para EtOH, primeiro avaliou a toxicidade EtOH. 2,5 dias pós-fertilização (DPF) larvas foram expostas a concentração de EtOH a 1%, 1,5%, ou 2% durante 24 horas seguido por um tratamento de 24 horas de EtOH / MTZ concomitante. A exposição a 2% de EtOH causaram elevada mortalidade, enquanto quase todas as larv...

A fibrose sustentada com deposição de proteínas excessivas da matriz extracelular leva à cirrose. O abuso de álcool é uma das principais causas de doença hepática grave. Estabelecemos um modelo de fígado fibrótico de peixe-zebra induzido por etanol para estudar os mecanismos e estratégias de promoção da regeneração de hepatócitos após lesão induzida por álcool.

Desenvolvimento de um modelo de fígado fibrótica induzida por etanol no peixe-zebra para estudar Progenitor mediada por células de regeneração de hepatócitos

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

O objetivo geral deste protocolo é estabelecer um modelo de fígado fibroso induzido por etanol em peixe-zebra e realizar triagens químicas utilizando este modelo. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de regeneração hepática, como os mecanismos moleculares e celulares de como os hepatócitos se regeneram no fígado fibroso.A principal vantagem desta técnica é que ela é economicamente eficaz e poupa tempo na triagem química in vivo. Além disso, uma análise detalhada de curso temporal pode ser realizada por meio da visualização de uma única célula. Demonstrarão o procedimento Mianbo Huang, pós-doutorando, e Jin Xu, aluno de pós-graduação do laboratório.Após preparar os reagentes de acordo com o protocolo descrito no texto, monte tanques de acasalamento com divisórias utilizando peixes-zebra transgênicos adultos contendo a proteína de ligação a ácidos graxos 10a:CFP-NTR com Tp1:mCherry e peixes-zebra Tg(hand2:EGFP). Na manhã seguinte, duas horas após a remoção das divisórias, colete os embriões filtrando a água do sistema e transfira os embriões para placas de Petri de 100 milímetros contendo meio embrionário. A 56 horas pós-fertilização, ou HPF, adicione 1,5 por cento de etanol aos embriões.Use filme plástico para cobrir as placas e evitar a evaporação do etanol. Incube então a 28 graus Celsius por 24 horas. Prepare MTZ fresco a 15 milimolar e meio de embrião com 0,1 por cento de DMSO e adicione etanol até uma concentração final de 1,5 por cento.Em seguida, aos 80 HPF, trate os embriões classificados com 20 mililitros de solução de etanol MTZ por placa de petri. Utilize filme plástico para cobrir as placas e evitar a evaporação do etanol e cubra com papel alumínio para proteger da luz. Em seguida, incube a 28 graus Celsius por 24 horas.No dia seguinte, observe os embriões em um microscópio epifluorescente utilizando um filtro CFP e uma ampliação de 80x para separar as larvas com ablação quase completa de hepatócitos. Para realizar triagens químicas, retire as placas de 96 poços contendo estoques químicos de dez milimolares em DMSO do congelador a menos 80 graus. Utilize folha de alumínio para cobrir as placas e evitar a degradação fotocatalítica dos produtos químicos e descongele com agitação suave à temperatura ambiente.Em tubos de 1,5 mililitro, prepare soluções químicas diluindo cinco microlitros de soluções estoque de dez milimolares com um mililitro de meio para embrião, obtendo uma concentração final de 50 micromolares. Em seguida, transfira cinco larvas por poço, com ablação de hepatócitos quase completa, para placas de 24 poços contendo meio para embrião. Depois, remova o meio para embrião e adicione 500 microlitros das soluções químicas a cada poço.Cubra as placas com papel alumínio e incube as larvas a 28 graus Celsius por 50 horas. Após a incubação, observe o número e/ou intensidade de hepatócitos que expressam CFP sob um microscópio epifluorescente com aumento de 80x. Capture imagens de larvas vivas com números aumentados ou reduzidos e/ou intensidade de hepatócitos que expressam CFP.Realize acasalamentos de peixes-zebra transgênicos contendo a proteína de ligação a ácidos graxos 10a:CFP-NTR com TP1:mCherry e criem as larvas selecionadas até atingirem seis a doze meses de idade. Utilize uma rede para transferir os peixes-zebra transgênicos adultos para tanques de acasalamento. Prepare etanol a um por cento em água do sistema e, em seguida, utilize 500 mililitros da solução para substituir a água do sistema nos tanques de acasalamento.Incube os tanques a 28 graus Celsius por 72 horas, transferindo os peixes para solução fresca de etanol e removendo diariamente qualquer peixe morto durante a incubação. Prepare uma solução fresca de MTZ a dez milimolar em água do sistema com 0,1 por cento de DMSO, em seguida adicione 500 mililitros da solução de MTZ pré-aquecida aos peixes em tanques de acasalamento de um litro. Utilize papel alumínio para cobrir os tanques.Incubar a 28 graus Celsius por oito horas e analisar de acordo com o protocolo descrito no texto. Após anestesiar de acordo com o protocolo descrito no texto, expor os órgãos gastrointestinais usando tesoura para cortar a pele e o músculo subjacente ao longo do ventre, desde a nadadeira anal até o opérculo. Em seguida, cortar posteriormente ao longo do lado do dorso do peixe até a nadadeira anal.Coloque o peixe em um tubo cônico de quinze mililitros e use PBS para lavar uma vez. Em seguida, remova o PBS e adicione quatro mililitros de formaldeído a três por cento recém-preparado em tampão PEM. Incube a quatro graus Celsius durante a noite para fixar o peixe.No dia seguinte, após lavar as amostras de acordo com o protocolo descrito no texto, corte o esôfago para dissecar todo o intestino com o fígado da cavidade corporal. Em seguida, coloque os órgãos gastrointestinais em um molde para inclusão e use agarose de baixo ponto de fusão a quatro por cento para embutir o tecido. Depois, corte o bloco em formato trapezoidal e cole-o à base.Em seguida, utilize um vibrátomo e, partindo da extremidade interna do tecido, corte amostras em seções transversais a intervalos de cinquenta micrômetros em PBS gelado. Use um pincel número um para transferir as seções para uma placa de seis poços contendo PBS. Após a imunomarcação das seções de acordo com o protocolo descrito no texto, utilize um pincel número um para transferir suavemente as seções para lâminas de vidro.Use papel-toalha para remover o excesso de PBS antes de adicionar uma gota de meio de montagem e uma lamínula. Em seguida, use esmalte para unhas para selar a lamínula. Por fim, utilizando um sistema confocal equipado com uma objetiva de óleo 40x 1.3 NA, capture imagens em Z-Stack com intensidade de 20 a 50 por cento e intervalos de um microamperímetro.Esta figura mostra que as larvas tratadas com MTZ e etanol desenvolvem curvatura ascendente do tronco e da cauda, edema pericárdico e falha na inflação da bexiga natatória. Como visto aqui, os fígados controle tratados com DMSO não mostraram deposição de colágeno tipo um fibrilar. Já os fígados tratados com MTZ e etanol exibiram acúmulo elevado de colágeno tipo um nas horas 25 e 50 após a ablatação.Além disso, em comparação com fígados controle tratados com DMSO, as CSH aumentaram em número e adotaram uma forma semelhante à de um miofibroblasto, sem processos citoplasmáticos, nos fígados regenerativos tratados com etanol e MTZ. Esta figura mostra o desenvolvimento de um modelo de fígado fibrotico induzido por etanol em peixes-zebra adultos tratados com um por cento de etanol seguido por MTZ. A partir dessas análises de curso temporal, observou-se deposição significativamente elevada de colágeno tipo um nos fígados regenerativos tratados com etanol e MTZ aos dois, três e quatro dias após a ablatação, em comparação com os fígados tratados com DMSO.No presente experimento de triagem química, hepatócitos foram ablatados na presença de 1,5 por cento de etanol e 15 milimolares de MTZ. Em seguida, as larvas foram expostas a produtos químicos por 50 horas. Vários agonistas da via Wnt, como inibidores da glicogênio sintase quinase-3 e um ativador da via Wnt, promoveram a regeneração de hepatócitos em comparação com DMSO.Esses dados sugerem que este modelo fibrotico sustentado fornece uma ferramenta inestimável para descobrir moléculas pequenas que potencializam a regeneração de hepatócitos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma semana, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de obter uma ablação quase completa de hepatócitos e de manter a concentração de etanol durante todo o procedimento.Após este procedimento, a eficiência dos compostos químicos identificados pode ser testada em modelos de lesão hepática de mamíferos. Após seu desenvolvimento, esta técnica pode abrir novas perspectivas no campo da terapia de regeneração celular, explorando a descoberta de novas estratégias terapêuticas para pacientes com insuficiência hepática crônica. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como desenvolver um modelo de fígado fibrotico induzido por etanol em Zebrafish e de como realizar triagens químicas.Não se esqueça de que trabalhar com formaldeído pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso de luvas e o manuseio do reagente em uma capela de exaustão química, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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