Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido macerado para visualizar a matriz extracelular

O objetivo geral deste método é visualizar a estrutura da matriz cardíaca na ausência de células ou outros materiais não matriciais. Este método pode responder a questões-chave no campo da fibrose, especialmente como as diferenças no conteúdo da matriz podem afetar a organização da matriz e como essas alterações podem afetar diferentes cardiomiopatias ou outras doenças fibróticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma visão qualitativa da matriz que pode ser usada para aumentar as medidas quantitativas.

O Dr. Galindo e o Dr. Sawyer tiveram a ideia de usar essa técnica depois de descobrirem que o tratamento regular de suínos pós-infarto apresentava alterações na expressão gênica semelhantes às mudanças no conteúdo da matriz após o tratamento. Indivíduos novos neste método podem ter dificuldades se não tiverem experiência anterior em preparação de amostras de SEM, devido às habilidades motoras finas necessárias. A amostra de tecido deve ser grande o suficiente para ser facilmente vista e armazenada em solução de glutaraldeído a quatro por cento a quatro graus Celsius.

Retire o lenço do armazenamento refrigerado e enxágue-o em água destilada. Em seguida, mergulhe o tecido em uma solução de hidróxido de sódio a 10%, feita fresca a partir de pellets em água. Certifique-se de tomar as devidas precauções.

Mantenha o tecido na solução de hidróxido de sódio por seis a 10 dias em temperatura ambiente. Prossiga quando a cor do tecido ficar esbranquiçada ou branca. Em seguida, enxágue o tecido com água destilada até que fique transparente.

Em seguida, coloque luvas e mergulhe o tecido em ácido tânico a um por cento por quatro horas em temperatura ambiente. Após o banho de ácido tânico, enxágue o tecido em água destilada durante a noite. Na preparação, em uma capela usando luvas, faça uma solução estoque 0,2 molar de tampão cacodilato de sódio e uma solução estoque aquosa de tetróxido de ósmio a dois por cento.

Use uma proteção contra respingos, pois o tetróxido de ósmio é um risco grave de inalação. Agora, faça uma diluição molar de 0,1 do tampão de cacodilato de sódio e incube o tecido nele por cinco minutos com agitação suave. Troque o tampão duas vezes para lavar o tecido um total de três vezes com cacodilato de sódio.

Em seguida, faça uma mistura individual do cacodilato de sódio e do tetróxido de ósmio. Incube o tecido na nova mistura em um rotador por uma hora. Mais tarde, retorne o tecido ao cacodilato de sódio 0,1 molar e incube-o com agitação suave por cinco minutos.

Troque esta solução de banho duas vezes ao longo de 15 minutos. Em seguida, desidrate o tecido usando uma série de banhos de etanol com concentrações crescentes. Deixe o tecido de molho por 15 minutos em cada banho com agitação suave.

Em seguida, transfira o tecido e a solução para uma placa de Petri rasa cheia de etanol 100%. Em seguida, com cuidado, segure duas lâminas de barbear muito afiadas, de modo que as partes planas dos lados fiquem em contato uma com a outra e as arestas de corte se cruzem para formar dois lados de um triângulo equilátero acima da amostra. Agora, use sua mão dominante para colocar a segunda lâmina na extremidade esquerda da amostra e corte para a direita.

Assim, deslize as lâminas umas contra as outras em direções opostas para fazer um único corte suave com o mínimo de distorção ou força de rasgo. O objetivo é expor a maior área de superfície possível sem danificar a amostra. Repita o processo até que seções transversais satisfatórias suficientes sejam preparadas para exame por SEM.

Usando uma espátula ou pinça, transfira o tecido para o suporte da amostra do CPD, mantendo o tecido imerso em 100% de etanol. O tecido não pode ser exposto ao ar por mais de alguns segundos. Use o CPD para substituir o etanol por dióxido de carbono líquido e execute o ciclo de secagem conforme indicado pelo fabricante.

Em seguida, prepare um esboço de amostra de MEV para cada amostra. Cole uma aba adesiva de carbono na superfície superior do topo de alumínio. Sob um estereoscópio, cole cuidadosamente a amostra à aba adesiva com a superfície da seção transversal de interesse voltada para cima, longe da aba e ao máximo plana com a superfície do topo.

Não sonde ou toque na superfície de interesse. Para os espécimes menores e mais difíceis, quebre o bastão aplicador de madeira para usar como espátula. Além disso, trabalhe sobre um grande pedaço de papel de filtro para evitar a perda de uma amostra caída.

Para melhorar a aderência, use um aplicador quebrado para fazer um pincel cônico e aplique tinta prateada ou carbono na base e nas laterais da amostra. Estenda uma linha muito fina de tinta até uma borda da superfície de interesse. Isso fará com que um caminho de carga da superfície de interesse para o solo.

Em seguida, aplique duas ou três pequenas pinceladas de tinta ao redor do perímetro da aba de carbono para fornecer um caminho condutor da superfície da aba até o toco de metal. Isso funciona como o solo. Deixe a amostra de lado e deixe a tinta condutora secar por duas horas.

Depois de seco, opere um revestidor por pulverização catódica para aplicar uma camada relativamente pesada de ouro, paládio, liga ou ouro na amostra. Um revestimento de 30 a 40 nanômetros de espessura é desejado. Realize a microscopia eletrônica de varredura em uma tensão de aceleração relativamente baixa para minimizar os problemas associados à baixa dissipação de carga na amostra.

Use o modo de pressão variável, se estiver disponível. Primeiro, melhore a distância de trabalho para fornecer profundidade de campo suficiente para focar nas fibras na dimensão Z. Para fazer isso, abra a guia Navegação no canto superior direito.

Em seguida, acesse a guia Coordenadas no menu do palco. Nele, insira um valor maior para a coordenada Z, como 20 milímetros. Por fim, pressione a guia Ir para para executar a alteração.

Em seguida, posicione a superfície de interesse ortogonalmente ao feixe de elétrons. Clique e segure o botão direito do mouse e, em seguida, deslize-o para a esquerda ou direita para focar a amostra perto da periferia do plano de superfície preparado de interesse. Observe a distância de trabalho focada.

Em seguida, usando o joystick manual da interface do usuário, mova a visualização para a borda oposta e repita o método de foco. Se a distância de trabalho mudou, incline a amostra para obter uma concordância aproximada em ambos os locais. Use a guia Coordenadas do menu Palco e insira um valor de inclinação na coordenada T.

Agora, gire a amostra 90 graus inserindo esse valor no campo de coordenadas R. Em seguida, repita o processo de inclinação até que todas as posições estejam focadas aproximadamente na mesma distância de trabalho. A técnica descrita foi aplicada a tecidos cardíacos de um doador de transplante cardíaco humano não utilizado.

A matriz cardíaca humana é uma trama intrincada de proteínas reticuladas que tem um padrão semelhante a um favo de mel em uma seção transversal. Cada estrutura de favo de mel tem aproximadamente 40 mícrons de largura, normalmente contornando um único miócito. Quando conectados por discos intercalados, vários miócitos cardiovasculares podem ser visualizados como uma haste correndo longitudinalmente através de uma forma semelhante a um túnel.

Além de fornecer informações estruturais, um MEV de tecidos descelularizados pode permitir uma avaliação qualitativa significativa em resposta a lesões ou formas não lesivas de cardiomiopatia, como tecidos cardíacos infartados de suínos. Em um estudo separado, a isoforma GGF2 do NRG-1 beta demonstrou ser um potencial tratamento terapêutico para insuficiência cardíaca. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como processar tecido, tecido cardíaco, para o microscópio eletrônico de varredura, incluindo a técnica para expor a superfície de interesse e para montar a amostra.

Seguindo esse procedimento, outras técnicas, como espectrometria de massa, sequenciamento de RNA e vários outros ensaios, podem ser usadas para medir proteínas da matriz extracelular e outras responsáveis pela sinalização e outros fenômenos observacionais organizacionais. Além disso, não se esqueça de que o tetróxido de ósmio é um produto químico perigoso, devido ao potencial de fixação de vapor das membranas mucosas. Lembre-se sempre de trabalhar em uma hotte com luvas de nitrilo, usando uma proteção contra respingos ou caixilho do capô.