Desenvolvimento e Caracterização de In Vitro Rede de microvasos e medições quantitativas de endotelial [ca ²⁺] _i E óxido nítrico Produção

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver um dispositivo microfluídico que permita que as células endoteliais cresçam sob fluxo de cisalhamento fisiologicamente relevante e medir as mudanças induzidas pelo agonista em sua produção de cálcio e óxido nítrico. Esta mensagem pode ajudar a avançar o futuro da pesquisa de microvasos, validando o modelo de microvasos in vitro e preenchendo as lacunas entre os estudos in vivo e in vitro. As principais vantagens desta técnica são o design versátil dos microcanais para mimetizar várias vasculaturas e melhoram o ambiente de cultura celular que está mais próximo do in vivo do que a estática condicional para as culturas originais.

Demonstrando os procedimentos estarão Sulei e Xiang, os dois do meu laboratório. Antes de começar, use fotolitografia padrão para criar um molde mestre e litografia suave para fabricar os dispositivos de microcanal PDMS conforme descrito no protocolo de texto. Para preparar os dispositivos de microcanal, primeiro cubra a entrada e a saída com um pedaço fino de PDMS e coloque o dispositivo dentro de uma placa de Petri com um lenço úmido.

Em seguida, embrulhe o prato com Parafilm e esterilize o dispositivo sob luz ultravioleta por pelo menos três horas. O próximo passo é aplicar a fibronectina. Primeiro, coloque uma gota de 30 a 50 microlitros de PBS na entrada.

Crie um aspirador na saída para enxaguar o dispositivo. Em seguida, coloque uma gota de 100 microgramas por mililitro de fibronectina na entrada. Crie um vácuo na saída para carregar a solução de fibronectina.

Em seguida, cubra a entrada e a saída. Embrulhe o prato com Parafilm novamente e incube o dispositivo durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, enxágue manualmente o dispositivo com PBS três vezes.

Em seguida, carregue-o com 30 a 50 microlitros de meios de cultura de células e aqueça o dispositivo em uma incubadora a 37 graus Celsius por pelo menos 15 minutos. Comece misturando HUVECs em meios de cultura HUVEC com oito por cento de Dextrano a dois a quatro milhões de células por mililitro. O Dextrano é necessário para aumentar a viscosidade e, assim, melhorar a semeadura celular.

Em seguida, coloque de 10 a 20 microlitros de células sobre a entrada e introduza-as usando a gravidade ou usando a ação capilar de uma pipeta de pasteur de vidro na saída. Em seguida, incube o dispositivo por 15 a 20 minutos. Em seguida, verifique o status da semeadura ao microscópio.

Se necessário, carregue mais células para atingir a densidade celular desejada. Assim que houver células suficientes, enxágue suavemente o dispositivo com meio de cultura de células normal e quente para remover o Dextran. Em seguida, cultive o dispositivo sem qualquer perfusão de mídia por seis horas.

Em seguida, configure as conexões da tubulação para a perfusão de longo prazo. Prenda o dispositivo a uma placa de Petri e, em seguida, conecte o tubo de entrada a uma seringa com uma agulha. Insira a tubulação na entrada e na saída do dispositivo.

Conecte a tubulação de saída a um coletor de lixo. Agora, coloque o prato e o recipiente de lixo em uma incubadora. Conecte a seringa com um tubo de entrada longo a uma bomba de perfusão externa que passa pela porta da incubadora.

Em seguida, defina a taxa de perfusão de acordo com o desenho experimental. Com uma perfusão bem controlada, a cultura na rede de microvasos pode ser mantida por até duas semanas. Portanto, pode ser estendido a estudos de longo prazo mimetizando o ambiente celular e hemodinâmico nas diferentes condições fisiológicas e patológicas.

Para iniciar a imunocoloração, como a marcação de VE-caderina, primeiro fixe as células por perfusão com paraformaldeído a dois por cento por 30 minutos a quatro graus Celsius. Após uma série de perfusões para bloquear, permeabilizar e corar com anticorpos, mantenha o dispositivo a quatro graus Celsius até que as células sejam visualizadas. Para obter imagens da concentração de cálcio nas células, perfunda o dispositivo com 10 miligramas por mililitro de albumina em solução de Ringer por 15 minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, perfunda o dispositivo com cinco micromolares Fluo-4 AM por 40 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, lave o Fluo-4 AM ligado ao lúmen com toques de albumina por 15 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, inicie o sistema confocal para imagens do nível de cálcio intercelular com Fluo-4 AM. Adquira imagens dos microvasos carregados com Fluo-4.

Colete as imagens de linha de base por 10 minutos. Em seguida, perfundir o dispositivo continuamente com ATP 10 micromolar e registrar as mudanças de intensidade de fluorescência por 20 minutos. Para obter imagens da produção de óxido nítrico nas células, perfunda o dispositivo com ringers de albumina por 15 minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, perfunda as células com 5 DAF-2 micromolares DA por cerca de 35 a 40 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, configure o sistema de imagem de fluorescência para medir a produção de óxido nítrico induzida por ATP. Registre a linha de base por 5 minutos, depois perfunda o dispositivo com ATP 10 micromolar e colete as imagens por 30 minutos em intervalos de um minuto.

Para a medição do óxido nítrico celular, é importante entender que o adaptador de desprendimento para o perfil de intensidade representa uma produção cumulativa de óxido nítrico com o tempo e não uma concentração de óxido nítrico. Selecione manualmente a região de interesse das imagens coletadas no nível da célula individual. Cada ROI cobre a área da célula de um indivíduo que pode ser indicada pelo contorno floresense.

Quantificar as alterações induzidas pelo ATP no cálcio endotelial e no óxido nítrico. Calculando as mudanças na intensidade floresense de Fluo-4, menos o fundo do tecido. Quantificar a taxa de produção de óxido nitroso conduzindo a primeira conversão diferencial da intensidade florense do DAF-2 ao longo do tempo.

O padrão de microcanal no dispositivo tem uma rede de ramificação de três níveis. Uma simulação numérica 3D foi realizada para estimar as distribuições de tensões de cisalhamento sob a vazão de 0,35 microlitros por minuto. As células endoteliais estavam semeando na rede conforme descrito.

Em seguida, F-actina e núcleos foram marcados. Da mesma forma, a VE-caderina também foi corada. Os resultados foram semelhantes à expressão de VE-caderina em uma vênula intacta.

Em seguida, foram examinados aumentos induzidos por ATP na produção intracelular de cálcio e óxido nítrico. Os níveis de cálcio foram examinados usando Fluo-4 AM, conforme descrito na seção do protocolo. A produção de óxido nítrico foi monitorada usando DAF-2 DA, conforme descrito na seção do protocolo.

Os resultados foram comparáveis aos derivados com vênulas intactas perfundidas individualmente. O avançado era fácil e rigidamente controlado em condições biológicas e ambientes de fluidos dinâmicos, o que não teria sido possível com técnicas convencionais de microhabilidade. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fabricar o dispositivo e realizar medições de cálcio e óxido nítrico.

Depois disso, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores, não apenas para investigar o agonista subjacente induzido, mas também para abrir aplicações mais amplas para a pesquisa biomédica.