Desenvolvimento e Caracterização de

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver um dispositivo microfluídico que permita o crescimento de células endoteliais sob fluxo cisalhante fisiologicamente relevante e a medição das alterações induzidas por agonistas na produção de cálcio e óxido nítrico. Esta abordagem pode ajudar a impulsionar o futuro da pesquisa em microvasos, validando o modelo de microvaso in vitro e preenchendo as lacunas entre estudos in vivo e in vitro. As principais vantagens desta técnica são o design versátil dos microcanais para simular diferentes tipos de vasculatura e a melhoria do ambiente de cultura celular, que se assemelha mais ao in vivo do que as condições estáticas convencionais das culturas originais.

Os procedimentos serão demonstrados por Sulei e Xiang, os dois do meu laboratório. Antes de começar, utilize a fotolitografia padrão para criar um molde-mestre e a litografia macia para fabricar os dispositivos de microcanal de PDMS, conforme descrito no protocolo textual. Para preparar os dispositivos de microcanal, cubra primeiro a entrada e a saída com um pedaço fino de PDMS e coloque o dispositivo dentro de uma placa de Petri com um tecido úmido.

Em seguida, envolva a placa com Parafilm e esterilize o dispositivo sob luz UV por pelo menos três horas. O próximo passo é aplicar a fibronectina. Primeiro, coloque uma gota de 30 a 50 microlitros de PBS na entrada.

Crie um vácuo na saída para lavar o dispositivo. Em seguida, coloque uma gota de fibronectina a 100 microgramas por mililitro na entrada. Crie um vácuo na saída para carregar a solução de fibronectina.

Em seguida, cubra a entrada e a saída. Envolva o recipiente com Parafilm novamente e incube o dispositivo durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave manualmente o dispositivo com PBS três vezes.

Em seguida, carregue com 30 a 50 microlitros de meio de cultura celular e aqueça o dispositivo em uma incubadora a 37 graus Celsius por pelo menos 15 minutos. Comece misturando HUVECs ao meio de cultura de HUVECs com 8% de Dextrana a dois a quatro milhões de células por mililitro. A Dextrana é necessária para aumentar a viscosidade e, assim, melhorar o plaqueamento celular.

Em seguida, coloque de 10 a 20 microlitros de células sobre a entrada e introduza-as por gravidade ou por ação capilar usando uma pipeta Pasteur de vidro na saída. A seguir, incube o dispositivo por 15 a 20 minutos. Depois, verifique o status da semeadura sob microscópio.

Se necessário, carregue mais células para atingir a densidade celular desejada. Após o carregamento de células suficientes, lave suavemente o dispositivo com meio de cultura celular normal e aquecido para remover a dextrana. Em seguida, cultive o dispositivo sem perfusão de meio por seis horas.

Em seguida, prepare as conexões de tubos para a perfusão de longo prazo. Fixe o dispositivo a uma placa de Petri com fita adesiva e, em seguida, conecte o tubo de entrada a uma seringa com agulha. Insira o tubo tanto na entrada quanto na saída do dispositivo.

Conecte a tubulação de saída a um coletor de resíduos. Agora, coloque a placa e o recipiente de resíduos em uma incubadora. Conecte a seringa com um tubo de entrada longo a uma bomba de perfusão externa que passe pela porta da incubadora.

Em seguida, ajuste a taxa de perfusão de acordo com o delineamento experimental. Com uma perfusão bem controlada, o cultivo na rede de microvasos pode ser mantido por até duas semanas. Dessa forma, é possível estender o estudo a experimentos de longo prazo que mimetizem o ambiente celular e hemodinâmico em diferentes condições fisiológicas e patológicas.

Para iniciar a imunomarcação, como a marcação de VE-caderina, fixe primeiro as células perfundindo com paraformaldeído a dois por cento por 30 minutos a quatro graus Celsius. Após uma série de perfusões para bloquear, permeabilizar e marcar com anticorpos, mantenha o dispositivo a quatro graus Celsius até que as células sejam imagiadas. Para imagiar a concentração de cálcio nas células, perfunda o dispositivo com 10 miligramas por mililitro de albúmina em solução de Ringer por 15 minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, perfunda o dispositivo com Fluo-4 AM a cinco micromolar por 40 minutos a 37 graus Celsius. Então, lave o Fluo-4 AM ligado ao lúmen com Ringer de albúmina por 15 minutos a 37 graus Celsius. A seguir, inicie o sistema confocal para a imagem da concentração intracelular de cálcio com Fluo-4 AM. Adquira imagens dos microvasos carregados com Fluo-4.

Colete as imagens de linha de base durante 10 minutos. Em seguida, perfunda o dispositivo continuamente com ATP 10 micromolar e registre as alterações na intensidade de fluorescência por 20 minutos. Para imagens da produção de óxido nítrico nas células, perfunda o dispositivo com Ringer de albina por 15 minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, perfunda as células com DAF-2 DA a 5 micromolar por cerca de 35 a 40 minutos a 37 graus Celsius. Depois, prepare o sistema de imagem de fluorescência para medir a produção de óxido nítrico induzida por ATP. Registre a linha de base durante 5 minutos, então perfunda o dispositivo com ATP a 10 micromolar e colete as imagens durante 30 minutos em intervalos de um minuto.

Para a medição de óxido nítrico celular, é importante entender que o adaptador de desprendimento para o perfil de intensidade representa a produção acumulada de óxido nítrico ao longo do tempo e não a concentração de óxido nítrico. Selecione manualmente as regiões de interesse nas imagens coletadas ao nível celular individual. Cada ROI cobre a área de uma célula individual, que pode ser indicada pelo contorno de fluorescência.

Quantifique as alterações induzidas pelo ATP no cálcio endotelial e no óxido nítrico. Calcule as alterações na intensidade de fluorescência do Fluo-4, subtraindo o fundo tecidual. Quantifique a taxa de produção de óxido nítrico realizando a conversão diferencial da intensidade de fluorescência do DAF-2 ao longo do tempo.

O padrão de microcanais no dispositivo possui uma rede de ramificação em três níveis. Uma simulação numérica tridimensional foi realizada para estimar as distribuições de tensão de cisalhamento sob uma taxa de fluxo de 0,35 microlitros por minuto. Células endoteliais foram semeadas na rede conforme descrito.

Em seguida, o F-actina e os núcleos foram marcados. Da mesma forma, a VE-caderina também foi corada. Os resultados foram semelhantes à expressão de VE-caderina em um vênulo intacto.

Em seguida, foram examinados os aumentos induzidos por ATP no cálcio intracelular e na produção de óxido nítrico. Os níveis de cálcio foram analisados utilizando Fluo-4 AM, conforme descrito na seção de protocolo. A produção de óxido nítrico foi monitorada utilizando DAF-2 DA, conforme descrito na seção de protocolo.

Os resultados foram comparáveis aos obtidos com vênulas intactas individualmente perfundidas. O avanço foi fácil e rigorosamente controlado em condições biológicas e ambientes fluidos dinâmicos, o que não teria sido possível com técnicas convencionais de microcirurgia. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fabricar o dispositivo e realizar medições de cálcio e óxido nítrico.

Depois que esta técnica abriu caminho para os pesquisadores, não apenas para investigar agonistas subjacentes induzidos, mas também para ampliar as aplicações na pesquisa biomédica.