Geração de células de camundongo Airway epiteliais derivados de ESC Usando descelularizado Lung Scaffolds

O objetivo geral deste procedimento é direcionar a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongo em células epiteliais de vias aéreas maduras, utilizando um sistema de cultura 3D com esqueletos pulmonares descelularizados. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área do desenvolvimento pulmonar, como o papel das contrações da matriz celular e da sinalização de fatores de crescimento durante a diferenciação da linhagem pulmonar. A principal vantagem desta técnica é que utiliza um sistema de cultura 3D em um ambiente definido e livre de soro, alcançando uma diferenciação robusta do epitélio das vias aéreas com contaminação limitada por outras linhagens endodérmicas. Após a eutanásia de um rato Wistar adulto, conforme o protocolo descrito, fixe o animal em uma superfície de dissecação prendendo as patas dianteiras e traseiras e use etanol 70% para pulverizar o tórax e o abdômen. Faça uma incisão logo abaixo da caixa torácica. Corte a pele e exponha o diafragma. Em seguida, faça pequenas incisões no diafragma para provocar a retração dos pulmões, reduzindo a chance de perfurá-los. Depois, crie uma incisão vertical ao longo do esterno e abra a cavidade torácica para acessar o coração e os pulmões. Com um fio de sutura, ligue a veia cava inferior e use pequenas tesouras de dissecação para fazer uma pequena incisão no átrio esquerdo. Usando uma seringa de 10 ml preparada com agulha de 25 gauge, preenchida com solução salina balanceada de Hank contendo heparina, inicie a perfusão pulmonar inserindo a agulha no ventrículo direito e empurre o tampão pela circulação pulmonar. Continue a perfusão até que os pulmões fiquem brancos e o fluido que sai do átrio esquerdo esteja límpido. Após a perfusão, exponha a traqueia e faça uma pequena incisão próxima à cartilagem tireoide para canulação. Em seguida, canule a traqueia com um cateter plástico e use um fio de sutura para fixá-lo no lugar. Agora, monte um sistema de perfusão por gravidade fixando uma seringa de 10 ml em um suporte com haste e braçadeira. Remova e descarte o êmbolo da seringa. Marque o ponto máximo de enchimento no corpo da seringa a 20 cm acima dos pulmões, depois conecte uma torneira de dois sentidos à extremidade da seringa e um tubo plástico longo à outra extremidade da torneira. Retire cuidadosamente o cateter da traqueia e conecte-o à extremidade do tubo plástico. Despeje a solução de descelularização na seringa e permita que a solução preencha completamente o tubo plástico e o cateter conectados. Coloque novamente o cateter cheio de solução na traqueia e lave os pulmões enchendo-os até a capacidade pulmonar total por um minuto. Em seguida, remova o cateter da traqueia para permitir que o fluido escoe dos pulmões. Repita a lavagem dos pulmões oito vezes com a solução de descelularização, seguida por dez enxágues com PBS. Os pulmões ficarão brancos ao final das etapas de lavagem. Em seguida, dissecque a traqueia e os pulmões do pescoço e da cavidade torácica. Remova o tecido excedente dos pulmões dissecados, incluindo o esôfago e o coração, e transfira os pulmões para PBS frio até o preparo para o corte em vibrátomo. Para preparar cortes espessos, prepare aproximadamente 15 ml de agarose de ponto de fusão baixo a 2% e 4% em PBS, e quantidade suficiente de agarose a 6% para embutir todos os lobos em pequenos blocos retangulares. Após transferir a agarose para tubos de 15 ml, coloque os tubos em um bloco de aquecimento e mantenha a temperatura acima de 40 graus Celsius para evitar a gelificação. Usando pequenas tesouras, dissecque o pulmão descelularizado na extremidade de cada brônquio lobar e separe cada lobo. Use papel absorvente para remover o excesso de PBS e transfira os lobos para agarose a 2% no bloco de aquecimento por cinco minutos para revestir o tecido. Após transferir cada lobo para uma placa de Petri, coloque a placa em uma placa fria e permita que a superfície gelifique por um minuto. Coloque cuidadosamente os lobos em agarose a 4%, e após incubação por cinco minutos e resfriamento, repita o revestimento com agarose a 6%. Após o revestimento, use moldes metálicos para embutir cada lobo separadamente em agarose a 6%, com pelo menos 3 ml de agarose envolvendo o tecido nas bordas. Em seguida, com pinça, oriente cada lobo posicionando a maior face plana do tecido na superfície do molde metálico voltada para o experimentador, e finalize o embutimento usando caixas plásticas. Deixe os blocos gelificarem em uma placa fria por pelo menos 30 minutos antes do corte em vibrátomo. Alternativamente, armazene os blocos em uma câmara umidificada por até 12 horas a quatro graus Celsius antes do corte em vibrátomo. Para preparar os cortes, monte o vibrátomo enchendo a câmara de corte com PBS frio. Monte um banho de gelo ao redor para manter uma temperatura baixa durante todo o corte. Agora, remova os blocos dos moldes metálicos e use uma lâmina de barbear para aparar o excesso de agarose ao redor dos lobos, mantendo aproximadamente três milímetros da borda do tecido. Usando adesivo, fixe o tecido no centro da placa de espécime e submerja a placa na câmara de corte cheia de PBS. Instale a lâmina de corte no vibrátomo. Defina os limites de corte no vibrátomo, selecionando respectivamente os seguintes valores de velocidade, amplitude e espessura. Corte completamente cada lobo, e se os cortes não se separarem totalmente uns dos outros, use pequenas tesouras para cortar manualmente os cortes soltos. Em seguida, colete cuidadosamente os cortes do esqueleto e transfira-os para PBS frio. Com pinça, libere suavemente cada corte da agarose circundante. Para descontaminar os cortes do esqueleto, após transferi-los de PBS para tubos de microcentrífuga, adicione 90 unidades por mililitro de nucleases em PBS e incube em agitador rotativo à temperatura ambiente por 12 a 24 horas. Após transferir os cortes para novos tubos de microcentrífuga, conforme o protocolo descrito, em condições estéreis adicione solução antimicrobiana e incube em agitador rotativo à temperatura ambiente por seis horas. Em seguida, em condições estéreis, use PBS para enxaguar os esqueletos duas vezes e transfira-os para meio livre de soro, ou SFDM, antes da semeadura com células. Para montar uma cultura em interface ar-líquido, use pinça estéril para colocar membranas hidrofóbicas em uma placa de Petri. Em seguida, transfira cada corte de esqueleto descelularizado do SFDM para uma membrana, garantindo que os cortes fiquem distribuídos uniformemente sobre a membrana. Prepare placas de seis ou doze poços enchendo os poços com 1 ml ou 0,5 ml de SFDM, respectivamente. Em seguida, coloque suavemente as membranas nos poços, permitindo que a membrana flutue sobre o meio, criando uma configuração de cultura em interface ar-líquido. Para semear os esqueletos 3D, após o preparo das células endodérmicas e a triagem de células ativadas por fluorescência para enriquecer o endoderma definitivo, use um hemocitômetro para contar as células triadas. Centrifugue as células a 400 G por cinco minutos. Usando SFDM, re-suspenda as células em pellet para aproximadamente 100.000 células em 10