Name: Geração de células de camundongo Airway epiteliais derivados de ESC Usando descelularizado Lung Scaffolds (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Aprenda a diferenciar células-tronco embrionárias de camundongo em células epiteliais de vias aéreas maduras usando arcabouços pulmonares descelularizados em cultura 3D sem soro.

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Queremos agradecer Dr. Rossant e Dr. Bilodeau para o ESC mCherry NKX2-1 usados ​​em experimentos descritos nas Figuras 1-3. FACS foi realizada na instalação SickKids-UHN Citometria de Fluxo. Este trabalho foi financiado por subvenções de funcionamento dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde e uma subvenção de infra-estrutura (CSCCD) da Fundação Canadense de Inovação.

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Animal Care do Hospital para Crianças Doentes Research Institute. 1. Andaime Preparação <ol><li> Decelularização dos pulmões <ol><li> Euthanize ratos Wistar adultos usando CO 2 câmara. Coloque o animal na câmara e começar a 100% de exposição de CO 2 a uma velocidade de enchimento de 10-30% do volume da câmara por minuto. <ol><li> Observe animal para a inconsciência; isto irá ocorrer após cerca de 2-3 min. Se inconsciência não ocorre neste período de tempo, verificar a taxa e vedação da câmara preencher. Na sequência de inconsciência, observe animal para a cor dos olhos desapareceu e falta de respiração. Se ambos forem observadas, manter CO 2 enchimento para 1-2 min e em seguida, remover animais da câmara para o procedimento. </li></ol></li><li> Fixe animal para dissecar superfície fixando patas dianteiras e as patas traseiras, e spray para baixo do peito e abdômen com etanol 70%. Acesse o coração e luNGS por abertura da cavidade torácica através de uma incisão vertical ao longo do esterno. </li><li> Fazer pequenas incisões através do diafragma primeiro para fazer com que os pulmões se retraia, reduzindo a possibilidade de perfurar os pulmões. Ligadura da veia cava inferior com uma sutura e colocar uma pequena incisão no átrio esquerdo com pequenas tesouras de dissecação. </li><li> Usando um preparado seringa de 10 ml com uma agulha de 25 L preenchido com uma solução de sal equilibrada heparinizado de Hank (HBSS) (10 U / ml de heparina em HBSS), começar a perfusão pulmonar através da inserção da agulha para dentro do ventrículo direito para empurrar o tampão através da circulação pulmonar (taxa de 2 ml / min). Continue esse procedimento até que os pulmões ficam brancos e do fluido que flui do átrio esquerdo corre claro. </li><li> Na sequência de perfusão, expor a traqueia e canular com um cateter de plástico perto da cartilagem tireóide e fixe no lugar com uma sutura. </li><li> Instalação de um sistema de perfusão gravidade através da fixação de uma seringa de 10 ml a um stand retorta e grampo. Remover e discard êmbolo da seringa. Segurança do ponto de enchimento máximo no corpo da seringa a 20 cm acima dos pulmões. Adaptar uma torneira de duas vias para a extremidade da seringa, e um tubo de plástico de comprimento até à outra extremidade da torneira para o fornecimento de solução de descelularização para a traqueia canulada. Despeje solução na seringa e permita que a solução para preencher tubos de plástico anexado e cateter. <ol><li> A lavagem dos pulmões por enchimento a capacidade pulmonar total (cerca de 12 ml) durante 1 min e remover o cateter de plástico a partir da traqueia para permitir que o fluido se escoe para fora dos pulmões. Não encha seringa mais de 10 ml quando lavaging pulmões para manter a pressão abaixo de 20 cm de H 2 O. </li></ol></li><li> Repetir a lavagem dos pulmões oito vezes com solução de descelularização, seguido de 10 lavagens com solução salina tamponada com fosfato (PBS). </li><li> Dissecar a traqueia e os pulmões livre da cavidade pescoço e peito e retire do animal. Manter o tecido em PBS frio a 4 ° C até à preparação para vibratome SEctioning. </li></ol></li><li> geração seção de espessura <ol><li> Prepare a cerca de 15 ml de 2% e 4% (w / v) de agarose, e suficientemente 6% (w / v) de agarose para a incorporação de todos os lobos em pequenos blocos retangulares. Dissolver baixo pó de agarose ponto de fusão em PBS por microondas. Transferir a agarose para tubos de 50 ml em um bloco de aquecimento e manter a temperatura acima de 40 ° C para evitar a gelificação. </li><li> Dissecar pulmonar descelularizado no final de cada brônquio lobar para separar cada lóbulo (craniana, médio, acessório, e lobos caudal direito e do lobo esquerdo) usando uma tesoura pequena. Seque cada lóbulo utilizando folhas absorventes para remover o excesso de PBS e colocar dentro de 2% (w / v) de agarose, enquanto no bloco de aquecimento. </li><li> Remover cada lobo após 5 min de revestimento em agarose, coloque em um prato de Petri e deixe a superfície gel durante 1 min em uma placa fria. </li><li> Suavemente colocar lóbulos de volta em 4% (w / v) de agarose, fresco, após 5 min, e repetir revestimento mais uma vez com a 6% (w / v) de agarose. </li><li> Após co sequencialating de cada lóbulo, incorporar cada lóbulo separadamente em 6% (w / v) de agarose utilizando moldes de metal de base com pelo menos 3 mm de agarose em torno do tecido a partir das bordas. Orient cada lóbulo utilizando uma pinça posicionando a borda plana maior do lóbulo na superfície do molde de metal virada para o experimentador. Esta vantagem é o lado fixo à placa de amostra para vibratome seccionamento. </li><li> Permitir blocos de gel na placa fria durante pelo menos 30 minutos antes do corte com vibratome. Armazenar blocos numa câmara humidificada durante até 12 h a 4 ° C antes de seccionamento vibratome. </li><li> Configuração do vibratome, preenchendo a câmara de seccionamento com PBS frio 12. Manter a temperatura fria durante todo o corte com o banho de gelo circundante. Remover os blocos a partir de moldes de metal e usar uma lâmina de barbear para cortar para baixo excesso de agarose em torno lóbulos, enquanto mantém a cerca de 3 mm a partir da borda do tecido. </li><li> Fix tecido para o centro da placa de amostras utilizando adesivo, e submergir placa em Tele PBS-cheia câmara de corte. Setup seccionamento limites sobre vibratome, selecionando os seguintes valores de velocidade, amplitude, e espessura, respectivamente: 0,2 mm / seg, 1,85 mm e 350 mm. Nota: as secções longitudinais e transversais do lobo orientação são aceitáveis. </li><li> Seção cada lóbulo completamente. Manualmente secções de corte livre usando uma tesoura pequena se uma secção não é totalmente separados por lâmina na extremidade da sequência de secção. Recolhe secções de andaime suavemente e manter em PBS em gelo até ao próximo passo. Nota: Secções gerados incluirá ambas as zonas proximal e distai do pulmão e ambas as fontes podem ser utilizadas para recelularização; No entanto, a maior parte da superfície irá abranger pulmão distai. </li></ol></li><li> Descontaminação de secções de andaime <ol><li> Transfira a 350 mícrons seções de andaime grossas de PBS para microtubos (até 30 seções / tubo) e tratar com nuclease (90 U / ml em PBS) (veja Lista de Materiais) para 12-24 horas à temperatura ambiente, emum rotor. </li><li> A seguir ao tratamento por nucleases, as secções de transferência usando uma pinça para tubos de microcentrífuga novos e tratar com uma solução antimicrobiana (200 U / ml de estreptomicina penicilina e 25 ug / ml de anfotericina B, em PBS), sob condições estéreis, durante 6 h à TA, num agitador rotativo. Nota: Os andaimes pode ser armazenado em solução antimicrobiana para até uma semana a 4 ° C antes da utilização. </li><li> A seguir ao passo de descontaminação com solução antimicrobiana, lavar duas vezes com PBS andaimes sob condições estéreis e transferir ao soro meios diferenciação livre (SFDM) antes da inoculação com células. </li></ol></li></ol> 2. endodérmico celular Preparação <ol><li> Definitive Endoderma Indução <ol><li> Manter linhas de rato ESC sob, a cultura livre de soro livre de alimentador usando condições 2i 13. Comece indução endoderme, removendo as células de cultura pluripotentes aderente por tripsinização. </li><li> Ressuspender as células em SFDM e sementes a uma densidade de 20.000células / ml em baixas placas aderentes por três dias sem alteração de mídia para permitir a formação de EB. </li><li> Depois de três dias suavemente transferir os CEs em tubos de 50 mL cónico, utilizando uma pipeta de 10 ml e permitir que eles se acumulem na parte inferior por 3 min a RT. </li><li> Cuidadosa da mídia aspirado e adicionar mídia SFDM fresco suplementado com 50 ng / ml activina A. </li><li> Semear as células de volta para a baixa placas aderentes na proporção de 1: 2 a densidade ea cultura durante três dias adicionais para atingir a diferenciação endoderme definitiva. </li></ol></li><li> enriquecimento endoderme definitiva <ol><li> Recolha dia 6 EBS, dissociar com tripsina e rotular para c-KIT e expressão CXCR4 utilizando anticorpos fluorescentes conjugados 14. </li><li> Ordenar as células marcadas utilizando separação de células activada por fluorescência (FACS) para a expressão de ambos os marcadores para obter uma população enriquecida endoderme definitiva 15. </li></ol></li></ol> 3. Configuração Recellularization <ol><li> interface ar-líquidoconfiguração cultura <ol><li> Transfira cada seção andaime decelularizado (passo 1.2.9) da SFDM para uma membrana flutuante hidrofóbico (8 tamanho de poro) usando uma pinça estéril. Garantir andaime seções estão distribuídos uniformemente sobre a membrana. </li><li> Prepare 6 ou 12 poços placas por enchimento dos poços com 1 ou 0,5 ml de SFDM, respectivamente. Suavemente colocar membranas nos poços, permitindo que a membrana flutue na parte superior dos meios de comunicação, a criação de uma instalação de cultura ao ar-líquido. </li></ol></li><li> Semeadura de scaffolds 3D <ol><li> Seguintes FACS para marcadores endoderme definitivas (passo 2.2.2) contagem de células classificados usando um hemocitômetro, girar a 400 xg durante 5 min e ressuspender em SFDM. Ressuspender as células para se obter um volume contendo cerca de 100.000 células / 10 ul / andaime. </li><li> Para recellularize andaimes, pipeta de 10 ml de células diretamente em cada seção preparado a partir do passo 3.1.2. </li><li> Substituir mídia SFDM em culturas a cada 48 horas. Aspirar a velha mídia, segurando a placa a uma ligeira inclinaçãopara evitar prejudicar a cultura. Lentamente, adicionar SFDM fresco à cultura ao longo do lado do poço para evitar afundamento da membrana flutuante. </li><li> Manter culturas de ar-líquido para até 21 dias para alcançar a diferenciação de células semeadas no epitélio das vias aéreas maduro. Nota: repovoados secções pode ser processado para a coloração de tecidos e de imunofluorescência microscopia (IF), em qualquer ponto de tempo durante a cultura de células de 16. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Não há concorrentes interesses financeiros a declarar.

O protocolo aqui descrito gera epitélio das vias aéreas ESC-derivado maduros usando apenas andaimes naturais pulmonares à diferenciação com nenhuma outra suplementação dirigir. Esta configuração é definida cultura,, barato e reprodutível isento de soro. Nenhuma suplementação do factor de crescimento dos meios de diferenciação base é necessária. Métodos publicados anteriormente para a geração de células epiteliais do pulmão derivadas de células-tronco têm usado estratégias de 2-dimensional com a suplementação do fator de...

Dirigido a diferenciação de células pluripotentes para a linhagem de pulmão é dependente de eventos de sinalização precisos no microambiente 1,2. Devido à natureza dinâmica deste processo tem sido um desafio para mimetizar os acontecimentos precisos de organogénese do pulmão in vitro. Relatórios recentes têm utilizado estratégias de restrição de linhagem passo a passo com a suplementação de culturas bidimensionais factor de crescimento solúvel para alcançar a diferenciação pulmonar 3-8. Nos protocolos de diferenciação passo a passo, as células pluripotentes, se as células-tronco embrionárias (ESC) ou células-tronco pluripotentes induzidas, foram pela primeira vez diferenciado para a camada endoderme germe definitiva. As células da endoderme foram subsequentemente empurrado para um destino endoderme anterior e posteriormente para as células progenitoras de pulmão, como identificado pela expressão do factor de transcrição contendo homeodomï¿½io NKX2-1. Estes progenitores pulmão foram ainda mais diferenciado para proximal (via aérea) ou de células epiteliais do pulmão distais (alveolares) with continuou a suplementação de fator de crescimento. Tais estratégias 2-dimensionais têm tido algum sucesso na geração de células epiteliais do pulmão, no entanto, existem várias limitações, incluindo a eficiência pouco claras, a possível contaminação de outras linhagens endoderme, a falta de uma estrutura 3-dimensional (3D), e, em alguns casos, usar de culturas indefinidas com a suplementação do soro. Cultura de pluripotentes ou células diferenciadas em andaimes pulmonares descelularizados é cada vez mais utilizado como um ensaio para avaliar o potencial de regeneração de células semeadas na formação de estruturas epiteliais pulmonares 3,5,6,8,9. Tais relatórios cultura células semeadas em andaimes com fator de crescimento contínuo ou suplementação de soro. desenvolvimento pulmonar envolve a divisão, migração, a expressão do gene e a diferenciação de células individuais em resposta a estímulos ambientais. A matriz extracelular (ECM) é uma treliça de glicoproteínas que, além de fornecer apoio estrutural, dirige tissue morfogênese, integrando e regular esses processos 10,11. Ao utilizar o andaime ECM pulmão como uma plataforma natural para a cultura endoderme para melhor imitar o pulmão meio de desenvolvimento in vivo, que são geradas as células estaminais epiteliais das vias aéreas derivadas de células em uma cultura 3D-ajuste definido com alta eficiência e reprodutibilidade. Rato andaimes ECM pulmonares foram gerados pela descelularização, bem como células da endoderme rato ESC-derivados foram gerados e subsequentemente semeadas em andaimes estes. expressão dual de CXCR4 e proteínas c-kit indica uma identidade de células endoderme definitivo e células positivas para ambos SOX2 &amp; expressão NKX2-1 são identificadas como células das vias respiratórias (pulmonar proximal) progenitoras. As células da endoderme definitivas foram cultivadas na interface ar-líquido (ALI) durante até três semanas para gerar células epiteliais das vias respiratórias in vitro funcional. Este protocolo promove a diferenciação de pulmão linhagem Definitiva endoderme tão cedo quanto 7 dias, observadas com o surgimento de NKX2-1 + / SOX2 + progenitoras pulmonares proximais início. Por volta do dia 14 e 21 de populações de células de cultura maduros epiteliais das vias aéreas emergirão, inclusive ciliadas (TUBB4A +), clube (SCGB1A1 +) e basal (TRP63 +, KRT5 +) células com semelhança morfológica e funcional de vias aéreas nativas do mouse. Este protocolo demonstra a importância do microambiente-matriz 3D para atingir a diferenciação forte para células epiteliais das vias respiratórias.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes</forte>Solução de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>perfusão</td><td>Sigma</td><td>H0777</td><td>10 U/ml heparina</td></tr><tr><td>Solução de perfusão</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td>dissolvida na solução salina balanceada Hank's (HBSS-)</td></tr><tr><td>Solução de descelularização</td><td>BioShop</td><td>CHA003</td><td>8&nbsp; Solução de descelularização mM CHAPS</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td>25&nbsp; Solução de descelularização mM EDTA</td></tr><tr><td></td><td>BioShop</td><td>SOD002</td><td>1&nbsp; M NaCl</td></tr><tr><td>Solução de descelularização</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>dissolvido em PBS</td></tr><tr><td>Benzonase nuclease</td><td>Novagen</td><td>70664-3</td><td>90&nbsp; U/ml Benzonase nuclease&nbsp;</td></tr><tr><td>Benzonase nuclease</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>diluída em</td></tr><tr><td>solução antimicrobiana PBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>200&nbsp; U/ml de penicilina estreptomicina</td></tr><tr><td>Solução antimicrobiana&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15290</td><td>25&nbsp; &mu; g/ml de anfotericina B</td></tr><tr><td>Solução antimicrobiana&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>diluído em</td></tr><tr><td>tripsinização PBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>TrypLE</td></tr><tr><td>Serum free differentiation media (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>IMDM 2440-053, F12 11765-054</td><td>Proporção de 3:1 de IMDM e Ham' s meio F12 modificado</td></tr><tr><td>Meios de diferenciação livres de soro (SFDM)</td><td>Suplemento Gibco</td><td>12587-010</td><td>B27 (diluição de 50x)</td></tr><tr><td>Meio de diferenciação livre de soro (SFDM)</td>Suplemento de N2 <td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>(diluição de 100x)</td></tr><tr><td>Meio de diferenciação livre de soro (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>0,05% (fração V) albumina de soro</td></tr> bovino <tr><td>Meios de diferenciação livre de soro (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>200&nbsp; mM Glutamax</td></tr><tr><td>Serum free differentiation media (SFDM)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td>4&nbsp; &mu; M monotioglicerol</td></tr><tr><td>Serum free differentiation media (SFDM)</td><td>Sigma</td><td>A4403&nbsp;</td><td>0,05&nbsp; mg/ml de ácido ascobico</td></tr><tr><td>Indução de endoderme</td><td>R& D</td><td>338-AC/CF</td><td>Activin A</td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDH1</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>Camundongo, não conjugado, 1:100</td></tr><tr><td>C-KIT</td><td>BD Biosciences</td><td>558163</td><td>Rato, PE-Cy7, 1:100</td></tr><tr><td>CXCR4</td><td>BD Biosciences</td><td>558644</td><td>Rato, APC, 1:100</td></tr><tr><td>KRT5</td><td>Abcam</td><td>ab24647</td><td>Coelho, não conjugado, 1:1.000</td></tr><tr><td>NKX2-1</td><td>Abcam</td><td>ab76013</td><td>Coelho, não conjugado, 1:200</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-144</td><td>Coelho, não conjugado, 1:200</td></tr><tr><td>SCGB1A1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9772&nbsp;</td><td>Cabra, não conjugada, 1:1.000</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>R& D Systems</td><td>AF2018&nbsp;</td><td>Cabra, não conjugada, 1:400</td></tr><tr><td>TRP63</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8431</td><td>Mouse, não conjugado, 1:200</td></tr><tr><td>TUBB4A</td><td>BioGenex</td><td>MU178-UC</td><td>Mouse, não conjugado, 1:500</td></tr><tr><td>Goat IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td>Burro, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>Mouse IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21202</td><td>Burro, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>Mouse IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Burro, Alexa Fluor 647, 1:200</td></tr><tr><td>Coelho IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>Burro, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>Coelho IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31573</td><td>Burro, Alexa Fluor 647, 1:200</td></tr><tr><td><forte>Outros Materiais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de baixa aderência</td><td>Nunc</td><td>Z721050&nbsp;</td><td>Placas de ligação celular baixa,&nbsp; 6 poços&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Membranas de interface ar-líquido&nbsp;</td><td>Whatman</td><td>110614</td><td>membrana de nucleóporo hidrofóbico, 8&nbsp; &mu; m tamanho de poro</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S&nbsp;</td><td>Leica Vibratome</td></tr><tr><td>Adesivo de tecido</td><td>Ted Pella</td><td>10033</td><td>Adesivo de tecido Pelco</td></tr></tbody></table>

geração de células de camundongo airway epiteliais derivados de esc usando descelularizado lung scaffolds

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Pulmão diferenciação linhagem requer integração de sinais ambientais complexos que incluem o factor de crescimento de sinalização, as interacções célula-célula e as interacções célula-matriz. Devido a esta complexidade, recapitulação de desenvolvimento do pulmão in vitro para promover a diferenciação de células estaminais para as células epiteliais do pulmão tem sido um desafio. Neste protocolo, andaimes pulmonares descelularizados são utilizados para imitar o ambiente de 3-dimensional do pulmão e gerar células epiteliais das vias aéreas derivadas de células estaminais. células-tronco embrionárias de rato são primeiro diferenciado à linhagem endoderme usando um método de cultura corporal embryoid (EB) com células da endoderme activina A. são então semeadas em andaimes descelularizados e cultivadas a interface ar-líquido por até 21 dias. Esta técnica promove a diferenciação de células semeadas para as células epiteliais das vias aéreas funcional (células ciliadas, células do clube, e células basais) sem suplementação adicional de fator de crescimento. Esta configuração cultura é definida, seru-M livre, barato e reprodutível. Embora não haja contaminação limitado de linhagens endoderme não-pulmonares na cultura, este protocolo só gera populações epiteliais das vias aéreas e não dá origem a células epiteliais alveolares. epitélios das vias aéreas gerados com este protocolo pode ser utilizado para estudar as interacções célula-matriz durante a organogénese de pulmão e para modelar doenças ou plataformas de drogas de descoberta de patologias relacionadas com o das vias respiratórias, tais como a fibrose cística.

Conforme descrito neste protocolo, a diferenciação robusto de endoderme definitiva para amadurecer das vias aéreas células epiteliais podem ser alcançados com a cultura prolongada de células semeadas em seções de andaime de pulmão descelularizados. Recomenda-se que andaimes descelularizados ser caracterizado para garantir (1) células hospedeiras são completamente removidos, e (2) as proteínas da matriz extracelular são preservadas antes de utilizar andaimes para a diferenciação. Descelul...

Este protocolo eficiente dirige rato estaminais embrionárias endoderme definitivo de células-derivadas para amadurecer as células epiteliais das vias respiratórias. Esta técnica utiliza a diferenciação 3-dimensionais andaimes pulmonares descelularizados para dirigir especificação das linhagens celulares de pulmão, em, uma configuração de cultura isento de soro definido.

Geração de células de camundongo Airway epiteliais derivados de ESC Usando descelularizado Lung Scaffolds

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

O objetivo geral deste procedimento é direcionar a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongo em células epiteliais de vias aéreas maduras, utilizando um sistema de cultura 3D com esqueletos pulmonares descelularizados. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área do desenvolvimento pulmonar, como o papel das contrações da matriz celular e da sinalização de fatores de crescimento durante a diferenciação da linhagem pulmonar. A principal vantagem desta técnica é que utiliza um sistema de cultura 3D em um ambiente definido e livre de soro, alcançando uma diferenciação robusta do epitélio das vias aéreas com contaminação limitada por outras linhagens endodérmicas. Após a eutanásia de um rato Wistar adulto, conforme o protocolo descrito, fixe o animal em uma superfície de dissecação prendendo as patas dianteiras e traseiras e use etanol 70% para pulverizar o tórax e o abdômen. Faça uma incisão logo abaixo da caixa torácica. Corte a pele e exponha o diafragma. Em seguida, faça pequenas incisões no diafragma para provocar a retração dos pulmões, reduzindo a chance de perfurá-los. Depois, crie uma incisão vertical ao longo do esterno e abra a cavidade toráci

generation-esc-derived-mouse-airway-epithelial-cells-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nós desenvolvemos uma matriz extracelular e de pulmão decelularizado biorreator romance biomimético que pode ser usado para gerar tecido pulmonar funcional. Por semeadura de células na matriz e cultura no biorreator, geramos tecido que demonstra a troca gasosa eficaz quando transplantadas in vivo por curtos períodos de tempo.

Procedimento para a Engenharia de pulmão

Neste vídeo, demonstramos a preparação de um arcabouço de esôfago de porco descelularizado, com sua arquitetura bioquímica e composição preservadas, para aplicações de engenharia de tecidos.

Preparação de andaime esofágico suíno descelularizado: uma técnica para gerar andaime acelular a partir de um esôfago de porco

A descelularização de órgãos inteiros produz andaimes biológicos naturais que podem ser usados para medicina regenerativa. A descrição de um modelo de regeneração pulmonar de primatas não humanos em que pulmões inteiros são descelularizados e depois semeados com células-tronco adultas e células endoteliais em um biorreator que facilita a circulação vascular e a ventilação em meio líquido é apresentada.

Descelularização e recelularização pulmonar de primatas não humanos usando um biorreator especializado de órgãos grandes

Este protocolo visa descelularizar o coração e os pulmões dos ratos. Os andaimes de matriz extracelular resultante (ECM) podem ser imunossuados e imagens para mapear a localização e topologia de seus componentes.

Descelularização do Complexo Cardiopulmonar Murine

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Tecidos pulmonares projetados preparados a partir de fatias pulmonares descelularizadas

O protocolo descreve um bioreator habilitado para imagem que permite a remoção seletiva do epitélio endógeno da traqueia de rato e distribuição homogênea de células exógenas na superfície do lúmen, seguida pela cultura in vitro de longo prazo da construção do tecido celular.

Bioreator guiado por imagem para geração de tecido das vias aéreas bioengenharia

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Co-cultura de células epiteliais, mesenquimais, endoteliais e imunes derivadas de iPSC para modelar a integridade da barreira das vias aéreas na saúde e doença pulmonar

Este artigo descreve como criar pulmões de camundongos de bioengenharia usando métodos de descelularização e recelularização. Ele também detalha o transplante pulmonar ortotópico subsequente.

Transplante de Pulmão de Bioengenharia Usando Pulmões de Camundongos Descelularizados e Células Endoteliais Humanas Primárias

Aprenda a diferenciar células-tronco embrionárias de camundongo em células epiteliais de vias aéreas maduras usando arcabouços pulmonares descelularizados em cultura 3D sem soro.

Geração de células de camundongo Airway epiteliais derivados de ESC Usando descelularizado Lung Scaffolds

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