Clearing óptica do Sistema Nervoso Central Rato Usando a claridade passiva

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar modificações no protocolo CLARITY original, que produzem resultados mais consistentes e econômicos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em neurociência, como morfologia 3D e conectividade no sistema nervoso central. A principal vantagem dessa técnica é que ela melhora a consistência da limpeza óptica e da microscopia no sistema nervoso central do camundongo.

De maneira econômica e reproduzível. A demonstração visual desse método é crítica. Como a construção da câmara de imagem é complicada e não é facilmente óbvia a partir da descrição escrita.

Obtenha tecido cerebral e da medula espinhal fixado em paraformaldeído de camundongos que expressam proteínas fluorescentes. Hemisseccione o cérebro colocando-o em uma matriz cerebral de camundongo de plástico e cortando ao longo da linha média com uma lâmina de matriz. Adicione cada hemisfério e medula espinhal para separar tubos de centrífuga de 50 mililitros.

Cada um contendo 40 mililitros de solução de hidrogel. Cubra os tubos com papel alumínio para proteger os fluoróforos. E incube os tubos contendo amostras e hidrogel a quatro graus Celsius com agitação suave por sete dias.

Após o período de incubação, descarte 25 mililitros de hidrogel saindo da amostra e aproximadamente 25 mililitros de hidrogel no tubo da centrífuga. Em seguida, desoxigene a amostra removendo a tampa, colocando o tubo de centrífuga em um frasco dessecador e conectando o frasco ao vácuo. Aplique o vácuo por pelo menos 10 minutos.

Agite suavemente para desalojar as bolhas de oxigênio emitido. Após 10 minutos, substitua o vácuo no frasco do dessecador por gás nitrogênio a 100% por dois a três minutos. Assim que a pressão se equalizar e a parte superior do frasco dessecador puder ser aberta, tampe rapidamente o tubo para evitar a reintrodução de oxigênio.

Em seguida, polimerizar o hidrogel colocando o tubo com a amostra em banho-maria a 37 graus Celsius por três horas até que a polimerização esteja completa. Após três horas, o hidrogel polimerizado assumirá uma consistência semelhante a um gel. Use uma espátula para remover a amostra polimerizada do tubo de centrífuga e, em seguida, corte o excesso de hidrogel da amostra.

Por fim, remova o hidrogel restante colocando a amostra em um lenço sem fiapos e esfregando e enrolando suavemente o tecido sobre ele, deixando para trás apenas uma fina camada de hidrogel polimerizado na amostra. Para iniciar o processo de remoção de lipídios, transfira a amostra polimerizada para um tubo de centrífuga limpo de 50 mililitros com 45 mililitros de tampão de limpeza e incube a 45 graus Celsius com agitação suave por sete dias. Troque o buffer diariamente durante este período inicial de sete dias, despejando o buffer de limpeza usado em um recipiente de resíduos químicos.

E adicionando 45 mililitros de tampão de limpeza fresco. Assim que todos os lipídios estiverem solubilizados e o tecido atingir a transparência, transfira a amostra para um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros preenchido com 45 mililitros de PBST e lave quatro vezes a 40 graus Celsius com agitação suave nas próximas 24 horas, para remover o SDS residual. Após a lavagem final do PBST, transfira a amostra para um tubo de centrífuga limpo de 15 mililitros cheio de um micrograma por mililitro de DAPI e 1xPBST.

Embrulhe com papel alumínio e incube em temperatura ambiente por 24 horas. No dia seguinte, lave três vezes em PBST em temperatura ambiente por pelo menos seis horas por lavagem. Em seguida, prossiga para a correspondência do índice de refração.

Para iniciar esta parte do procedimento, transfira a amostra para um tubo de centrífuga limpo de 15 mililitros cheio de 2-2 tiodietanol e 1xPBS a PH 7,5 e incube conforme mostrado na tela. No final da segunda incubação, crie uma câmara de imagem enrolando um pedaço de adesivo reutilizável em um cilindro com diâmetro uniforme ligeiramente maior que a espessura da amostra. Coloque o cilindro em um círculo aberto em um prato de fundo de vidro de 40 milímetros.

Em seguida, use uma ponta de pipeta P1000 para criar uma vedação entre o adesivo reutilizável e o vidro, rolando-o ao redor da borda externa do cilindro. Pipete aproximadamente 100 microlitros de 63% TDE no prato de vidro e espalhe-o para cobrir a superfície do vidro dentro do círculo de adesivo reutilizável. Em seguida, use uma espátula para colocar cuidadosamente a amostra no meio do círculo, tomando cuidado para não formar bolhas.

Em seguida, pipete mais 100 microlitros de 63% TDE diretamente na amostra e coloque imediatamente uma lamínula circular de 40 milímetros sobre o adesivo reutilizável. Use o indicador, o dedo médio e anelar de ambas as mãos para pressionar cuidadosamente o perímetro do círculo até que a lamínula entre em contato com a amostra. Agora, leve lentamente o prato com fundo de vidro para a posição vertical, apoiado em uma superfície e, em seguida, adicione 63% de TDE com uma pipeta até que a solução atinja a pequena abertura na parte superior.

Use um pano sem fiapos para secar a ponta da pipeta para que a solução não pingue no vidro. Por fim, adicione elastômero de silicone à pequena abertura para envolver o círculo e criar uma câmara fechada. Aguarde cinco minutos para secar e, em seguida, prossiga para a imagem.

Coloque a câmara de imagem com a amostra dentro no palco de um microscópio confocal de varredura a laser. Abra o software de imagem, para ligar o laser de excitação de argônio, clique na guia de configuração na parte superior do programa e, em seguida, no ícone do laser. Marque a caixa ao lado de argônio para alimentar o laser e mover a escala do slide para 30%Retorne à guia de aquisição na parte superior.

Na caixa de configurações do caminho do feixe, vá para a caixa de configuração de salvamento de carga e selecione o menu suspenso para selecionar o canal de comprimento de onda apropriado para emitir YFP. Na caixa de configurações do canal, selecione as objetivas apropriadas para a geração de imagens clicando no hiperlink vermelho rotulado como objeto atual da objetiva. Use objetivas com uma distância de trabalho maior que a espessura do tecido.

E uma grande abertura numérica para maximizar a resolução da imagem no plano e minimizar a espessura da seção óptica. Na coluna esquerda dos menus suspensos, abra a janela de resolução XY para definir a matriz de aquisição, chamada de formato, como 1024x1024 ou um valor apropriado para o limite de resolução lateral da objetiva. Defina o fator de zoom o mais baixo possível.

1.7 é usado aqui. Na mesma janela, defina os parâmetros de média da oitava linha e média de um quadro, soltando os menus rotulados individualmente de acordo. Localize a amostra usando os controles do estágio.

Quando um campo representativo estiver visível, defina o ganho entre 760 e 780 e o deslocamento entre 1,0 e 1,5 para YFP. Selecione a verificação de blocos. Em seguida, defina os limites superior e inferior da pilha Z a ser adquirida.

Defina a espessura da seção óptica com base no limite de resolução da seção óptica das objetivas e, em seguida, inicie a aquisição. Esta imagem mostra neurônios positivos para YFP no córtex cerebral e hipocampo com ampliação de 5x e reconstruídos em 3D. A barra de escala representa um milímetro.

Essa projeção de intensidade máxima de uma pilha de imagens de 10x do córtex cerebral demonstra a aborização dendrítica da camada cortical de cinco neurônios piramidais. Aqui, a barra de escala representa 100 mícrons. Aqui, a expressão de THY-1YFP é mostrada em uma medula espinhal cervical e torácica intacta, fotografada com ampliação de 5x e reconstruída em 3D.

A barra de escala representa dois milímetros. Finalmente, esta projeção de intensidade máxima de uma pilha de imagens de 10x da medula espinhal demonstra axônios individuais, barras de escala representam 100 mícrons. Se pré-executada corretamente, essa técnica pode ser feita em duas a quatro semanas para medula espinhal inteira e quatro a seis semanas para cérebros hemisseccionados.

Após este procedimento, outros métodos, como a química imunoquímica, podem ser realizados para responder a perguntas que requerem fenotipagem bioquímica mais complexa. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como limpar opticamente e obter imagens do sistema nervoso central de um camundongo. Usando clareza passiva e microscopia confocal a laser.