Clearing óptica do Sistema Nervoso Central Rato Usando a claridade passiva
30 de junho de 2016
As técnicas de limpeza óptica estão revolucionando a forma como os tecidos são visualizados. Neste relatório, descrevemos modificações do protocolo original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-hYdrogel (CLARITY) que produz resultados mais consistentes e menos dispendiosos.
O objetivo geral deste protocolo é demonstrar modificações no protocolo CLARITY original, que geram resultados mais consistentes e economicamente viáveis. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na neurociência, como a morfologia tridimensional e a conectividade no sistema nervoso central. A principal vantagem desta técnica é que ela melhora a consistência do clareamento óptico e da microscopia no sistema nervoso central de camundongos.
De maneira economicamente eficiente e reproduzível. A demonstração visual deste método é essencial, já que a construção da câmara de imagem é complicada e não fica clara apenas pela descrição escrita.
Obtenha tecido de cérebro e medula espinhal fixado com paraformaldeído de camundongos que expressam proteínas fluorescentes. Hemicorte o cérebro colocando-o em uma matriz plástica para cérebro de camundongo e cortando ao longo da linha média com uma lâmina da matriz. Adicione cada hemisfério e a medula espinhal a tubos cónicos separados de 50 mililitros.
Cada um contendo 40 mililitros de solução de hidrogel. Cubra os tubos com papel alumínio para proteger os fluoróforos. E incube os tubos contendo as amostras e o hidrogel a quatro graus Celsius com agitação suave por sete dias.
Após o período de incubação, descarte 25 mililitros do hidrogel, deixando a amostra e aproximadamente 25 mililitros do hidrogel no tubo de centrífuga. Em seguida, desoxigene a amostra removendo a tampa, colocando o tubo de centrífuga em um frasco dessecador e conectando o frasco a um vácuo. Aplique o vácuo por pelo menos 10 minutos.
Agite suavemente para desprender as bolhas de oxigênio liberado. Após 10 minutos, substitua o vácuo no frasco do dessecador por gás nitrogênio a 100% em dois a três minutos. Assim que a pressão se equalizar e a tampa do frasco do dessecador puder ser aberta, tampe o tubo rapidamente para evitar a reintrodução de oxigênio.
A seguir, polimerize o hidrogel colocando o tubo com a amostra em um banho-maria a 37 graus celsius por três horas, até que a polimerização esteja completa. Após três horas, o hidrogel polimerizado adquirirá uma consistência semelhante à de um gel. Use uma espátula para remover a amostra polimerizada do tubo de centrífuga e, em seguida, corte o hidrogel em excesso ao redor da amostra.
Por fim, remova o hidrogel remanescente colocando a amostra sobre um lenço livre de fiapos e esfregando e rolando suavemente o tecido sobre ele, deixando apenas uma fina camada de hidrogel polimerizado na amostra. Para iniciar o processo de remoção de lipídios, transfira a amostra polimerizada para um tubo de centrífuga limpo de 50 mililitros contendo 45 mililitros de tampão de clareamento e incube a 45 graus celsius com agitação suave por sete dias. Troque o tampão diariamente durante este período inicial de sete dias, despejando o tampão de clareamento usado em um recipiente para resíduos químicos.
E adicionando 45 mililitros de tampão de clareamento fresco. Uma vez que todos os lipídios estejam solubilizados e o tecido atinja transparência, transfira a amostra para um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros contendo 45 mililitros de PBST, e lave quatro vezes a 40 graus Celsius com agitação suave nas próximas 24 horas, para remover o SDS residual. Após a lavagem final com PBST, transfira a amostra para um tubo de centrífuga de 15 mililitros limpo contendo DAPI a um micrograma por mililitro e PBST 1x.
Cubra com papel alumínio e incube à temperatura ambiente por 24 horas. No dia seguinte, lave três vezes em PBST à temperatura ambiente, com pelo menos seis horas por lavagem. Em seguida, prossiga para o ajuste do índice de refração.
Para iniciar esta parte do procedimento, transfira a amostra para um tubo de centrífuga limpo de 15 mililitros contendo 2-2 tiodianol e PBS 1x em pH 7,5 e incube conforme mostrado na tela. Perto do final da segunda incubação, crie uma câmara de imagem enrolando um pedaço de adesivo reutilizável em um cilindro com diâmetro uniforme, ligeiramente maior que a espessura da amostra. Coloque o cilindro em um círculo aberto em uma placa de vidro de fundo de 40 milímetros.
Em seguida, utilize uma ponteira de pipeta P1000 para criar um selo entre o adesivo reutilizável e o vidro, rolando-a ao longo da borda externa do cilindro. Pipete aproximadamente 100 microlitros de TDE 63% sobre a placa de vidro e espalhe para cobrir a superfície de vidro dentro do círculo formado pelo adesivo reutilizável. Em seguida, use uma espátula para colocar cuidadosamente a amostra no centro do círculo, tomando cuidado para não formar bolhas.
Em seguida, pipete mais 100 microlitros de TDE 63% diretamente sobre a amostra e, imediatamente, coloque um lamínula circular de 40 milímetros sobre o adesivo reutilizável. Use o indicador, o médio e o anelar de ambas as mãos para pressionar cuidadosamente ao redor do perímetro do círculo até que o lamínula entre em contato com a amostra. Agora, coloque lentamente o prato com fundo de vidro na posição vertical apoiado contra uma superfície e, então, adicione TDE 63% com uma pipeta até que a solução alcance a pequena abertura no topo.
Use um lenço livre de fiapos para secar a ponta da pipeta, evitando que a solução escorra sobre o vidro. Por fim, adicione elastômero de silicone à abertura pequena para fechar o círculo e criar uma câmara fechada. Aguarde cinco minutos para secagem e, em seguida, prossiga para a obtenção de imagens.
Coloque a câmara de imagem com a amostra no interior sobre a platina de um microscópio confocal de varredura a laser. Abra o software de imagem; para ligar o laser de excitação de argônio, clique na aba de configuração na parte superior do programa e, em seguida, no ícone do laser. Marque a caixa ao lado de argônio para ativar o laser e mova a escala deslizante para 30%. Retorne à aba de aquisição na parte superior.
Na caixa de configurações do caminho do feixe, vá até a caixa de configurações de carregamento e salvamento e selecione no menu suspenso o canal de comprimento de onda apropriado para emitir YFP. Na caixa de configurações do canal, selecione os objetivos apropriados para a aquisição de imagens clicando no hiperlink vermelho rotulado como objetivo atual. Utilize objetivos com uma distância de trabalho maior que a espessura do tecido.
E uma grande abertura numérica para maximizar a resolução da imagem no plano e para minimizar a espessura da seção óptica. Na coluna esquerda dos menus suspensos, abra a janela de resolução XY para definir a matriz de aquisição, denominada formato, como 1024x1024 ou um valor apropriado para o limite de resolução lateral do objetivo. Defina o fator de zoom o mais baixo possível.
1,7 é usado aqui. Na mesma janela, defina as médias de oito linhas e de um quadro ajustando os menus individualmente rotulados conforme necessário. Localize a amostra utilizando os controles do estágio.
Uma vez que um campo representativo esteja visível, ajuste o ganho para entre 760 e 780 e o offset para entre 1,0 e 1,5 para YFP. Selecione a varredura em mosaico. Em seguida, defina os limites superior e inferior da pilha Z a ser adquirida.
Defina a espessura da seção óptica com base no limite de resolução da seção óptica do objetivo e, em seguida, inicie a aquisição. Esta imagem mostra neurônios positivos para YFP no córtex cerebral e no hipocampo, obtidos com ampliação de 5x e reconstruídos em 3D. A barra de escala representa um milímetro.
Esta projeção de intensidade máxima de uma pilha de imagens 10x do córtex cerebral demonstra a arborização dendrítica de neurônios piramidais da camada cortical cinco. Aqui, a barra de escala representa 100 micrômetros. Aqui, a expressão de THY-1YFP é mostrada em uma medula espinhal cervical e torácica intacta, obtida com ampliação de 5x e reconstruída em 3D.
A barra de escala representa dois milímetros. Finalmente, esta projeção de intensidade máxima de uma pilha de imagens 10x da medula espinhal demonstra axônios individuais, as barras de escala representam 100 mícrons. Se realizada corretamente, esta técnica pode ser feita em duas a quatro semanas para medulas espinhais inteiras, e em quatro a seis semanas para hemissecções cerebrais.
Após este procedimento, outros métodos, como a imunohistoquímica, podem ser realizados para responder perguntas que exigem fenotipagem bioquímica mais complexa. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como tornar transparente e imagens do sistema nervoso central de camundongo. Utilizando a clareza passiva e microscopia confocal a laser.
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Visão Geral
Este relatório discute modificações no protocolo CLARITY original, aprimorando a consistência e a relação custo-benefício das técnicas de clareamento óptico. Esses avanços são cruciais para a visualização de tecidos na pesquisa em neurociência.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Imagem Óptica
- Técnicas de Clareamento de Tecidos
Antecedentes
- As técnicas de clareamento óptico melhoram a visualização de tecidos.
- O protocolo CLARITY é amplamente utilizado para imageamento em neurociência.
- As modificações visam aumentar a reprodutibilidade e reduzir custos.
- Demonstrações visuais são essenciais para compreender métodos complexos.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar modificações no protocolo CLARITY.
- Obter resultados mais consistentes no clareamento óptico.
- Fornecer um método economicamente viável para pesquisas em neurociência.
Métodos Utilizados
- Modificações ao protocolo CLARITY original.
- Demonstrações visuais da construção da câmara de imagem.
- Aplicação no sistema nervoso central de camundongo.
- Foco na análise da morfologia e conectividade tridimensionais.
Resultados Principais
- Consistência aprimorada no clareamento óptico.
- Metodologia econômica para pesquisadores.
- Capacidades de imagem aprimoradas em neurociência.
- Auxílios visuais fornecidos para procedimentos complexos.
Conclusões
- Modificações no protocolo CLARITY são benéficas.
- Resultados consistentes podem avançar a pesquisa em neurociência.
- Demonstrações visuais auxiliam na compreensão de métodos complexos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Técnicas de clareamento óptico, como o CLARITY passivo, permitem a visualização tridimensional de tecido neural intacto, abordando um gargalo fundamental na validação de alvos em neurociência, onde o corte em série introduz artefatos que comprometem a análise morfológica e de conectividade. Ao melhorar a consistência e reduzir custos, este método apoia a modelagem pré-clínica confiável de distúrbios do SNC, aumentando a confiança preditiva nos estágios iniciais de descoberta. A abordagem facilita a redução de riscos mecanicistas ao permitir a observação direta de fenótipos estruturais em sistemas relevantes para doenças, sem artefatos de deformação tecidual.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da análise da morfologia e conectividade tridimensionais intactas no SNC de camundongos.
- Valor Operacional: Oferece desvio de risco biológico ao preservar a integridade do tecido enquanto remove os lipídios dispersores de luz para uma imagem clara.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao gerar dados estruturais quantitativos sobre redes neuronais para validação de alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho downstream ao tornar o tecido transparente e adequado para imageamento de alta resolução.
- Reprodutibilidade: Aborda a padronização de ensaios por meio de modificações passivas no CLARITY que melhoram a consistência nos resultados de clareamento.
- Reutilização da Plataforma: Permite avaliação escalonável de compostos ao criar câmaras de imageamento reutilizáveis compatíveis com microscopia confocal a laser.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Apoia o alinhamento translacional de biomarcadores ao permitir a imagem longitudinal de alterações estruturais em modelos intactos de medula espinhal e cérebro.
- Continuidade Pré-clínica: Conecta a descoberta à validação pré-clínica, fornecendo leituras estruturais tridimensionais aplicáveis a estudos de progressão da doença.
- Decisões com Base em Risco: Facilita decisões de avanço ao fornecer dados claros sobre a morfologia axonal e dendrítica para desvio mecanicista de riscos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a Descoberta Inicial até a Identificação de Fármacos e trabalhos Pré-clínicos, apoiando especificamente a verificação de hipóteses e a clarificação de vias na validação de alvos do SNC.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir a obtenção de imagens tridimensionais da morfologia neuronal e da conectividade em tecido SNC de camundongo intacto.
- Triagem: Descreve a prontidão do ensaio por meio da transparência tecidual alcançada com a remoção de lipídios e o ajuste do índice de refração com TDE.
- Análises: Destaca resultados quantitativos, como a reconstrução tridimensional de neurônios positivos para YFP, a arborização dendrítica e o rastreamento axonal, para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao fornecer biomarcadores estruturais em modelos relevantes de doenças do SNC, sem artefatos decorrentes do corte tecidual.
- Reutilização Empresarial: Apresenta a técnica como uma capacidade reutilizável por meio da construção de uma câmara de imagem durável, utilizando adesivo reutilizável e placas com fundo de vidro.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva por meio da redução da ambiguidade mecanicista na análise estrutural do SNC.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio de modificações no protocolo CLARITY passivo que eliminam a variabilidade eletroforética.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre prosseguir ou não, fornecendo dados estruturais tridimensionais confiáveis para reduzir riscos biológicos em estágios avançados em programas do SNC.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco por meio de imagens quantitativas de redes neuronais para validação de alvos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em histologia, polimerização de hidrogel e técnicas de clareamento lipídico.
- Necessita de instrumentação incluindo tubos de centrífuga, banhos-maria, dessecadores a vácuo e microscópios confocais a laser.
- Exige padronização entre equipes para troca de tampões, etapas de lavagem e procedimentos de casamento de índice de refração.
- Envolve considerações de adaptação entre diferentes sistemas modelo, pois os tempos variam de 2 a 4 semanas para medulas espinhais a 4 a 6 semanas para cérebros hemissecionados.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de expressão de proteínas fluorescentes ou imunomarcação para visualização, além de manipulação cuidadosa para evitar a formação de bolhas durante a montagem da câmara de imagem.
