Name: Geração de Microtumors Usando 3D Biogel Humano Sistema de Cultura e células de glioblastoma derivado do paciente para Kinomic Profiling e Testes resposta à droga (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprenda a gerar microtumores 3D de glioblastoma derivados de pacientes usando biogel humano para testes de drogas de alta vazão e perfilamento kinômico. Este método oferece uma plataforma realista para pesquisa de terapia personalizada em oncologia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Suportado pelo NIH conceder R21 (PI: C. Willey, CA185712-01), prêmio Tumor SPORE Brain (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) e contrato SBIR (PI: R. Singh, N43CO-2013-00.026).

NOTA: Todas as avaliações de terapia de xenotransplante foram feitas usando um modelo de tumor ortotópico de glioblastoma em um protocolo aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal. 1. Isolamento de células derivadas de GBM xenoenxertos de doentes <ol><li> Preparação dos Reagentes <ol><li> Re-constituem colagenase-I em água estéril até uma concentração de 5 mg / ml e de filtro estéril. Armazenar em alíquotas de 1 ml a -20 ° C (concentração final é de 50 ug / ml em 100 ml de solução enzimática). </li><li> Dissolve-se 100 ug Fator de Crescimento Epidérmico (EGF) em 2 mL estéril tamponada com fosfato salino (PBS). Armazenar em 100 ul (5 ug / 100 ul) alíquotas a -20 ° C para uma concentração final de 10 ng / ml. </li><li> Dissolve-se 100 ug de FGF-β em 2 ml de PBS estéril. Armazenar em 100 ul (5 ug / 100 ul) alíquotas a -20 ° C para uma concentração final de 10 ng / ml. </li><li> Adicionar a garrafa seguinte a um 500 ml de Neurobasal MedIA (NBM) para preparar completa NBM: 10 ml de B-27 sem suplemento de vitamina A, 5 ml de suplemento de N2, com 100 ul de EGF, 100 ul de factor de crescimento fibroblástico (FGF) -Basic, 5 mL de anfotericina B, 0,5 ml de gentamicina, 5 ml L-glutamina. </li><li> Preparar a solução de enzima fresca através da combinação de: 98,5 ml de PBS, 1 ml de colagenase-1, 0,5 ml de 10x de tripsina / EDTA e esterilizar por filtração através de filtro de poro de 0,22 um. </li><li> Preparar ou obter um pequeno volume estéril de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) / meio de cultura celular F12 com soro fetal bovino a 7% (FBS) e 1x PBS sem cálcio ou magnésio. </li></ol></li><li> Desagregação do tumor NOTA: rato nu / nu atímicos previamente injectados com células de tumor no flanco direito e deixou-se a partir de uma massa de tumor palpável é necessário para este procedimento. Nos exemplos mostrados aqui, usamos xenotransplante de células GBM derivado do paciente, JX10 e JX12 17. <ol><li> Esterilizar área de trabalho por pulverização clorexidina 2% e configurar sagacidade área de trabalhoinstrumentos necessários h / fontes incluindo mandril descartável, fórceps, bisturi, uma placa de Petri de vidro, a solução de enzima, PBS, e clorexidina (Ver Figura 2a). </li><li> Euthanize rato / camundongos portadores de um tumor no flanco. Alvo para uma taxa de deslocamento / min 20% de CO 2 utilizando 30% de CO 2. Após o rato mostra paragem respiratória, manter o fluxo de CO 2 durante cerca de 1 min (normalmente de 3 minutos no total). Os ratos são removidos da câmara e deslocamento cervical é realizada como uma confirmação eutanásia secundário. Pulverizar o animal com 3% de clorexidina para higienizar a pele. </li><li> Enquanto segura o mouse constante, fazer incisão na pele semi-circular ~ 1,5 cm de massa tumoral (flanco implantado tumor) utilizando um bisturi estéril descartável com lâmina # 11 começando cranial à massa tumoral e incisão em direção à barriga do rato e ao redor à extremidade caudal. </li><li> Reflita pele sobre a massa tumoral usando os dedos com tração suave na extremidade caudal da incisão e, em seguida, empurrar na pelesuperfície para elevar tumor ter melhor acesso sem tocar o tumor (ver Figura 2B). </li><li> Use dissecção romba com uma pinça para gentilmente massa tumoral livre da parede peritoneal e da pele (ver Figura 2C). </li><li> massa tumoral de transferência com uma pinça para placa de Petri de vidro estéril (não utilize pratos de plástico para evitar a quebra durante a picagem) e descartar corretamente carcaça e colocar estes instrumentos de lado. </li><li> Use novo conjunto de instrumentos esterilizados (bisturi com # 11 lâmina, pinça semi-curvo) para debridar tecido tumoral de tecido necrosado e anfitrião membranoso tumor cobrindo tecido conjuntivo. </li><li> Coloque solução de 15 ml de enzima em uma ventilada trypsinizing-frasco estéril com barra de agitação e começar a agitar lentamente no capô. </li><li> Num prato de Petri de vidro esterilizada, lavar tumores colhidos 3 - 5 vezes com PBS estéril para remover o excesso de sangue (possa derramar ou utilizar a seringa para lavá-los com o PBS). Incline ligeiramente prato e pipeta ou aspirar o material de lavagem. mince finely usando duas lâminas de bisturi # 11 (veja a Figura 2D). </li><li> Adicionar 14 ml de solução de enzima para tumor picada e pipeta suavemente para cima e para baixo 2 - 3 vezes. Transfira a mistura para ventilada trypsinizing balão e agitar lentamente durante 20 min. Prepare 5 tubos cónicos de 50 ml por adição de 1,5 ml de FBS a cada um, a fim de neutralizar a tripsina no passo 1.2.11. </li><li> Após 20 min, recolher 14 ml de solução de células da garrafa trypsinizing e adicionar a um tubo com FBS. Adicionar solução de enzima 14 ml fresco no balão e continuar agitação. </li><li> Centrifugar as células recolhidas a 150 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante. Adicionar 45 ml de completa NBM ao sedimento, misture delicadamente, e repetir a centrifugação para enxaguar a soro. Re-suspender sedimento em 5 ml NBM completa e mantenha em gelo. </li><li> etapas de colheita de células repita para um total de 5 colheitas, combinando todas as células colhidas em um único tubo cônico no gelo. </li><li> Coloque um filtro celular de 40 um sobre a parte superior de um tubo de 50 ml. Prep tele célula filtro pela passagem de 10 ml de DMEM / F12 + 7% de FBS e, em seguida, por meio de lavagem com 10 ml de PBS. </li><li> Adiciona-se lentamente a suspensão de células de filtro, permitindo que a escorrer através (Ver Figura 2M). Levante cuidadosamente a aba do filtro de células entre cada adição nova para quebrar qualquer vácuo e permitir que as células suspensas para passar livremente (veja a Figura 2 N). </li><li> Centrifugar a suspensão de células filtrada como anteriormente. Re-suspender em 10 ml completa NBM e contar para determinar o número total de células viáveis ​​utilizando 0,04% de azul de tripano e um hemocitómetro. células no gelo segure até que a geração microtumor. </li></ol></li></ol> 2. Tissue Alternate Desagregação Protocolo <ol><li> Automated Dissociator tecido e o sistema de desagregação. <ol><li> Coloque o tubo de desagregação no Dissociator celular, selecione a opção &quot;Tumor _02_02&quot; programa e começar a pressionar e correr para 32 seg. tubo de transferência para rotador, coloque em 37 ° C incubadora por 40 min. </li><li> Centrifugar as células suspensas-a 150 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante. Enquanto centrifugação das células, os reagentes acima definido para o tratamento da suspensão de células. Adicionar 10 ml NBM sem soro e suspensão suavemente triturado. </li><li> Após centrifugação, obter um pellet de células contendo ~ 10 - 30 x 10 6 células viáveis ​​(~ 0,3 mL). Re-suspendeu o sedimento em 10 ml de NBM isento de soro (Ver Figura 2O). Determine as células viáveis ​​por ensaio de exclusão (veja o passo 3.2.2). </li></ol></li></ol> 3. Microtumor Generation <ol><li> Preparação dos Reagentes <ol><li> Prepare completa NBM como em 1.1.4 e preparar neutralizado Alta Densidade Biogel humana (HuBiogel) (HDHG a 3 mg / ml) por protocolo interno. Biogel matrizes similares podem ser usadas também. </li></ol></li><li> Microtumor Produção e Cultura <ol><li> Obter células PDX recentemente dissociados como a suspensão de célula única em completa NBM, em gelo. </li><li> Misture a célula suspension com um volume igual de solução de azul de tripano (0,4% em PBS) e analisar usando hemacitómetro para determinar o número de células e a viabilidade por exclusão com azul de tripano 18. Retirar o volume necessário para gerar 50.000 células / microtumor onde o volume = (50.000 células / * # tumor tumores) / (contagem de células viáveis ​​/ 1 ml) e colocar num tubo cónico de fresco. </li><li> Concentra-se as células por centrifugação a 150 xg, durante 8 minutos, à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células com solução HDHG gelada num rácio final de 1 parte em células de FBS e 4 partes HDHG. </li><li> Usar uma pipeta de canais múltiplos electrónico para dispensar 10 ul por mistura pino célula-HDHG sobre uma placa de aço com 96 pinos (com revestimento hidrofóbico) para gerar microtumors (2 mm grânulos cada um contendo 50.000 células). </li><li> Coloque grânulos tumorais 3d dentro incubador de cultura de tecido (37 ° C, 5% de CO2, humidificada) durante 15 minutos para gelificar os grânulos. </li><li> Depois de a gelificação, transferir os microtumors (10 μ; L) para uma câmara de cultura de suspensão por encomenda (50 ml) ou prato grande volume de cultura (10 cm) contendo completa NBM utilizando a pipeta multi-canal electrónico e personalizado pino do dispositivo. </li><li> Depois de 1 - 2 dias em cultura de tecidos incubadora, transferir microtumors para placas de cultura de 96-poços contendo / poço usando uma de boca larga distribuição de pipeta e executar vários protocolos de ensaio e de análise de 50 ul de NBM. </li></ol></li><li> Tratamento de Drogas e Manutenção de microtumors <ol><li> Selecione concentrações finais para testes de drogas. NOTA: Se a droga tem eficácia conhecida em cultura 2D, 2x seleccione o IC50 como a concentração de dose média e seleccionar três diluições em série acima e abaixo por um total de 5 doses. Por exemplo, se o IC 50 é de 9 pM para o fármaco em cultura 2D, seleccionar 2 uM, 6 uM, 18 uM, 54 uM e 162 uM concentração final como para o teste de droga. </li><li> Preparar a solução de dosagem de drogas 2x em completa NBM de sulfoxi dimetilde (DMSO) de ações. Diluir solução de dosagem em meio DMSO a 1% para preparar uma dose de 5, 3 vezes diluições em série. </li><li> Adicionar 50 ul de solução de dosagem para a microtumor poços contendo 50 uL em placas de ensaio para atingir uma concentração final de DMSO de 0,5%. Repita o procedimento para cada repetição (por exemplo, 4) em cada dose do medicamento determinado em 3.3.1. </li><li> Manter em culturas de 37 ° C, 5% de CO2, humidificada de cultura de tecidos incubadora de 1 - 14 dias. culturas de alimentação duas vezes por semana, renovando meios de comunicação e solução de droga como acima. </li></ol></li></ol> 4. Análise morfológica e fenotípica de Microtumors <ol><li> Determinar a morfologia das células na microtumors utilizando coloração de células vivo padrão. <ol><li> Prepare Estoque 1 mM de calceína-AM em DMSO. Alíquotas e armazenar a -20 ° C. </li><li> Em intervalos de cultura desejadas (1, 7, e 14 dias), adicionar solução de Calceina-AM preparado em PBS (sem Ca / Mg) para placa de 96 poços durante 1 uM de concentração final. </li><li> Incubar20 minutos num banho a 37 ° C, 5% de CO2, incubadora humidificada, e imagem usando um microscópio de fluorescência a 2X, 4X, e 10X (excitação: 450-490 nm passa-banda, emissão: 515 nm passe longo, dicróico de 500 nm) . </li></ol></li><li> Crescimento Microtumor / ensaio de proliferação <ol><li> Dissolve-se pó de MTT em PBS (sem Ca / Mg) para preparar estoque de 12 mM. filtro estéril, alíquota, e armazenar a -20 ° C. </li><li> Em intervalos desejados de cultura (1, 7, e 14 dias), adicionar 20 ul de solução de MTT a placa de 96 poços em 100 ul de volume de cultura. Incubar 2 h numa incubadora de cultura de tecidos. </li><li> Preparar a solução de lise fresca de SDS a 10% em HCl 0,01 M e adicionar valor igual ao volume de cultura de placas. Incubar as placas selado durante a noite em 37 ° C incubadora. </li><li> Ler a absorvância a 570 nm utilizando um leitor de lamelas. </li></ol></li><li> Microtumor preparação para a análise Kinomic <ol><li> Preparar tampão de lise por pré-refrigeração a 4 ° C e em seguida adicionando uma proporção de 1: 100 de cada Pro 100xtein Fosfatase Inibidor (PPI) e 100x Proteína Inibidor de Protease (PI). Misture bem e manter em gelo. </li><li> Transferência microtumors 2 para cada um dos três 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Remover o sobrenadante e adicionar 40 ul de tampão de lise contendo PPI e PI a cada tubo e lise durante 30 min a 4 ° C. </li><li> amostras de pipetas vigorosamente para quebrar os grânulos tumorais. Centrifuga-se a 16000 xg durante 10 min a 4 ° C As amostras e armazenar a -80 ° C até à análise kinomic. </li></ol></li></ol> 5. Kinomic Profiling de Microtumors <ol><li> A proteína de tirosina-quinase (PTK) perfilamento <ol><li> Reagentes de descongelamento (10x proteína cinase (PK) de tampão e 2% de albumina de soro bovino (BSA)) a 4 ° tampão C Carga PK (300 ul de estoque de tampão 10x PK em 2,7 ml de dH2O) para a seringa na posição # 2 sobre a caracterização plataforma. </li><li> Abra o programa de software de ensaio de cinase e carregar o arquivo protocolo de PTK e pressione &quot;Iniciar&quot;, anotando amostras dentro softwsão programa depois de chips de digitalização. Colocar fichas na plataforma de perfis e de carga 25 ul de 2% albumina sérica bovina (BSA) por matriz e pressione LOAD para iniciar o protocolo controlado por software de bloqueio etapa. </li><li> Dilui-se 6 uM de estoque de 100 mM de ATP, com 54 uL de dH2O para fazer 10 mM de trifosfato de adenosina (ATP). Quando o software começa o 3º e etapa de lavagem final (visível na tela) trazem 15 ug de lisado trouxe até 28 ul com dH2O, misturar e adicionar à matriz. </li><li> Prepare PTK mix master (MM) (para até 12 amostras). Adicionar 32,6 uL de dH2O para reconstituir ditiotreitol (DTT) e adiciona-se 6 ul de DTT, e 60 ul de solução 10x PK, para o tubo de PTK-MM1 (já contém 60 ul de BSA a 10x). </li><li> Espere até prompt de &#39;Load&#39; no software de ensaio de cinase aparece em seguida, adicione 126 mL de PTK-MM1, aditivo PTK 60 ul e 60 ul 10 mM ATP para MM2 (contém previamente aliquotas anticorpo PY20 FITC 4,5 ul) e misturar.Adicionar 16 ul desta mistura de PTK mestre para cada tubo de amostra e mistura lisado pipeta de 5 vezes. </li><li> Certifique-se de tampa de vidro é limpo e, em seguida, adicionar 35 mL de lisado / master mix por matriz, feche a tampa do carrossel, e pressione o botão LOAD. </li></ol></li><li> Serina / treonina quinase (STK) Profiling: <ol><li> reagentes de descongelamento (10x tampão PK, 10x tampão STK, e 2% de BSA) a 4 ° C. PK tampão de carga (300 ul em 2,7 ml de dH 2 0) para a posição da seringa # 1, 01:10 tampão e STK (300 ul em 2,7 ml de dH 2 0) para a posição da seringa 2 #. </li><li> Abra o programa de software de computador de ensaio de cinase e carregar o arquivo de protocolo STK e prima START, anotando amostras dentro do programa depois de chips de digitalização. Colocar fichas na plataforma de perfis e de carga 25 ul de BSA a 2% por matriz e pressione LOAD para começar a etapa de protocolo de bloqueio controlado por software. </li><li> Diluir 6 M de ATP 100 mM com 54 mL dH2O Durante final (3º) mix etapa de lavagem2 ug de lisado e trazer até 32,6 ul com dH2O, misturar e adicionar à matriz. </li><li> Faça STK mistura principal: Adicionar 70 ul 10x PK ao tubo STK-MM1 (contém 7 ul 100x BSA), e depois adicionar 42 mL de dH2O ao tubo STK-MM1. </li><li> Espere até prompt de &#39;Load&#39; no software de ensaio de cinase, em seguida: Adicionar 18 ul de ATP 10 mM a STK-MM1, e adicionar 9 ul MM1 para cada ligado amostra. Misture bem. </li><li> Certifique-se de tampa de vidro é limpo e adicionar 35 ul de lisado / master mix por matriz, feche a tampa do carrossel, e pressionar LOAD. </li><li> Durante definitiva (3ª) LAVAGEM adicionar anticorpo secundário 1,05 ul STK-FITC ao tubo DMAB (contém 3,03 ul STK mistura anticorpo primário), adicione 39,6 ul AB Buffer para DMAB, adicione 356,0 mL de dH2O para DMAB, adicionar 30 mL de DMAB para cada matriz, e pressione CARGA . </li></ol></li><li> Análise de Dados 19,20 Kinomic <ol><li> Abra o software de análise e carregar a imagem Análise App. Secionar pasta de imagens contendo imagens de matriz inteira com código de barras e com carimbo de tempo para os dados PTK ou STK, o número combinado arquivo de layout matriz selecione artigo (86.312 de PTK e 87102 para STK), ea carga gerada anteriormente matriz anotação Arquivo. </li><li> Verifique gridding correta de todas as imagens e executar Tempo de Exposição Escala App. Estatisticamente comparar valores log2 transformado exposição / inclinação, e validar com pré-lavagem curvas cinéticas 19-21. </li><li> Executar o software de previsão quinase a montante para consultar perfis kinomic alterados entre as condições para cinases a montante 22,23. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ohgaki, H., Kleihues, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population-based+studies+on+incidence%2C+survival+rates%2C+and+genetic+alterations+in+astrocytic+and+oligodendroglial+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).</li>
<li>Wen, P. Y., Kesari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+gliomas+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Malignant gliomas in adults.</a> N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).</li>
<li>Thumma, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pretreatment+clinical+factors+on+overall+survival+in+glioblastoma+multiforme%3A+a+Surveillance+Epidemiology+and+End+Results+%28SEER%29+population+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis.</a> World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).</li>
<li>Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+epidermal+growth+factor+receptor+signalling+networks+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma.</a> Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).</li>
<li>Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-microarray+analysis+of+brain+cancer%3A+molecular+classification+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).</li>
<li>Verhaak, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genomic+analysis+identifies+clinically+relevant+subtypes+of+glioblastoma+characterized+by+abnormalities+in+PDGFRA%2C+IDH1%2C+EGFR%2C+and+NF1%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1.</a> Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).</li>
<li>De Witt Hamer, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+profile+of+human+malignant+glioma+is+altered+early+in+primary+cell+culture+and+preserved+in+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids.</a> Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).</li>
<li>Shankavaram, U. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+indicates+orthotopic+xenograft+of+glioma+cell+lines+simulate+a+subclass+of+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma.</a> J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).</li>
<li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture%3A+biology%27s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).</li>
<li>Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+3D+biomimetic+models+to+understand+the+behavior+of+glioblastoma+multiforme+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells.</a> Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+scaffold+design+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Porous scaffold design for tissue engineering.</a> Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).</li>
<li>Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+hydrogels+as+synthetic+extracellular+matrix+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials.</a> Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>Yoshino, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+differentiation+of+a+transfected+Schwann+cell+line+is+altered+by+an+artificial+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane.</a> Glia. 3 (5), 315-321 (1990).</li>
<li>Uab Research Foundation. Biologically active native biomatrix composition. US patent. , 7727550 B2 (2010).</li>
<li>Sarkaria, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+orthotopic+xenograft+model+for+assessing+the+effect+of+epidermal+growth+factor+receptor+amplification+on+glioblastoma+radiation+response%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response.</a> Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).</li>
<li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinomic+exploration+of+temozolomide+and+radiation+resistance+in+Glioblastoma+multiforme+xenolines%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother+Oncol%22%5BJournal%5D)">Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines.</a> Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).</li>
<li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinomic+profiling+of+electromagnetic+navigational+bronchoscopy+specimens%3A+a+new+approach+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine.</a> PLoS One. 9 (12), 116388(2014).</li>
<li>Jarboe, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinomic+profiling+approach+identifies+Trk+as+a+novel+radiation+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother+Oncol%22%5BJournal%5D)">Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator.</a> Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).</li>
<li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Throughput+Kinomic+Profiling+of+Human+Clear+Cell+Renal+Cell+Carcinoma+Identifies+Kinase+Activity+Dependent+Molecular+Subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes.</a> PLoS One. 10 (9), 0139267(2015).</li>
<li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinomic+Alterations+in+Atypical+Meningioma%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Research+Archives%22%5BJournal%5D)">Kinomic Alterations in Atypical Meningioma.</a> Medical Research Archives. 3, (2015).</li>
<li>Hothi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+chemical+screens+identify+disulfiram+as+an+inhibitor+of+human+glioblastoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells.</a> Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).</li>
<li>Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screening+of+Patient-Derived+Cultures+Reveals+Potential+for+Precision+Medicine+in+Glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma.</a> ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).</li>
<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+personalized+medicine+with+a+three-dimensional+micro-scale+perfusion-based+two-chamber+tissue+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system.</a> Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).</li>
<li>Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glioma+cell+phenotype+in+3D+matrices+by+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).</li>
<li>Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+strategies+to+mimic+the+glioblastoma+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment.</a> Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).</li>
<li>Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Derived+Xenografts+as+a+Model+System+for+Radiation+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Radiat+Oncol%22%5BJournal%5D)">Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research.</a> Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).</li>
</ol>

R.S. e R.S.S. são funcionários da Vivo Biosciences. J.C.A. é parcialmente financiado pelo UAB Kinome Core.

As etapas críticas no âmbito do protocolo predominantemente relacionados com microtumor geração, bem como a administração de drogas e de manutenção. Porque as contas microtumor são frágeis e facilmente rasgado, extremo cuidado é necessário em ambas as fases de desenvolvimento de um ensaio e manutenção. Se ocorrer um erro durante qualquer um destes processos, a interpretação experimental pode ser comprometida, causando extensão ou repetição desnecessária dos experimentos ou mesmo exclusão de dados. <p class="jove_con...

Os tumores cerebrais primários mais comuns intracranianas malignos são astrocitomas grau III e grau IV glioblastoma multiforme (glioblastoma ou GBM). Estes tumores oferecer prognósticos pobres com sobrevida de um ano médio entre 12 - 15 meses, com terapias atuais para GBM no 1-3 EUA. multimodalidade terapias incluem cirurgia, radiação, e quimioterapia, incluindo temozolomida (TMZ) e agentes alvo-quinase. sinalização cinase é frequentemente desreguladas na MBG, incluindo subconjuntos de tumores com amplificação ou mutações de activação do Factor de Crescimento Epidérmico receptor (EGFR), os aumentos no Crescimento Derivado de Plaquetas do Receptor do Factor (PDGFR) de sinalização, o aumento da fosfatidil-inositol-3-quinase (PI3K) e tumor angiogénico apoio sinalização através do factor de Crescimento endotelial Vascular receptor (VEGFR), bem como outras vias de cinase orientada 4-6. Current in vitro e em modelos in vivo freqüentemente perdem estas alterações representativos &lt;sup&gt; 7. Além disso, a caracterização genética não ofereceu os benefícios esperados que podem refletir o fato de que as alterações genéticas e epigenéticas nem sempre prever as mudanças no nível de atividade da proteína, onde a maioria das quinase agentes visando atuar diretamente, e onde terapias com outros mecanismos de ação pode agir indiretamente. A linha de células imortalizadas tradicional que pode ser várias passagens ad infinitum tem sido o padrão para testes de drogas devido à sua facilidade de manutenção e reprodutibilidade. No entanto, este modelo sofre de um ambiente de crescimento alta de nutrientes (e artificial) que seleciona para as células que diferem muito do tumor original crescendo rapidamente. Como tal, tem havido um interesse considerável no desenvolvimento de sistemas modelo mais realistas que reflectem um sistema biológico do tumor mais complexo como está presente no paciente. xenoenxertos de tumor desenvolvido directamente a partir de um tumor primário crescido em ratos ( &quot;xenoline,&quot; xenoenxerto derivado do paciente ou PDX) provide um sistema modelo mais reflexivo, particularmente no contexto de cancro terapêutica, como eles são sentidos para prever de forma mais confiável de sucesso clínico. 8 Apesar da biologia mais reflexivo, esses modelos são caros e são difíceis de estabelecer e manter. Além disso, eles não são passíveis de estudos de alta produtividade. A necessidade de melhor desenvolver modelos biológicos que refletem com mais precisão as alterações moleculares nos tumores primários, e ao perfil e testar esses modelos utilizando medidas diretas de atividade quinase, não substituto marcadores genéticos, é claro. É bem reconhecido que ao contrário de duas dimensões (2D) culturas em monocamada, 3D ou modelos de ensaio multicelulares pode fornecer mais fisiologicamente relevantes terminais 9-11. cultura 3D abordagens comuns envolvem microveï¿½ulos revestido de matriz e formação esferóide celular. esferóides de tumor pode ser gerado através da agregação celular utilizando balão giratório, placa pHEMA e pendurando técnicas de gota. Limitações para tabordagens stas incluem: incapacidade de algumas células para formar esferóides estáveis, a variabilidade no crescimento e desafios com mistura de tipos celulares. Em alternativa, muitos sintético (hidrogel, polímero) e animal derivada de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matriz de sarcomas de rato, o colagénio de bovino) matrizes têm sido desenvolvidos para a cultura 3D estuda 12-14. Matriz de rato EHS é extensivamente utilizado, mas conhecido para promover o crescimento e a diferenciação celular in vitro e in vivo 15. A fim de replicar a biologia do tumor 3D, um sistema de biomatriz humano foi desenvolvido pelo Dr. Raj Singh et ai. 16. O biogel humana livre de fator natural, permite o crescimento de cultura de andaimes 3D (esferas, discos), que suportam o cultivo de longo prazo de vários tipos de células. Uma série de projetos 3D cultura Biogel humana são estabelecidos para estudar o crescimento do tumor, aderência, angiogênese e invasão propriedades. Vantagens e propriedades de Biogel humano quando comparado com comumgéis EHS rato estão resumidas na Tabela 1 e Tabela 2. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Fonte: </td><td> Âmnions Humano (tecido em pool) livre de patógenos, o IRB-exempt / aprovado </td></tr><tr><td> Natureza ECM: </td><td> Não desnaturada Biogel (GLP-produção) </td></tr><tr><td> Chave componentes: </td><td> Col-I (38%), a laminina (22%), Cl-IV (20%), COL-III (7%), entactina HSPG &amp; (&lt;3%) </td></tr><tr><td> -GF livre: </td><td> Indetectável EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-angiogênico, não-tóxico) </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Propriedades de Biogel Humano, em comparação com comuns EHS Gel. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Biogel humana </td><td> géis EHS </td></tr><tr><td> matriz natural do ser humano </td><td> matriz do mouse reconstituído </td></tr><tr><td> crescimento e diferenciação celular controlada </td><td> Pode promover o crescimento e diferenciação celular </td></tr><tr><td> a expressão do gene fisiológica </td><td> a expressão do gene variável </td></tr><tr><td> 3D tecido-como modelo de cultura </td><td> modelo de cultura à base de chapa </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Vantagens de Biogel Humano, em comparação com comuns EHS Gel.

<table><tbody><tr><td>Colagenase-I&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CO130</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>15400-054&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>1x concentração final</td></tr><tr><td>Suplemento B-27 sem Vitamina A</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td>1x concentração final</td></tr><tr><td>FGF humano recombinante-basic</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0266</td><td>concentração final</td></tr> <tr><td>de 10 ng/mlHumano recombinante</td><td>EGF Life Technologies</td><td>PGH0315</td><td>concentração final de 10 ng/ml</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Corning Cellgro Mediatech</td><td>25-005-CI</td><td>concentração final de 2 mM</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Omega Scientific</td><td>FG-70</td><td>2.5 &micro; g/ml de concentração final</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Omega Scientific</td><td>PS-20</td><td>100 U/ml Penicilina G, 100 &micro; g/ml Concentração final de estreptomicina</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td>50 ng/ml concentração final</td></tr><tr><td>MTT</td><td>Life Technologies</td><td>M6494</td><td>preparado para 5 mg/ml em PBS e filtrado estéril, 1 mg/ml em poço</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher</td><td>BP166</td><td>para tampão de lise MTT, preparado para 10% em 0,01&nbsp; M HCl, 5% em HCl de poço</td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>A144SI-212</td><td>para tampão de lise MTT, preparado para 0,01&nbsp; M com SDS, 5 mM em poço</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C1430</td><td>1 mM em estoque DMSO, 2&nbsp; &micro; M em solução de coloração PBS, 1&nbsp; &micro; M em</td></tr><tr><td>bem Halt' s Coquetel de inibidores de proteína fosfatase</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>78420</td><td>Proporção 1:100 em MPER&nbsp;</td></tr><tr><td>Inibidor de Protease da Halt's Protein</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>87786</td><td>Proporção 1:100 em MPER</td></tr><tr><td>Reagente de Extração de Proteína de Mamíferos (MPER)</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>PI78501</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>BP231</td><td>para dissolução de calceína AM e compostos</td></tr> Solução <tr><td>salina tamponada com fosfato sem Ca/Mg</td><td>Lonza</td><td>17-517Q</td><td>diluído a 1x com água ultrapura MiliQ e filtrado estéril (para cultura de células)</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco com Ca/Mg</td><td>Corning Cellgro Mediatech</td><td>20-030-CV</td><td>diluído a 1x com água ultrapura MiliQ (para lavagem pré-fixação)</td></tr><tr><td>Formalina tamponada neutra a 10% Protocolo</td><td></td><td>032-060</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Alta densidade Hubiogel</td><td>Vivo Biosciences</td><td>HDHG-5</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de proteína fosfatase de Halt</td><td>Pierce</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de protease de proteína de Halt</td><td>Pierce</td><td>87786</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de extração de proteína de mamífero (MPER)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78501</td><td></td></tr><tr><td>Proteína tirosina quinase (PTK) Array Chip de perfil</td><td>PamGene</td><td>86312</td><td></td></tr><tr><td>Tampão PTK quinase</td><td>PamGene</td><td>36000</td><td>300 &micro; l 10x estoque de buffer PK em 2.7&nbsp; ml dH2O, número de catálogo do kit de reagentes PTK</td></tr><tr><td>ATP</td><td>PamGene</td><td>36000</td><td>número de catálogo para kit de reagentes PTK</td></tr><tr><td>PY20- anticorpo conjugado com FITC</td><td>PamGene</td><td>36000</td><td>número de catálogo para kit de reagentes PTK</td></tr><tr><td>Aditivo PTK</td><td>PamGene</td><td>32114</td><td></td></tr><tr><td>Tubo PTK-MM1 (10x BSA)</td><td>PamGene</td><td>36000</td><td>número de catálogo para kit</td></tr> <tr><td>de reagentes PTKChip de perfil de matriz de serina/treonina quinase (STK)</td><td>PamGene</td><td>87102</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de quinase STK</td> Número de catálogo <td>PamGene</td><td>32205</td><td>para kit de reagentes STK</td></tr><tr><td>Mistura de anticorpos primários STK (tubo DMAB)</td>Número de catálogo <td>PamGene</td><td>32205</td><td>para kit de reagentes STK</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário conjugado com FITC</td><td>PamGene</td><td>32203</td><td></td></tr><tr><td>Tubo STK-MM1 (100x BSA)</td><td>PamGene</td><td>32205</td><td>número de catálogo para kit de reagentes STK</td></tr><tr><td>Tampão de anticorpos STK</td><td>PamGene</td><td>32205</td><td>número de catálogo para kit de reagentes STK</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#11 Lâminas, estéreis</td><td>Fisher</td><td>3120030</td><td></td></tr><tr><td>#3 cabos de bisturi, estéreis</td><td>Fisher</td><td>08-913-5</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri de vidro de 100 mm</td><td>Fisher</td><td>08-748D</td><td></td></tr><tr><td>Pinça semicurvada</td><td>Fisher</td><td>12-460-318</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de tripsinização</td><td>Fisher</td><td>10-042-12B</td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético</td><td>Fisher</td><td>14-490-200</td><td></td></tr><tr><td>Barra de agitação de 3/4"</td><td>Fisher</td><td>14-512-125</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de célula B-D&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>#352340</td><td></td></tr><tr><td>B-D 50 ml Tubo de centrífuga</td><td>Fisher</td><td>#352098</td><td></td></tr><tr><td>PamStation 12</td><td>PamGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioNavigator 6.0 software de análise kinômica&nbsp;</td>Software de ensaio de quinase <td>PamGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evolve</td> Software <td>PamGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UpKin App (previsão de quinase upstream)</td><td>PamGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Cultura de Células Rotativas (RCCS)</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-D</td><td>com HARV descartável de 10 ml</td></tr></tbody></table>

geração de microtumors usando 3d biogel humano sistema de cultura e células de glioblastoma derivado do paciente para kinomic profiling e testes resposta à droga

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

O uso de xenoenxertos derivados de pacientes para modelar cânceres forneceu informações importantes sobre a biologia do câncer e a capacidade de resposta a medicamentos. No entanto, eles são demorados, caros e trabalhosos. Para superar esses obstáculos, muitos grupos de pesquisa recorreram a culturas esferóides de células cancerígenas. Embora úteis, os esferoides ou agregados tumorais não replicam as interações célula-matriz encontradas in vivo. Como tal, as abordagens de cultura tridimensional (3D) utilizando um andaime de matriz extracelular fornecem um sistema de modelo mais realista para investigação. A partir de xenoenxertos subcutâneos ou intracranianos, o tecido tumoral é dissociado em uma única suspensão celular semelhante às neuroesferas de células-tronco cancerígenas. Essas células são então incorporadas a uma matriz extracelular derivada de humanos, biogel humano 3D, para gerar um grande número de microtumores. Curiosamente, os microtumores podem ser cultivados por cerca de um mês com alta viabilidade e podem ser usados para testes de resposta a medicamentos usando ensaios de citotoxicidade padrão, como brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) e imagens de células vivas usando Calcein-AM. Além disso, eles podem ser analisados por imuno-histoquímica ou colhidos para perfil molecular, como perfil cinômico de alto rendimento baseado em matriz, que também é detalhado aqui. Os microtumores 3D, portanto, representam um sistema modelo versátil de alto rendimento que pode replicar mais de perto a biologia tumoral in vivo do que as abordagens tradicionais.

Mostrámos que o sistema de cultura 3D Biogel suporta o crescimento a longo-termo e função de vários tipos de células. Neste projeto colaborativo, xenolines GBM derivado do paciente (PDX) são utilizados para a produção de centenas de microtumors. As células dissociadas (3 x 10 5) ou neuroesferas (40 - 50) foram incluídos em grânulos Biogel (2 mM) e após a gelificação rápida que são cultivadas num biorreactor de costume NB-media preenchido. foram determinados a viabilidade celul...

Xenoenxertos derivados de pacientes de glioblastoma multiforme podem ser miniaturizados em microtumores vivos usando o sistema de cultura de biogel humano 3D. Este ensaio tumoral 3D semelhante ao in vivo é adequado para testes de resposta a medicamentos e perfis moleculares, incluindo análise cinômica.

Geração de Microtumors Usando 3D Biogel Humano Sistema de Cultura e células de glioblastoma derivado do paciente para Kinomic Profiling e Testes resposta à droga

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

O objetivo geral deste sistema de cultura de microtumores tridimensionais de glioblastoma derivado de paciente é permitir testes de fármacos em alta escala com um ensaio correspondente de perfil molecular, como o teste cinômico. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do câncer, como, por que certas terapias funcionam bem em um tumor de determinado paciente, mas não em outro? A principal vantagem desta técnica é que ela fornece um sistema de cultura tumoral miniaturizado, porém realista, adequado para testes terapêuticos.Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois o manuseio de células de xenoenxertos derivadas de pacientes não é como o manuseio de células tumorais imortalizadas e bem estabelecidas. Isso se deve à sua fragilidade e sensibilidade às mudanças nas condições de cultivo. A demonstração visual deste método é essencial, já que as etapas de geração de microtumores são difíceis de aprender apenas por meio de descrição, devido ao seu método de produção único e complexo.A demonstração do procedimento de desagregação do tumor será feita por Catherine Langford, técnica sênior e gerente do laboratório. A demonstração dos procedimentos de geração de microtumores e administração de fármacos será feita por Rachael Shevin, técnica do meu laboratório. Usando pinça, realize uma dissecação romba para soltar suavemente a massa tumoral da parede peritoneal e da pele, e transfira a massa tumoral para uma placa de Petri de vidro estéril.Em seguida, utilize um bisturi estéril com lâmina número 11 e pinças estéreis semiflexíveis para desbridar o tecido tumoral de qualquer tecido necrótico e tecido conjuntivo conectivo do hospedeiro em forma de membrana. Lave os tumores limpos com RPMI estéril de três a cinco vezes para remover o excesso de sangue, inclinando suavemente o recipiente entre cada lavagem para remover o líquido de lavagem. Após a lavagem final, utilize duas lâminas de bisturi número 11 para picar finamente os tumores.Em seguida, utilize pin&ccedil;as semicurvadas est&eacute;reis para transferir os tumores para um tubo de dissocia&ccedil;&atilde;o contendo solu&ccedil;&atilde;o enzim&aacute;tica. Coloque o tubo em um dissociador celular e selecione o programa Tumor 2. Clique em Iniciar para executar o dissociador por 37 segundos.Em seguida, transfira o tubo para um rotador e coloque o rotador em um incubador a 37 graus Celsius por 40 minutos. Ao final da incubação, coloque o tubo novamente no dissociador e execute o programa Tumor 3 por 37 segundos. Ao final do programa, centrifugue as células e re-suspenda o pellet em 10 mililitros de RPMI livre de soro com mistura suave.Em seguida, carregue lentamente as células em um filtro celular de 40 micrômetros em um novo tubo de 50 mililitros e permita que a suspensão escorra através do filtro por gravidade. Levante suavemente a aba do filtro celular entre cada nova adição de células, quebrando o vácuo entre o filtro e o tubo para permitir que as células suspensas passem livremente pela malha. Quando todas as células tiverem sido filtradas, centrifugue a suspensão de células isoladas e re-suspenda o pellet em 10 mililitros de meio Neurobasal completo.Em seguida, determine o número de células viáveis pelo método de exclusão com azul de tripano e coloque as células no gelo. Para gerar os microtumores, centrifugue as células dissociadas da linhagem xenógena de glioblastoma derivada de paciente e re-suspenda o pellet em 50.000 células por dois microlitros de soro bovino fetal (FBS). A seguir, dilua as células em biogel humano de alta densidade gelado na proporção de uma parte de células para quatro partes de biogel.Em seguida, utilize uma pipeta eletrônica multicanal para dispensar 10 microlitros da mistura celular por pino em uma placa de aço de 96 pinos com revestimento hidrofóbico. É importante evitar bolhas ao misturar as células, o meio e o biogel, ao mesmo tempo em que se trabalha rapidamente e com eficiência para gerar os microtumores antes que o biogel humano comece a solidificar nos pinos. Quando todos os microtumores tiverem sido semeados, transfira os tumores tridimensionais para uma incubadora de cultura de tecidos por 20 minutos para gelificar as microgotas tumorais.No final da incubação, transfira os microtumores para uma placa de cultura de 10 centímetros contendo Meio Neurobasal Completo e retorne os tumores ao incubador. Após um ou dois dias, utilize uma pipeta de dispensação de boca larga para transferir os microtumores para os poços de uma placa de cultura de 96 poços, contendo 50 microlitros de Meio Neurobasal por poço, e adicione 50 microlitros da solução de dosagem apropriada a cada poço. Mantenha os microtumores tratados no incubador de cultura de tecidos por um a 14 dias, alimentando os tumores duas vezes por semana com meio fresco e solução do fármaco.Para avaliar a morfologia celular do microtumor, nos dias um, sete e catorze do cultivo, marque os microtumores com um micromolar de Calcein-AM recém-diluído por poço no incubador de cultivo de tecidos durante 20 minutos. Em seguida, visualize os tumores por microscopia de fluorescência com aumentos de dois, quatro e 10x. Para avaliar o crescimento do microtumor, nos dias um, sete e 14, trate os cultivos com 20 microlitros de MTT recém-preparado por duas horas no incubador de cultivo de tecidos.No final da incubação, lise os tumores com tampão de lise SDS a 10%, recém-preparado, em uma proporção de um para um em relação aos volumes dos poços de cultura, e feche a placa. Em seguida, incube os microtumores no tampão de lise durante a noite a 37 graus Celsius e leia a absorbância em 570 nanômetros em um leitor de placas múltiplas na manhã seguinte. Por meio da imagem de células vivas com Calcein-AM, conforme acabou de ser demonstrado, pode-se avaliar o crescimento celular e a viabilidade dos microtumores, bem como os efeitos das terapias medicamentosas sobre essas funções.Como observado, microtumores não tratados e microtumores com resistência conhecida ao tratamento com fármaco experimental exibem um padrão de crescimento contínuo ao longo de um período de cultura de duas semanas. Essas células tumorais sensíveis ao TMZ, no entanto, demonstram uma redução no crescimento celular ao final da cultura em resposta à maior concentração de tratamento com TMZ, conforme avaliado pelo ensaio MTT. Curiosamente, a sinalização de quinases em microtumores resistentes ao TMZ revela uma série de peptídeos com intensidades significativamente alteradas após o tratamento com TMZ a 10 micromolar.De fato, neste experimento representativo, a análise desses perfis cinômicos alterados utilizando software de predição de cinases upstream identificou alterações específicas nas cinases tirosina-SYK, LCK e CTK, bem como em várias intensidades de cinases serina/treonina, sugerindo potenciais novos alvos terapêuticos que podem ajudar a superar a resistência ao tratamento do tumor. Uma vez dominada, a desagregação do tumor pode ser concluída em duas horas, se realizada corretamente. As técnicas de geração de microtumores e administração de fármacos podem ser concluídas em um total de três horas, se realizadas adequadamente.No futuro, esse sistema de modelo poderá ser usado como um sistema de avatar tipo probando, no qual o tumor de um paciente é associado molecularmente a uma biblioteca existente de microtumores derivados de pacientes, a fim de orientar o clínico sobre a melhor escolha de terapia.

generation-microtumors-using-3d-human-biogel-culture-system-patient

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Neste vídeo, geramos microtumores a partir de células tumorais derivadas de pacientes usando biogel humano 3D. Esses microtumores se assemelham muito ao microambiente tumoral in vivo e servem como plataformas potenciais para testes de drogas.

Geração de Microtumores: Uma Técnica de Cultura In Vitro para Cultura de Microtumores 3D para Analisar a Resposta ao Tratamento Medicamentoso

Protocolo para propagação de amostras cirúrgicas de glioma de alto grau dissociadas em meio neuroesfera livre de soro para selecionar para células com fenótipo de células-tronco cancerosas. Para espécimes que não crescem como neurosferas, um protocolo alternativo é sugerido. Uma técnica de incorporação de parafina para manter a arquitetura da neurosfera 3D para imunocytoquímica é descrita.

Otimização da cultura celular glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para uso em modelos animais clinicamente relevantes e imunoquímica 3D

Neurospheres crescidos como 3D culturas constituem uma poderosa ferramenta para estudar a biologia de glioma. Aqui nós apresentamos um protocolo para realizar a imuno-histoquímica, mantendo a estrutura 3D de glioma neurospheres através da incorporação de parafina. Esse método permite a caracterização das propriedades de glioma neurosphere como stemness e diferenciação neural.

Avaliação de biomarcadores em Glioma por imuno-histoquímica na parafina Glioma 3D Neurosphere culturas

Aqui, descrevemos um ensaio de invasão fácil de usar para glioblastoma. Este ensaio é adequado para células-tronco de glioblastoma. Uma macro Fiji para fácil quantificação de invasão, migração e proliferação também é descrita.

Um modelo esferóide 3D para glioblastoma

Aqui, descrevemos um método de geração de organoides de glioblastoma (GBM) a partir de amostras de pacientes primários ou culturas celulares derivadas do paciente e mantê-los até a maturidade. Esses organoides GBM contêm populações de células fenotipicamente diversas e recriam microambientes tumorais ex vivo.

Manutenção da Diversidade Celular Glioblastoma Humano Ex vivo usando cultura organoide tridimensional

O presente protocolo descreve uma plataforma experimental para avaliar os efeitos de pistas mecânicas e bioquímicas sobre as respostas quimioterápicas de células glioblastoma derivadas pelo paciente em culturas mímicas de matriz 3D usando um dispositivo de iluminação UV feito sob medida facilitando o fotocrosslinking de alto rendimento de hidrogéis com características mecânicas incompáveis.

Matrizes de hidrogel permitem aumento de rendimento para efeitos de triagem de componentes matriciais e terapêuticos em modelos de tumor 3D

Aqui, descrevemos um protocolo abrangente para gerar e utilizar organoides de glioblastoma projetados em laboratório (LEGO) para investigar dependências genótipo-fenótipo e rastrear possíveis medicamentos para tratamento de glioblastoma.

Cultura de organoide de glioblastoma projetada em laboratório e triagem de drogas

Aqui, estabelecemos uma plataforma de perfil metabólico integrando esferóides de glioma tridimensionais (3D) e normalização baseada em imagem por meio de análise de fluxo extracelular. Essa abordagem permite uma avaliação mais precisa das respostas metabólicas do tumor aos tratamentos medicamentosos e fornece informações sobre os possíveis mecanismos de resistência.

Avanços no perfil metabólico de esferoides tridimensionais de tumores cerebrais para triagem de drogas

Apresentamos um modelo de migração de glioblastoma 3D usando gliomasferas magnéticas derivadas de pacientes geradas a partir de tumores recém-diagnosticados e recorrentes. Esta plataforma permite visualização da dinâmica de migração específica do paciente e avaliação da eficácia terapêutica. O ensaio pode ser multiplexado após a migração para avaliar a localização e os padrões de expressão da proteína.

Ensaio de Migração de Glioblastoma 3D Reproduzível com Localização Magnética de Esferoides Mediadas por Nanopartículas sob Condições Hipóxicas

Este protocolo de vídeo demonstra a aplicação do corante fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) para a identificação e separação de diferentes sub-populações de células em glioblastoma humano com base na frequência de divisão celular.

Identificação e isolamento de células em divisão lento no glioblastoma humano usando Carboxifluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE)

Aprenda a gerar microtumores 3D de glioblastoma derivados de pacientes usando biogel humano para testes de drogas de alta vazão e perfilamento kinômico. Este método oferece uma plataforma realista para pesquisa de terapia personalizada em oncologia.

Geração de Microtumors Usando 3D Biogel Humano Sistema de Cultura e células de glioblastoma derivado do paciente para Kinomic Profiling e Testes resposta à droga (Vídeo) | JoVE Journal

Geração de Microtumors Usando 3D Biogel Humano Sistema de Cultura e células de glioblastoma derivado do paciente para Kinomic Profiling e Testes resposta à droga

Explorar mais vídeos