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18 de maio de 2016
Aqui, um protocolo para a colheita, manter, e tratar rato pequenas Organóides intestinais com padrões de agentes patogénicos associados moleculares (PAMPs) e Listeria monocytogenes é descrito, bem como a ênfase na expressão de genes e técnicas de normalização adequada para a proteína.
O objetivo geral deste procedimento é medir os efeitos do desafio patogênico em organoides do intestino delgado, com ênfase em técnicas de normalização em relação ao número total de células. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de imunologia inata e mucosal, fornecendo um meio para investigar in vitro as interações entre patógenos e células epiteliais intestinais. Essencial para este procedimento é o método de normalização em relação ao número total de células, uma necessidade ao medir proteínas secretadas por organoides por meio de técnicas como ELISA. Para colher criptas intestinais de camundongos para cultura de organoides, comece usando uma lâmina de vidro estéril para remover suavemente as vilosidades da superfície luminal do intestino delgado. Em seguida, use tesoura de dissecação para cortar o tecido em tiras de 1-2 centímetros de comprimento. Coloque as tiras em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 mililitros de PBS gelado. Misture o conteúdo por inversão suave e deixe o material tecidual sedimentar no fundo do tubo. Em seguida, aspire o PBS e lave as tiras mais três vezes com 10 mililitros de PBS fresco, cada vez da mesma maneira. Ao final da última lavagem, coloque o tubo no gelo por dez minutos. Substitua então o PBS por 25 mililitros de PBS suplementado com 2 milimolares de EDTA, mantendo o tubo em um balde de gelo sobre uma plataforma oscilante por 45 minutos. Ao final da incubação, deixe as tiras de tecido sedimentarem no fundo do tubo e substitua o PBS-EDTA por 10 mililitros de PBS suplementado com 10% de FBS. Agite vigorosamente o tubo manualmente dez vezes. Deixe então o tecido sedimentar no fundo do tubo e transfira o sobrenadante para um tubo cônico de 15 mililitros rotulado como Fração 1. Agite o tecido em PBS com FBS mais cinco vezes, transferindo o sobrenadante para um novo tubo de fração a cada vez. Após a última agitação, centrifugue todas as amostras e ressuspenda os pellets em cinco mililitros de DMEM/F12 pré-aquecido sem fatores de crescimento adicionados. Em seguida, centrifugue novamente as amostras e aspire quatro mililitros do sobrenadante de cada tubo. Ressuspenda os pellets no último mililitro do meio remanescente e use alíquotas de 20 microlitros de cada fração para visualizar as criptas e os detritos em lâminas de vidro. Após reunir as frações apropriadas para obter a maior proporção possível de criptas em relação aos detritos, centrifugue as frações reunidas e aspire todo o sobrenadante, exceto os últimos 50-100 microlitros. Mantendo os tubos no gelo, adicione 1 mililitro de matriz proteica às frações reunidas, pipetando suavemente para cima e para baixo para evitar a introdução de bolhas de ar. Em seguida, adicione 50 microlitros da suspensão de matriz proteica/criptas ao centro de cada poço de 37
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Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo para colher, manter e tratar organoides do intestino delgado de camundongo com padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) e Listeria monocytogenes. Destaca a expressão gênica e as técnicas adequadas de normalização para análise proteica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Microbiologia
- Biologia Celular
Contexto
- Organoides intestinais delgados de camundongo são valiosos para o estudo da biologia intestinal.
- Padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) desempenham um papel nas respostas imunes.
- Compreender a expressão gênica é crucial para interpretar os resultados experimentais.
- Técnicas de normalização são essenciais para uma análise precisa de proteínas.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para o trabalho com organoides do intestino delgado de camundongo.
- Explorar os efeitos de PAMPs e Listeria monocytogenes sobre esses organoides.
- Destacar a importância da análise e normalização da expressão gênica.
Métodos Utilizados
- Coleta de organoides do intestino delgado de camundongos.
- Manutenção de culturas de organoides em condições específicas.
- Tratamento de organoides com PAMPs e Listeria monocytogenes.
- Análise de técnicas de expressão gênica e normalização de proteínas.
Resultados Principais
- Conseguiu-se a manutenção e tratamento bem-sucedidos de organoides.
- Foram observadas alterações na expressão gênica após o tratamento.
- Técnicas de normalização melhoraram a precisão da análise de proteínas.
- O protocolo pode ser aplicado a diversos estudos envolvendo biologia intestinal.
Conclusões
- O protocolo descrito é eficaz para o estudo de organoides intestinais.
- Os PAMPs e a Listeria monocytogenes impactam significativamente a expressão gênica.
- Técnicas adequadas de normalização são essenciais para resultados confiáveis.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Organoides intestinais de camundongo ex vivo fornecem um sistema fisiologicamente relevante para investigar interações entre hospedeiro e patógeno e sinalização imune inata em tecidos mucosos. A ênfase do protocolo na normalização em relação ao número total de células aborda um desafio crítico na geração de dados quantitativos e reprodutíveis a partir de culturas heterogêneas de organoides. Essa capacidade sustenta a confiança preditiva no descobrimento inicial e na validação de alvos para programas terapêuticos voltados à imunologia e ao microbioma.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação mecanicista de vias de receptores de reconhecimento de padrão em contextos epiteliais primários.
- Auxilia na desmistificação biológica ao modelar interações complexas entre hospedeiro e patógeno ex vivo.
- Facilita a validação funcional de alvos para moduladores da imunidade inata.
- Aprimora a confiança preditiva para o avanço de ativos em imunologia.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara sistemas de organoides validados para triagem subsequente de compostos imunomoduladores.
- Aborda a padronização e reprodutibilidade do ensaio por meio de técnicas rigorosas de normalização.
- Permite a medição quantitativa de proteínas secretadas, apoiando a avaliação confiável de compostos.
- Oferece escalabilidade e reutilização da plataforma em diversos programas de descoberta.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se à biologia mucosa relevante para doenças, permitindo a exploração translacional de biomarcadores.
- Oferece continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica em estudos de função imunológica e de barreira.
- Reduz os riscos nas decisões de avanço ao modelar respostas epiteliais fisiologicamente relevantes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo integra-se ao continuum de descoberta, desde a testagem inicial de hipóteses até a identificação de compostos líderes e a validação pré-clínica em programas de imunologia mucosal e interação hospedeiro-microbio.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre sinalização imune inata e mecanismos de interação entre hospedeiro e patógeno.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas reprodutíveis para análise de proteínas secretadas em ensaios com organoides.
- Análises: Permite a normalização em relação ao número total de células, melhorando a comparabilidade entre condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro à biologia mucosal in vivo para alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho baseado em organoides reutilizável para portfólios de P&D em imunologia e microbioma.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza a normalização e a quantificação em sistemas complexos de organoides.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de avançar/não avançar e o progresso eficiente em termos de capital da carteira de projetos.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco de ativos em imunologia e microbioma.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de organoides e biologia epitelial.
- Exige acesso a equipamentos especializados de cultura de tecidos e quantificação de proteínas.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de normalização e análises.
- Pode exigir adaptação para diferentes tipos de organoides ou modelos de doenças.
- A heterogeneidade no crescimento dos organoides e na composição da matriz pode afetar a reprodutibilidade do ensaio.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
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Mus musculus Small Intestinal Crypt Harvest
3:57
Organoid Plating for Pathogen Associated Molecular Patters (PAMP) and L. monocytogenes Challenge
6:58
Results: Representative Mouse Intestinal Organoid Culture and Stimulation
8:29
Conclusion
