Name: o Ex Vivo Cultura e Reconhecimento de Padrões Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organóides (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprenda a cultivar organoides intestinais de camundongo ex vivo e estimular com PAMPs e Listeria monocytogenes. Este protocolo detalha técnicas de normalização para análise precisa de proteínas secretadas.

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Os autores gostariam de agradecer à Dra. Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylan McDaniel e Bettina Heid pelas discussões técnicas. Os autores agradecem ao Dr. Nanda Nanthakumar por fornecer as células Caco-2. Os autores também agradecem ao Programa de Oportunidades Acadêmicas Multiculturais (MAOP) da Virginia Tech. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais K01DK092355 (para ICA). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A cultura e manutenção de Organóides intestinais é um procedimento que pode ser dominada por qualquer indivíduo com a técnica de cultura de tecidos adequados. Existem subtilezas em Passaging quando comparadas com células em crescimento em monocamada de um mais convencional, mas estes subtilezas não são difíceis de ultrapassar. Os passos críticos deste método envolvem ser capaz de crescer as Organóides a uma densidade suficientemente elevada para propagação óptima. As experiências devem ser escalados para baixo com Organ...

A capacidade de colher e Organóides cultura primária foram descritas para intestino delgado, cólon, pâncreas, fígado e cérebro e são avanços excitantes germano para entender um fenômeno mais fisiologicamente representante para a biologia do tecido 1-5. Os primeiros métodos que descrevem a cultura e manutenção de pequenas Organóides intestinal foi relatado por Sato et al. Para fora do laboratório de Hans Clevers 1. Antes deste método, e a colheita da cultura de células epiteliais intestinais primários mostrou-se limitado e ineficaz na sustentação do crescimento de células epiteliais. Os métodos incluíram dissociação de tecido através da incubação com enzimas, tais como a colagenase e dispase, o que em última instância conduzem à excrescência de células de fibroblastos primárias misturadas 6. Estas condições também ser limitada no tempo na manutenção da cultura de células epiteliais. Mínima para nenhum nicho de células epiteliais que formam, como as células epiteliais entraria apoptose devido àa falta de factores de crescimento adequados ou perda de integridade de contacto, denominado anokis 7. O advento do sistema de cultura 3D-organï¿½de tem proporcionado um método para células intestinais primárias de cultura contendo um espectro de tipos de células intestinais em cultura sustentada 1. Estes Organóides epiteliais tem vantagens em relação a linhas de células, sendo que elas são compostas por várias células diferenciadas, e melhor imitar o órgão de que são derivados a partir de 8 in vivo. O processo para, finalmente, &quot;crescer um mini intestino em um prato de&quot; provou ser uma ferramenta valiosa para a avaliação da resposta do epitélio intestinal, sob diferentes estímulos. Investigar a interacção de células intestinais primárias com padrões moleculares de agentes patogénicos microbianos associados (PAMPs) é relevante para o campo da imunologia como estes padrões moleculares pode regular diversas respostas de cada máquina e micróbio 9. Não só pode investigadores agora explorar estas interações com Organóides rato, mas elespodem ser cultivadas a partir de seres humanos bem como dois. Esta tecnologia tem o potencial de alterar drasticamente a medicina personalizada e é tentador especular sobre os avanços que esta técnica vai tornar possível no futuro próximo. O objectivo geral do presente método é o de proporcionar um protocolo para a cultura, a expansão, e no tratamento de Organóides intestinais com uma variedade de estímulos. Tais estímulos podem, em última análise variam de vacinas, PAMPs bacterianos, patógenos vivos, gastrintestinal (GI) e cancro terapêutica. O isolamento e cultura de rato Organóides intestinais foi adaptado de Sato et al. Embora existam pequenos desvios do método original, o produto final sendo organï¿½de cultura ainda é alcançada quando seguindo este protocolo. Este método é focado em descrever uma técnica adequada para a normalização adequada quando se trabalha com estruturas celulares não homogéneos, que devem ser levados em consideração na condução de um ensaio baseado em células number.

<table><tbody><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td> <td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050</td> <td>(Seção 1,3,6) Ou marca equivalente</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td><td>Thermo</td><td></td> <td>(Seção 1,3)</td></tr> <tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare</td><td>Sh30243.01</td> <td>(Seção 1,6) Para células Caco-2 e HEK293 Rspondin1</td></tr><tr><td>HEK293T-Rspondin1 secretora de linha</td><td></td><td></td> <td>celular(Seção 1) Descrito e modificado de Kim, K.A. et al. Partículas lentivirais continham RSPO1(NM_138683) ORF cDNA clonado em um backbone pReceiver-Lv105 encomendado e comprado da GeneCopoeia.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo cônico de 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>(Seção 1) Ou marca equivalente</td></tr><tr><td>T-175 Flask</td><td>Corning</td><td>431079</td><td>(Seção 1) Ou marca equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Matriz de Proteína</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>(Seção 2,3,4,5,6) Fator de Crescimento Matrigel Reduzido&nbsp;</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's (DPBS)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30264.01</td><td>(Seção 2,3)</td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td>(Seção 2,3) Placas TC de 24 Poços Corning DMEM/F12 Avançadas</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>3524</td><td>(Seção 2)</td></tr><tr><td>N2 Suplemento 100x&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>(Seção 2)</td></tr><tr><td>B27 sem vitamina A 50x&nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida</td><td>12587-010&nbsp;</td><td>(Seção 2)</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>(Seção 2)</td></tr><tr><td>Suplemento de Glutamina (Glutamax)</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>(Seção 2) Pode Combinar com DMEM/ F12 HEPES Avançado</td></tr><tr><td>(1 M)</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>(Seção 2) Pode Combinar com DMEM/ F12 Avançado&nbsp;</td></tr><tr><td>10ml de Pipeta Sorológica</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td>(Seção 2) Ou marca equivalente</td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>(Seção 2) Estoque = 100 mg/ml</td></tr><tr><td>N-Acetil-L-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>(Seção 2) Estoque = 1M</td></tr><tr><td>Camundongo Recombinante EGF</td><td>Biolegend</td><td>585608</td><td>(Seção 2) Estoque = 500 mg/ml</td></tr><tr><td>Rocker Variable</td><td>Bioexpres</td><td></td><td>(Seção 3)</td></tr><tr>tesoura <td></td><td></td><td>de dissecação</td><td>(Seção 3)</td></tr><tr><td>fórceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td>(Seção 3)<td>lâminas de vidro</td><td>(Seção 3)</td></tr><tr><td>pinças</td><td></td><td></td> de dissecação<td>(Seção 3)</td></tr><tr><td>25 ml Pipeta Sorológica</td><td>Falcão</td><td></td><td>(Seção 3)</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9821</td> <td>(Seção 3) 0,5 M ou placa de Petri estéril EDTA de grau TC alternativo</td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td> <td>(Seção 3) Ou prato TC de tamanho igual</td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td> <td>(Seção 4)</td></tr> <tr><td>Agulha de deslizamento de precisão</td><td>Becton Dickinson</td><td>305120</td> <td>(Seção 4) 23G x 1 1/4 (0,6 mm x 30 mm)</td></tr> <tr><td>Flagelina de Bacillus subtilis</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-bsfla&nbsp;</td><td>(Seção 5,6)</td></tr><tr><td>Listeria monocytogenes</td><td>ATCC</td><td>19115</td><td>(Seção 5,6)&nbsp;( Murray&nbsp; et&nbsp;al.)&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629-1EA</td> <td>(Seção 5,6) Ou marca equivalente</td></tr><tr><td>BBL Brain Heart Infusion Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>211065</td> <td>(Seção 5)</td></tr> <tr><td>Bacto Brain Heart Infusion</td><td>Becton Dickinson</td><td>237500</td> <td>(Seção 5)</td></tr> <tr><td>Caco-2</td><td>ATCC</td><td>HTB-37</td> <td>(Seção 6)</td></tr> <tr><td>Tripsina&nbsp;</td><td>gibco</td><td>25200056</td> <td>(seção 6)</td></tr> <tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td> <td>(Seção 6)</td></tr> <tr><td>Dispositivos</td><td></td> <td>SpectraMax M5</td> Molecuar <td>(Seção 6)</td></tr> <tr><td>96 Placa de Ensaio de Poço</td><td>Corning</td><td>3603</td> <td>(Seção 6) Placa Preta, Fundo Transparente TC tratado</td></tr><tr><td>Corante Nuclear</td><td>Life</td> Technologies <td>H1399</td> <td>(seção 6) Hoechst 33342</td></tr><tr><td>T-75 Frasco</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>(Seção 6) Ou marca equivalente</td></tr><tr>tubo<td>cônico de 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>(Seção1,3) Ou marca equivalente</td></tr><tr><td>tubo de polipropileno de 1,7 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td>Ou marca equivalente</td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep</td><td>Zymo Research</td><td>R1054</td><td>Ou marca equivalente</td></tr><tr><td>TNF-alpha&nbsp;</td>Kit de ensaio de expressão gênica Applied <td>Biosystems</td><td>Mm 00443260_g1</td><td>Taqman</td></tr><tr><td>IL-6&nbsp;</td>Kit de ensaio de expressão gênica <td>Applied Biosystems</td> <td>(Mm 00446190_m1</td><td>Taqman</td></tr><tr><td>IL-1beta</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00434228_m1</td><td>Kit de ensaio de expressão gênica Taqman</td></tr><tr><td>IL-18</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00434225_m1</td><td>Kit de ensaio de expressão gênica Taqman</td></tr><tr><td>18s</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs 99999901_s1</td><td>Kit de ensaio de expressão gênica Taqman</td></tr><tr><td>7500 Sistema de PCR em tempo real rápido</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nexus gradient Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix</td><td>Kit de</td><td></td> Transcrição Reversa de cDNA de Alta Capacidade 4352042 <td></td>Life</tr><tr><td></td><td>Technologies/Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Reação Óptica Rápida de 96 Poços, 0,1 mL</td><td>Life Technologies/Applied Biosystems</td><td></td><td></td>4346907</tr><tr><td>R-Espondina 1 de Proteína Recombinante de Camundongo R</td><td>& D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>500 ng/ml</td></tr><tr><td>clorofórmio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7559</td><td></td></tr></tbody></table>

o<em&gt; ex vivo</em&gt; cultura e reconhecimento de padrões receptor stimulation of mouse intestinal organóides

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Organóides intestinais primárias são um sistema modelo valioso que tem o potencial para impactar significativamente o campo da imunologia da mucosa. No entanto, as complexidades das características de crescimento organï¿½de realizar ressalvas significativas para o investigador. Especificamente, os padrões de crescimento de cada organï¿½de indivíduo são altamente variáveis ​​e criar uma população heterogénea de células epiteliais em cultura. Com estas advertências, práticas de cultura de tecido comum não pode ser simplesmente aplicada ao sistema organï¿½de devido à complexidade da estrutura celular. Contando e revestimento com base exclusivamente no número de células, o que é comum para as células separadas individualmente, como as linhas de células, não é um método fiável para Organóides a menos que alguma técnica de normalização é aplicada. Normalizando para o conteúdo de proteína total é feita complexa devido à matriz proteica residente. Essas características, em termos de número de células, forma e tipo de célula devem ser levados em consideração ao avaliar con secretadatendas de massa organï¿½de. Este protocolo foi gerado para delinear um procedimento simples para a cultura e tratar pequenos Organóides intestinais com patógenos microbianos e padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs). Ele também enfatiza as técnicas de normalização que deve ser aplicado quando a análise de proteínas são conduzidas depois de um tal desafio.

Ao seguir este protocolo para cultivar Organóides intestinais, em forma de esfera Organóides características estarão presentes após a colheita. A adição dos meios de comunicação R-spondin1 condicionado diária irá iniciar o crescimento e brotação das Organóides. O crescimento de Organóides é mostrado na Figura 1A - F, e é representante de Organóides intestinais nos dias 1, 2, 4, 5, 6 e dia 14. A Figura 1F representa as ca...

Aqui, um protocolo para a colheita, manter, e tratar rato pequenas Organóides intestinais com padrões de agentes patogénicos associados moleculares (PAMPs) e Listeria monocytogenes é descrito, bem como a ênfase na expressão de genes e técnicas de normalização adequada para a proteína.

o<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Reconhecimento de Padrões Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organóides

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

O objetivo geral deste procedimento é medir os efeitos do desafio patogênico em organoides do intestino delgado, com ênfase em técnicas de normalização em relação ao número total de células. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de imunologia inata e mucosal, fornecendo um meio para investigar in vitro as interações entre patógenos e células epiteliais intestinais. Essencial para este procedimento é o método de normalização em relação ao número total de células, uma necessidade ao medir proteínas secretadas por organoides por meio de técnicas como ELISA. Para colher criptas intestinais de camundongos para cultura de organoides, comece usando uma lâmina de vidro estéril para remover suavemente as vilosidades da superfície luminal do intestino delgado. Em seguida, use tesoura de dissecação para cortar o tecido em tiras de 1-2 centímetros de comprimento. Coloque as tiras em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 mililitros de PBS gelado. Misture o conteúdo por inversão suave e deixe o material tecidual sedimentar no fundo do tubo. Em seguida, aspire o PBS e lave as tiras mais três vezes com 10 mililitros de PBS fresco, cada vez da mesma maneira. Ao final da última lavagem, coloque o tubo no gelo por dez minutos. Substitua então o PBS por 25 mililitros de PBS suplementado com 2 milimolares de EDTA, mantendo o tubo em um balde de gelo sobre uma plataforma oscilante por 45 minutos. Ao final da incubação, deixe as tiras de tecido sedimentarem no fundo do tubo e substitua o PBS-EDTA por 10 mililitros de PBS suplementado com 10% de FBS. Agite vigorosamente o tubo manualmente dez vezes. Deixe então o tecido sedimentar no fundo do tubo e transfira o sobrenadante para um tubo cônico de 15 mililitros rotulado como Fração 1. Agite o tecido em PBS com FBS mais cinco vezes, transferindo o sobrenadante para um novo tubo de fração a cada vez. Após a última agitação, centrifugue todas as amostras e ressuspenda os pellets em cinco mililitros de DMEM/F12 pré-aquecido sem fatores de crescimento adicionados. Em seguida, centrifugue novamente as amostras e aspire quatro mililitros do sobrenadante de cada tubo. Ressuspenda os pellets no último mililitro do meio remanescente e use alíquotas de 20 microlitros de cada fração para visualizar as criptas e os detritos em lâminas de vidro. Após reunir as frações apropriadas para obter a maior proporção possível de criptas em relação aos detritos, centrifugue as frações reunidas e aspire todo o sobrenadante, exceto os últimos 50-100 microlitros. Mantendo os tubos no gelo, adicione 1 mililitro de matriz proteica às frações reunidas, pipetando suavemente para cima e para baixo para evitar a introdução de bolhas de ar. Em seguida, adicione 50 microlitros da suspensão de matriz proteica/criptas ao centro de cada poço de 37

the-ex-vivo-culture-pattern-recognition-receptor-stimulation-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

Um método simples para determinar murino organóide tumor de cólon primário é descrito. Este método utiliza o recurso de que as células tumorais de cólon sobreviver e crescer em Organóides em meios contendo fatores de crescimento limitadas, enquanto cólon normais do epitélio não.

Em organoide Cultura in vitro de primário do mouse tumores do cólon

A tecnologia de imagem aprimorada está permitindo imagens tridimensionais de órgãos durante o desenvolvimento. Aqui descrevemos todo um sistema de cultura de órgãos que permite imagens ao vivo das vilosidades em desenvolvimento no intestino fetal de camundongo.

Rato Fetal Whole Intestino Sistema de Cultura para Ex Vivo Manipulação de vias de sinalização e tridimensional Imagens ao vivo de Desenvolvimento Villus

Pequenas Organóides cripta intestinal cultivadas ex vivo, proporcionam um sistema de cultura de tecidos que recapitula o crescimento das criptas dependentes de células-tronco e seu nicho. Foi estabelecido um método para ensaiar o perfil metabólico em tempo real em Organóides das criptas do rato primária. Encontramos Organóides manter as propriedades fisiológicas definidas por sua origem.

Tempo real Análise do Perfil metabólico em Ex Vivo Culturas mouse Intestinal Crypt organóide

Neste protocolo de vídeo, damos uma explicação passo a passo da transdução lentiviral em organoides do epitélio intestinal primário e do processamento e análise a jusante dessas culturas por RT-PCR quantitativo, RNA-microarray e imuno-histoquímica.

Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides

A cultura de órgãos ex vivo permite a investigação de processos biológicos no contexto da arquitetura do tecido intacto. Aqui, apresentamos um método de cultura ex vivo do cólon de camundongos, que pode ser usado para estudar a imunidade inata e a defesa antimicrobiana do hospedeiro no intestino.

o<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Órgão Cultura Colon e seu uso em Antimicrobial host Estudos de Defesa

Este artigo apresenta um método único para analisar as interações hospedeiro-microbioma usando um novo sistema de cultura de órgãos intestinais para experimentos ex vivo.

Um sistema de cultura de órgãos intestinais para analisar interações hospedeira-microbiota

Este protocolo oferece instruções detalhadas para estabelecer organoides do intestino delgado murine, isolar células linfoides tipo 1 da lamina propria do intestino delgado murina e estabelecer coculturas tridimensionais (3D) entre ambos os tipos de células para estudar interações bidirecionais entre células epiteliais intestinais e células linfoides inatas tipo 1.

Co-Cultura de Organoides Epiteliais do Intestino Delgado Murine com Células Linfoides Inatas

O presente protocolo descreve o estabelecimento de um sistema organoide colônico murino para estudar a atividade e o funcionamento das células-tronco colônicas em um modelo knockout de claudina-7.

Cultura tridimensional de criptas colônicas murinas para estudar a função das células-tronco intestinais ex vivo

Descrevemos um protocolo para isolar criptas murinas do intestino delgado e cultura de organoides intestinais 3D das criptas. Adicionalmente, descrevemos um método para gerar organoides a partir de uma única célula-tronco intestinal na ausência de um nicho celular subepitelial.

A Cultura 3D de Organoides de Criptas Intestinais Murinas e uma Única Célula-Tronco para Pesquisa de Organoides

Aprenda a cultivar organoides intestinais de camundongo ex vivo e estimular com PAMPs e Listeria monocytogenes. Este protocolo detalha técnicas de normalização para análise precisa de proteínas secretadas.

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