o Ex Vivo Cultura e Reconhecimento de Padrões Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organóides

O objetivo geral deste procedimento é medir os efeitos do desafio patogênico nos organoides do intestino delgado, com ênfase nas técnicas de normalização em relação ao número total de células. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos de imunologia inata e mucosa, fornecendo um meio de investigar as interações do patógeno hospedeiro de bactérias com células epiteliais intestinais in vitro. Essencial para este procedimento é o método de normalização em relação ao número total de células, uma necessidade ao medir proteínas secretadas por organoides por meio de técnicas como ELISA.To colher criptas do intestino delgado de camundongos para cultura organoide, comece usando uma lâmina de vidro estéril para raspar suavemente as vilosidades da superfície luminal do intestino delgado. Em seguida, use uma tesoura de dissecação para cortar o tecido em tiras de 1-2 centímetros de comprimento. E coloque as tiras em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 mililitros de PBS gelado. Misture o conteúdo por inversão suave e deixe o conteúdo do tecido assentar no fundo do tubo. Em seguida, aspire o PBS e lave as tiras mais três vezes em 10 mililitros de PBS fresco, cada vez da mesma maneira. No final da lavagem final, coloque o tubo no gelo por dez minutos. Em seguida, substitua o PBS por 25 mililitros de PBS suplementado com 2 milimolares de EDTA, em um balde de gelo em uma plataforma de balanço por 45 minutos. No final da incubação, deixe as tiras de tecido assentarem no fundo do tubo e substitua o PBS-EDTA por 10 mililitros de PBS suplementado com 10% de FBS. Agite o tubo vigorosamente com a mão dez vezes. Em seguida, deixe o tecido assentar no fundo do tubo e transfira o sobrenadante para um tubo cônico de 15 mililitros rotulado, Fração 1.Agite os tecidos em PBS FBS mais cinco vezes. Transferir o sobrenadante para um novo tubo fracionado a cada vez. Após a última agitação, centrifugar todas as amostras e ressuspender os pellets em cinco mililitros de DMEM/F12 pré-aquecido sem adição de fatores de crescimento. Agora, gire as amostras novamente e aspire quatro mililitros do sobrenadante de cada tubo. Ressuspenda os grânulos no último mililitro do meio restante e use alíquotas de 20 microlitros de cada fração para visualizar as criptas e os detritos nas lâminas de vidro. Depois de agrupar as frações apropriadas para atingir a maior porcentagem de proporção de cripta para detritos, centrifugue as frações agrupadas e aspire todos, exceto os últimos 50-100 microlitros dos sobrenadantes. Mantendo os tubos no gelo, adicione 1 mililitro de matriz proteica às frações agrupadas, pipetando para cima e para baixo lentamente para evitar a adição de bolhas de ar. Em seguida, adicione 50 microlitros da matriz proteica / suspensão de cripta no meio de cada poço de 37